Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921, P51 OD011092 (AVM); פרס 14PRE20320014 של איגוד הלב אמריקה (SB).

הערה: כל ההליכים המתוארים פרוטוקול זה צריך להתבצע בתנאים BSL-2-
 1-KSHV מניות הכנה <ol><li>TNE להכין מאגר: להמיס מ"ג 292.24 EDTA ddH 2 O להביא עד 225 מ"ל, להתאים את ה-pH 8. להמיס 605.7 מ"ג טריס ddH 2 O, להביא עד 225 מ"ל, להתאים את ה-pH 8. שילוב פתרונות EDTA, טריס, להוסיף 4.38 g NaCl, להתאים את עוצמת הקול הסופי עד 500 מ"ל, לסנן לחטא, ולאחסן ב 4 ° C .</li>
	<li>תרבות את KSHV-חיובית, EBV-שלילי תפליט העיקרי לימפומה תא קו BCBL-1 בחממה humidified 37 ° C בתוספת 5% CO 2 ב- RPMI בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ו- antimicrobials 1 ל 1.2 x 10 6 תאים לכל mL-</li>
	<li>כדי לעודד ייצור KSHV, לפצל את תרבויות 1:2 בינונית טרייה להוסיף Phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) ריכוז סופי של 20 ng/mL, דגירה תרבויות במשך 5 ימים. כחלופה, יטפל בתאים עם butyrate נתרן (NaB; 0.1 מ מ) במשך 3 ימים לזירוז lytic שכפול ויראלי.</li>
	<li>הקציר נגיפים, תחילה centrifuge התרבות supernatant-300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר הצניפה התאים ולהעביר supernatants ל צינורות טריים.</li>
	צנטריפוגה <li>להבהיר עוד יותר את תגובת שיקוע כדי למנוע העברה של פסולת הסלולר, ב 2,500 g x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס 
	הערה: כחלופה במהירות גבוהה צנטריפוגה הבהרה של התרבות supernatants, סינון דרך 0.45 סטרילי מיקרומטר מסנן יכול להתבצע. הבחנו ירידה משמעותית כייל נוגדנים באמצעות סינון; לכן, אנחנו באופן שגרתי ביצוע השלב השני צנטריפוגה במקום.</li>
	<li>הבא, כיסוי 5 מ של 25% סוכרוז פתרון מאגר TNE עם 30 מ של התרבות מובהר supernatant 6 צינורות ultracentrifuge.</li>
	<li>צנטריפוגה מאוזנת צינורות ב 75,000 g x עבור 2 h ב 4 ° C תחת ואקום.</li>
	<li>Decant התרבות supernatant, כתם בקצה כל שפופרת להסיר כמה שיותר פתרון תגובת שיקוע וסוכרוז ככל האפשר ולאחר מכן resuspend בגדר וירוס, אשר עשוי לא להיות גלויות, ב- µL 150 מאגר TNE.</li>
	<li>בריכה כל resuspended וירוס, מערבבים היטב, ומקפיאים aliquots 25 µL ב-80 מעלות צלזיוס .</li>
</ol> 2. התמרה חושית של EC E6, E7 וירוס הפפילומה גנים הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי תרביות רקמה סטנדרטי מבחנות לגידול העיקרי לכלכלת עם זאת, אם צמיחה משביעת רצון של EC מתקבלים ואז השימוש של תרבות מסחרית מבחנות לשקול.
<ol><li>תרבות ראשי האדם עורי microvascular או הלימפה EC ב חממה humidified 37 ° C בתוספת 5% CO 2 ב- EC מדיום הגידול (EGM; מכיל EC הבזליים בינוני [EBM] בתוספת BulletKit EGM-2 [המכיל FBS, הידרוקורטיזון האנושי פיברובלסט גורם גדילה-B, כלי הדם גורם הגדילה EC, פקטורי גדילה דמויי אינסולין-1, חומצה אסקורבית, גורם הגדילה האפיתל אנוש, אנטיביוטיקה, הפארין]) בבקבוקון תרבות תא T75 עד כ 50% הנהרות.</li>
	<li>עבור התמרה חושית, תרבות PA317 LXSN 16E6E7 תאים 24 , 35 חממה humidified על 37 ° C פלוס 5% CO 2 ב- DMEM בתוספת 10% FBS ו antimicrobials ב T150 הבקבוק של התרבות התא עד כ- 90% confluent. ואז דגירה בין לילה ב- mL 16 בינוני.</li>
	<li>להבהיר את המדיום PA317 על ידי צריך שתוציאו על 300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את EGM EC התרבות התאים וכיסוי 12 מ של המדיום PA317 שקופה ולאחר תקופת דגירה של 4 h. 
	הערה: צריך שתוציאו 16 מ"ל של מדיום ממוזגים ב g x 300 לתוצאות 5 דקות בגלולה קומפקטי זה לא מופרעת על ידי הסרת עוקבות זהיר 12 מ של תגובת שיקוע שקופה. עם זאת, אם העברת תאי 16E6E7 PA317 LXSN לתרבויות EC הראשי דאגה (הקו תא אריזה במהירות נגמלים EC), ואז סינון של תגובת שיקוע ממוזגים דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לפני העברת יכול להתבצע.</li>
	<li>להחליף 6 מ של המדיום PA317 EGM טריים, דגירה בין לילה.</li>
	<li>Refeed EC 12 מ ל EGM טריים דגירה של ה 48 נוסף</li>
	<li>תת תרבות EC, הסר בינוני, לשטוף עם 12 מ של PBS ללא קטיונים, ולא להוסיף 3 מיליליטר דיסוציאציה אנזימטי מסחרי פתרון (למשל, TrypLE) מאת ולהעביר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות</li>
	<li>תא ההשעיה להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה-g 300 x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend בגדר התא שנוצר ב- EGM טריים, לחלק באופן שווה 3 מבחנות x T75 עם נפח סופי של 12 מ ל EGM לכל הבקבוקון.</li>
	<li>כדי לבחור עבור EC transduced עם E6, E7, להוסיף G418 ריכוז הסופי של µg/mL 200 עבור שני קטעים, אחרי אשר transduced EC יכול להיות מצופה זיהום או קפוא חנקן נוזלי.</li>
</ol> 3. זיהום של Transduced EC עם KSHV <ol><li>ביום לפני זיהום הקציר EC על ידי עיכול אנזימטי באמצעות הפתרון דיסוציאציה אנזימטי מסחרי כפי שתואר לעיל. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של EGM. השתמש µL 5 תאים כדי להכין לדילול 1/10 ב- Trypan blue. לספור תאים חיים באמצעות hemocytometer ואת הזרעים 2.5 x 10 תאים חיים 5 ב- 2 מ של EGM לכל טוב ב 6 צלחות טוב.</li>
	<li>ביום של זיהום, להסיר EGM, לשטוף תאים עם 3 מ"ל של PBS עם סידן ומגנזיום לכל טוב, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל EBM. 
	הערה: זה חיוני כדי להשתמש EBM ולא EGM במהלך זיהום, כמו ההפרין ב EGM ימנע קשירה של חלקיקי נגיפי ולדלקת עוקבות של יעד לכלכלת</li>
	<li>להדביק תאים עם KSHV, להוסיף 5 עד 20 µL וירוס מלאי כל טוב ו מערבולת הצלחת לערבב. עבור תאים הנגועים ואימץ להוסיף אמצעי שווה מאגר TNE כל טוב.</li>
	<li>צנטריפוגה צלחות ב g x 400 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות</li>
	<li>אם המטרה של המחקר היא לחקור בתחילת האירועים הדורשים סינכרונית זיהום נגיפי, למשל, בתחילת האירועים דה נובו זיהום, להסיר את inoculum ויראלי בשלב זה. . שטפי וחזרי refeed התאים עם 2 מ"ל EGM טריים. אחרת, להוסיף 2 מ"ל EGM, דגירה תרבויות בין לילה.</li>
	<li>Refeed תאים עם 2 מ"ל EGM היום לאחר זיהום, אז בכל יום אחר.</li>
	<li>כאשר התאים נמצאים כ 90% confluent, הקציר על ידי עיכול אנזימטי באמצעות פתרון מסחרי דיסוציאציה אנזימטי כמתואר לעיל, ולאחר מכן בריכה התאים משלוש בארות לתוך T75, וציין את המספר הכולל מעבר והן את המעבר לאחר הפגיעה-</li>
	<li>הרחב מוק - ו KSHV-נגוע EC פיצולים 1:3 לפחות שני מעברים יותר ובו בזמן תאים שניתן להשתמש בניסויים או קפוא חנקן נוזלי. 
	הערה: כמו עם פיצול של EC transduced עם E6, E7, תחזוקה תרבויות ואימץ ו- KSHV-תאים הנגועים צריכים להתחלק לפני שהגיע למפגש (~ 85 עד 90%).</li></ol>
 4. זיהום המאשר עם KSHV מאת Immunofluorescence הערה: זיהוי KSHV השהיה-הקשורים גרעיני אנטיגן (לאנה-1/ORF73) מספק מדד כמותי אמין של זיהום. נוגדנים אנטי-לאנה זמינים מסחרית.
<ol><li>ביום שלפני מכתים, הצלחת שתי בארות אחד עם מעושה או KSHV-נגוע EC על צלחת 24-ובכן-עונה 1 פרק 10 5 תאים לכל טוב ב- 1 מ ל EGM ואני דגירה בין לילה.</li>
	µL <li>תאים לשטוף פעמיים עם 500 של PBS בתוספת סידן, magniseum. כביסה ב-30 s על פלטפורמה נדנדה.</li>
	<li>בשכונה fume מבחוץ-ventillated ', לתקן תאים עם 500 µL של 4% paraformaldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף (0.1% טריטון X-100 בתוספת 0.02% סרום עז PBS בתוספת קטיונים).</li>
	<li>לחסום תאים עם 500 µL של 2% נסיוב עז במאגר שטיפת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף.</li>
	<li>תווית באר אחת של מעושה או KSHV-נגוע EC עם 200 µL של נוגדן ראשוני מדולל 1:100 במאגר שטיפת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה. דגירה שתי הבארות הנותרים ב 200 µL מאגר לשטוף רק.</li>
	<li>לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף.</li>
	<li>תווית כל ארבע בארות עם 200 µL נוגדנים משניים מדולל בטחונות במאגר שטיפת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה.</li>
	<li>לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף.</li>
	<li>אל כל טוב החל µL 20 הגוברת דאפי המכילות בינוני ו- coverslip ולהעריך את מכתים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.</li>
	<li>לקבוע את הזיהום אחוז של תאים הנגועים KSHV על ידי ספירת מספר גרעינים לאנה-חיוביות בתאים לפחות 200. זיהום עם רקומביננטי KSHV-Bac16 ניתן לנטר גם דרך התבוננות של תרבויות להבעה של GFP.</li>
</ol>

Oncogenesis הוא תהליך רב שלבי העוקפות אמצעי חשוב בתוך האורגניזם36. כפי KS נגעים קיימים לאורך קשת של דלקת כרונית כדי סרקומות נכון, הבהרה של תהליכים מסוימים הקשורים pathophysiological מתווכת על-ידי KSHV דורש כי מחקרים להתנהל במודלים התרבות תאים התומכים טרנספורמציה9. יצוין כי אובדן קשר עיכוב וצמיחה תלויי-anchorage, פנוטיפים מעידה על שינוי הסלולר, אינם מפתחים בקלות בעקבות זיהום של ראשי EC או EC מונצחים על ידי ביטוי אקסוגני של טלומראז. לכן, בעוד המודל במבחנה של KS המתוארים כאן לא מסכם את הדברים בכל ההיבטים של microenvironment הגידול KS או ההתנהגות של תאים KS explanted, זה לצורכיכם ללמוד לשינויים ביטוי גנים של התא המארח הנגרמת על ידי זיהום עם KSHV שתורמים KS tumorigenesis.
הראשון דיווחו על ביטוי גנים פרופילים המחקר באמצעות מערכת תרבות המתוארים במסמך זה מזוהה קולטן טירוזין קינאז c-Kit בתור כותב פנוטיפ טרנספורמציה של תאים הנגועים KSHV25. להפיל את הביטוי c-Kit באמצעות siRNA או עיכוב של c-Kit איתות באמצעות דומיננטי שלילי לבנות או טירוזין קינאז מעכב STI 571 (Imatinib) הפריע היכולת להפוך של מניפסט KSHV על ידי אובדן של היווצרות foci לאחר שהוארך התרבות של תאים נגועים. הערכה קלינית עוקבות של Imatinib הוכיחה יעילות של תרופה זו בחולים עם מגיפת KS47,48,49. מטרות טיפול אפשריות אחרות גם זוהו, לרבות heme oxygenase-126,50, CXCR727את בטא קולטנים adrenergic28, אשר ממלאים תפקיד צמיחה או טרנספורמציה של EC במבחנה. אישור על דפוסים אלה ביטוי גנים וכן KS ביופסיה רקמות מאשרת את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של מערכת זו, מדגיש את הערך שלו כמודל קליניים עבור KS הרפוי25,26, ראשי EC 51,52,53,54,55.
כוח נוסף של מערכת התמרה חושית E6/E7 הוא אורך החיים מורחב של מונצחים לעומת ראשי EC מאפשרת קיום ארוכת טווח תאים מתאימים מעבר שליטה הנגועים ואימץ להערכה השוואתית של התוצאות של KSHV וגיל זיהום. חשוב לציין כי על מנת למקסם את מספר קטעים של EC transduced עם E6, E7 זה קריטי לפצל תרבויות לפני שהגיע למפגש (~ 85 עד 90%). יתר על כן, תאים אלה לסבול סרום ללא תנאי לתקופות ממושכות של זמן. EC ראשי במהירות עוברים מוות תאי מתוכנת על נסיגה פקטורי גדילה, ולכן לא ניתן בתרבית במשך פרקי זמן ארוכים ללא סרום או גורמי גדילה רקומביננטי56,57. תלות זו גורם autocrine איתות המסלולים הנגרמת על ידי זיהום עם KSHV קשה לזהות וללמוד, כמו לפני שינוי מלא תאים הנגועים KSHV גם עוברות מוות תאי מתוכנת על נסיגה פקטורי גדילה (לא פורסם התצפית). הנוכחות של החלבונים E6, E7 במודל זה, עם זאת, למנוע מוות תאי מתוכנת בעקבות הנסיגה פקטורי גדילה ולאפשר ממושך (למשל, 48 שעות) תרבות נמוכה בסרום או סרום חינם בינונית25,26 , 28.
KS היא מחלה מורכבת ובלתי רגיל עם תכונות של דלקת כרונית וטרנספורמציה הסלולר. הצורך קליני של אסטרטגיות טיפוליות הרומן הגדול, המודל התרבות התא המתוארים בזאת יש מאפיינים ייחודיים לאפשר הערכה של המועמד סמים מטרות.

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול רב נקודתית angioproliferative להשפיע על עורי, הרירית, אתרי הקרביים שמתפתח הנפוץ ביותר בסביבה של דיכוי המערכת החיסונית מתקדמים1. 4 טפסים אפידמיולוגיים תוארו: קלאסי, טופס indolent בדרך כלל משפיע על אנשים מבוגרים של הים התיכון והמזרח התיכון מורשת; iatrogenic, הנובע טיפול עם תרופות לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת איברים; מגיפה, סרטן איידס, הגדרת; מהם ייחודיים, טופס שאינו תלוי-HIV נפוץ אצל ילדים באזורים אנדמיים באפריקה. עם כניסתו של משטרי סמים אנטי-retroviral שילוב יעיל לטיפול ב- HIV, KS מגיפה מאובחנת הרבה פחות נפוץ במדינות מתפתחות. עם זאת, טפסים אנדמיים, מגיפה קלינית אגרסיבי נשארים בין הנפוץ ביותר סרטן שאובחנו רבים במדינות אפריקה2,3,4. לכן, זיהוי של תרופות ממוקדות פתוגנזה יעילות לטיפול KS היא עדיפות למחקר.
בהיסטולוגיה, KS נגעים מאופיינים כורוידאלית הנרחבים אך חריג לפיו פלך בתאים ממוצא EC בצורת רשתות כלי דם רציף5. אלה כלי נורמלי ("חרכי כלי הדם") לאפשר extravasation של אריתרוציטים, אשר נותנות נגעים הצבע האופייני שלהם. בנוסף, נגעים לכלול לויקוציטים רבות המאפיינות דלקת כרונית (קרי, לימפוציטים מקרופאגים, תאי פלזמה). רגרסיה של נגעים KS ביצוע שיחזור המערכת החיסונית שתיארנו, רומז כי KS יש תכונות של שניהם hyper-ציבוריות ו סרטניים נכון6,7,8,9.
KS ההרפס (KSHV), סוכן סיבתי של KS, זוהתה בשנת 199410. מאז ואז רבים במבחנה תרבית תאים פותחו מודלים כדי לאפשר פתוגנזה מחקרים, כולל תאים explanted מן הגידול ביופסיה חומר ראשוני או לבטא טלומראז EC נגוע KSHV במבחנה11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. אף אחד הדגמים זמין כעת באופן מלא recapitulates microenvironment הגידול של KS, אבל כולם תרמו ידע בעל ערך להבנתנו pathobiology של KSHV זיהום. שלא כמו אחרים הידועים tumorigenic ההרפס האנושי וירוס אפשטיין בר (EBV), KSHV לא בקלות להפוך תאים בתרבות בעקבות דה נובו זיהום19,20,21, 22. עם זאת, יש כבר להתגבר על מגבלה זו על-ידי transducing הראשית EC אנושי גם מעורב מוצא microvascular או הלימפה E6 ו- E7 גנים של וירוס הפפילומה האנושי 16 לפני זיהום עם KSHV23,24 . הביטוי של אלה oncogenes אקסוגני מגדיל באופן דרמטי את הפוטנציאל להפוך של KSHV במבחנה באופן חלקי על-ידי מתן עוד עיכוב של רטינובלסטומה חלבון ו- p5323,24. שיטה זו של התמרה חושית EC אפשרה מעבדות מרובים כדי לזהות שינויים מרכזיים של המארח ביטוי גנים תא זה הם המושרה על-ידי זיהום KSHV, המופיעים כדי להקל על KS תא הישרדות והתפשטות25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. הפרוטוקולים המפורטים להלן הן פשוטות וברורות מאוד לשחזור, יביא הדור של מתאימים לגיל המעבר EC הנגועים KSHV ופקדים הנגועים ואימץ יכול להיות תרבותי עבור הרבה יותר זמן ראשי תאים והאם לאפשר החקירה של מנגנונים oncogenic מועסק על ידי KSHV. למרות הפרוטוקול כולל שיטה לייצור פראי סוג KSHV מהקו הראשי תפליט לימפומה תא BCBL-1, EC E6/E7-מונצח גם הם רגישים מאוד זיהום עם BACmid רקומביננטי נגזר KSHV-BAC1630. פרוטוקולים עבור הכנת BAC16 מתוארים במקומות אחרים33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;Express, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS with calcium and magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול יוצא דופן המורכבת מתרבים פלך בתאים, הוא שיזם זיהום של תאי אנדותל (EC) עם KSHV, והוא מתפתח לרוב בסביבה של החיסוני. למרות עשורים של מחקר, הטיפול האופטימלי של KS נשאר גרוע מוגדרים, התוצאות הקליניות שלילי במיוחד הגדרות משאב מוגבל. נגעים KS מונעים על ידי אנגיוגנזה פתולוגי, דלקת כרונית, oncogenesis, במבחנה תא תרבות מודלים שונים פותחו כדי לחקור תהליכים אלו. KS נובע תאים הנגועים KSHV ממוצא אנדותל, כך EC-שושלת התאים מספקים המתאים ביותר במבחנה המחליפים למבשר התא כישור. עם זאת, כי EC יש תוחלת חיים מוגבלת במבחנה , כמו המנגנונים oncogenic מועסק על ידי KSHV יעילה פחות מאלה של וירוסים אחרים, tumorigenic, מתקשים להעריך תהליכי טרנספורמציה של ראשי או לכלכלת מונצחים טלומראז לכן, מודל תרבות המבוססת על EC הרומן פותחה שתומך ברצון מטרנספורמציה בעקבות זיהום עם KSHV. חוץ רחמי הביטוי של הגנים E6, E7 מסוג וירוס הפפילומה האנושי 16 מאפשר לתרבות מורחבת של מתאימים לגיל המעבר ואימץ ו- KSHV-נגוע EC ותומך הפיתוח של טרנספורמציה באמת (כלומר tumorigenic) פנוטיפ של תרביות תאים נגועים . מודל זה צייתן ולא מאוד לשחזור של KS הנחתה את הגילוי של כמה חיוני איתות המסלולים עם פוטנציאל גבוה לתרגום לתוך הגדרות קליניים.

המורפולוגיה של EC העיקרי מתואר בסגנון קלאסי "חלוק אבן", מורפולוגיה זו אינה משתנה על ידי ביטוי של וירוס הפפילומה E6, E7 גנים (איור 1 א'). הביטוי של הגנים E6, E7 לבד לא לגרום הפנוטיפ טרנספורמציה; לפיכך, התאים רגישים ליצור קשר עם עיכוב, תחדל חלוקת בהגיעם הנהרות בתרבות. התאים אולם להתרבות, ולצמיחה מחודשת אל הנהרות על trypsinization ועל replating על צפיפות נמוכה יותר, המאפשר קיום מתאימים לגיל המעבר תרבויות לשימוש כפקדי הנגועים מעושה.
זיהום של EC E6/E7-transduced עם KSHV גורם שינויים מורפולוגיים דרמטי בתרבות המזכירים פנוטיפ "פלך תא" הנהוגות KS נגעים (איור 1B). הפנוטיפ טרנספורמציה מושרה גם על זיהום עם KSHV, אשר באה לידי ביטוי בין השאר על ידי שיחרור קשר כאשר התאים נמצאים הנהרות שלאחר בתרבית (איור 1C) וצמיחה anchorage תלויית אגר רך (איור 2). אובדן של סימן דיכוי והן את התלות אינטראקציות מטריקס הסלולר במיוחד (מעגן) במהלך oncogenesis הם שני גולת הכותרת של טרנספורמציה הסלולר36. חשוב לשים לב כי EC הראשי גם רגישים לזיהומים עם KSHV, מערכות ראשיות EC היה מאוד יקר עבור שחקרתי מגוון תחומי האינטראקציה וירוס-מארח, ותוצאותיה. מחקרים כאלה הם מייצגים היטב בספרות, מספר דוגמאות מצוטטים בזאת37,38,39,40,41,42,43 ,44.
צביעת immunofluorescent מדגים כי המורפולוגיה פלך של תאים הנגועים KSHV קשורה לביטוי של החלבון הנגיפי לאנה-1/ORF73 (איור 3A ו- 3B, אדום). כמו הריכוז של וירוס במניות משתנים בין ההכנות, צריך ניתן להתאים את עוצמת הקול של וירוס נוסף לכל טוב כך תרבויות הנגועים KSHV להגיע &#62; 90% הזיהום קטעים אחד או שניים. עם המעבר טורי האחוז של זיהום ייגש 100%, יישמר למשך של התרבות (כ 20 מעברי). כמויות נמוכות של וירוס יכול לשמש אם מחקר השפעות paracrine מיועד, או אם תאים סמוכים נגוע הם רצויים כפקדי (למשל, עבור immunofluorescence מחקרים שכללו לחלבונים אחרים עניין). תרבויות נגוע תומכים גם ביטוי של חלבונים נגיפיים lytic, אבל, כפי נצפית בנגעים KS, רק מיעוט של תאים בתרבות יעבור באופן ספונטני lytic הפעלה מחדש (איור 3B, ירוק). תאים נגועים KSHV-BAC16, אשר מתויג עם GFP, גם לפתח מורפולוגיה פלך (3C איור ותלת מימד). כאשר נעשה שימוש KSHV-BAC16, titers ויראלי ניתן להשיג על ידי הדבקת תאים עם מלאי מדולל באופן סדרתי וירוס מרוכז והערכת תאים עבור ביטוי GFP זיהום פוסט 48 שעות באמצעות cytometry זרימה30.
רקומביננטי וגם WT וירוס, הגנום הנגיפי בהכנות מניות גם נמדד על ידי טיהור ה-DNA של תאים נגועים ואחריו PCR כימות של רמות ה-DNA KSHV; עם זאת, אחד אין להניח כי כל הגנום הן זיהומיות45. אם המחקר של מחזור lytic KSHV מיועד, וירוס הפעלה מחדש יכולה להיות מושגת על ידי עירור EC עם גרימת סוכנים כפי שמתואר לעיל עבור תאים BCBL-1, למרות היעילות של הפעלה מחדש הוא נמוך23. מחזור lytic יכולה להיגרם גם על ידי התמרה חושית של הנציבות האירופית עם החלבון transactivator KSHV ORF5046. בקנה אחד עם הממצאים במודלים תרבות אחרים תא של KS, ביטוי ספונטני והן אינדוקציה כימי של KSHV גנים lytic ב- EC E6/E7-הבעת ' ירידות לאורך זמן למרות תחזוקה דלקת סמויה יציב11,16 .
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig1.jpg"> 
איור 1: מורפולוגיה של מוק - ו -KSHV נגוע לכלכלת (א) בנספח monolayers EC הנגועים ואימץ חלוק קלאסי מראה האבן על-ידי שלב ניגודיות מיקרוסקופ חיוני. ללא הפעולות של KSHV גנים תאים אלה הופכים לא לכן חדל חלוקת, מוצג סימן דיכוי בהגיעם הנהרות בתרבות. תאים הנגועים KSHV (B), לעומת זאת, לפתח מורפולוגיה מוארך "פלך תא" מזכיר KS פלך בתאים. לוח זה מראה את המורפולוגיה של תאים הנגועים KSHV ביום 5 PI בהגיעם הנהרות. תאים הנגועים ב KSHV (C), מקיף שינויים בביטוי הגנים התא המארח להוביל טרנספורמציה הסלולר, אשר הופך בולט כאשר תאים הנגועים KSHV מתורבתים ללא מעבר. בתנאים כאלה, תאים הנגועים KSHV המשך מתרבים אפילו לאחר שהגיע למפגש המובילים להתפתחות של מוקדים מרובת שכבות של תאים. לוח זה מראה את המורפולוגיה של תאים הנגועים KSHV ביום 14 PI, תרבותי עבור זרימה לאחר 9 ימים. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig2.jpg"> 
איור 2: גידול עצמאי Anchorage. תאים untransformed עוברים בדרך כלל מוות של תאים אפופטוטיים להיפגע בעקבות אובדן קשר עם מצע, תהליך הנקרא anoikis. (א) transduced-E6/E7 כאשר הנגועים ואימץ EC, אשר לא הופכים, הושעו באגר רך, תרבותי במשך שבועיים שהם לא יוצרים מושבות. (B) נגוע KSHV EC, אשר הפך וירוס, הם עמידים בפני anoikis, יהוו מושבות אגר רך. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig3.jpg"> 
איור 3: הפגנה של ביטוי חלבון נגיפי. (א) המורפולוגיה פלך ניכרת בעקבות זיהום עם KSHV (40 X הגדלה). צביעת Immunofluorescent (B), של אותו שדה המוצג ב () מדגים כי המורפולוגיה פלך קשורה לביטוי של החלבון השהיה נגיפי ORF73 (אדום). גם, כפי שמתואר על ידי אחוז קטן של תאים המבטאים את pro ויראלי תאים נגועים תמיכה lytic שכפול ויראליcessivity פקטור ORF59 (ירוק). (A ו- B שונה מהפניה26.) המורפולוגיה פלך של תאים נגועים בווירוס KSHV-BAC16 (ג) מזוהה עם ביטוי של GFP (D) (20 X הגדלה). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול הנגרמת על ידי זיהום עם oncogenic וירוס ההרפס-8/KS ההרפס האנושי (HHV-8/KSHV). המודל התרבות תאי אנדותל המתואר כאן הוא לצורכיכם לימוד המנגנון שבאמצעותו KSHV המרות התאים המארחים.

מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K Views.  University of Minnesota Medical School. סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול הנגרמת על ידי זיהום עם oncogenic וירוס ההרפס-8/KS ההרפס האנושי (HHV-8/KSHV). המודל התרבות תאי אנדותל המתואר כאן הוא לצורכיכם לימוד המנגנון שבאמצעותו KSHV המרות התאים המארחים.

Video: An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

זיהוי גנים Dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Immunology and Infection

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

דגם גופיים Organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

Neuroscience

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Cancer Research

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

הדמיה ביולומינסנציה כפולה של התקדמות הגידול ואנגיוגנזה

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...