We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

Tüm deney prosedürleri Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı kurumsal hayvan komitesi tarafından onaylandı. 4 ay - Bu çalışma için, hematopoetik kök hücreler 2 yaşlı C57BL / 6 kendilenmiş farelerin kemik iliğinden izole edilmiştir. CD34 - - Ayırıcı stratejisi soy c-Kit, Sca-1 de dahil olmak üzere farklı yüzey makinesi BM&#39;nin lekelemeden sonra FACS ile tasnif Celi, Flt3 ve CD34 Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 göre HSC saflaştırılması için kullanılmıştır standart protokol önce 8 nitelendirdi. DİKKAT: Çeşitli son derece zehirli kimyasallar bu işlem sırasında kullanılır. Bunlar Solunduğunda ve cilt ile temasında toksiktir. eldiven ve koruyucu giysiler giymek edin. Bu kimyasallar ile çalışırken davlumbaz çalışın. 1. Hücreler, Fiksasyon, Boyama ve Pre-gömme <ol><li> Sca-1 - Lin kullanarak sırala 10.000 hematopoetik kök hücreler ( <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - stratejisini yolluk; ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde LT-HSC popülasyonu) 600 ul FACS kullanılarak,% 10 fetal bovin serumu içeren Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı (IMDM). </li><li> swing-out kova ile bir santrifüj kullanılarak 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 10 dakika süreyle 1000 xg&#39;de sıralı HKH&#39;lerin aşağı doğru döndürün. yavaşça çekilerek Ortamı çıkarın ve her adımda tüplerinde 200 ul ortam bırakın. Bu aşamada, hücre peleti boru içinde görünmez kalır. </li><li> 1 saat 1,9 oda sıcaklığında (RT) 2x sabitleyici çözeltisi, 0.2 ml hücreleri saptamak. <ol><li> Kullanmadan önce fiksatif çözüm taze olun. 1X çözelti, 0.1 M kakodilat tampon içinde% 3 paraformaldehit ve% 2.5 glutaraldehid oluşur. </li></ol></li><li> Santrifüj swing-out kova ile bir santrifüj kullanılarak 30 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 1000 xg&#39;de hücreleri. </li><li> 0.1 M kakodilat tampon 600 ul hücreleri yıkayınsantrifüj kullanılarak ve santrifüjlemeden sonra tüp içinde 200 ul tampon bırakın. </li><li> kakodilat tampon maddesi içinde Evans Mavisi 2 mg / ml solüsyon 200 ul ilave edilmesi suretiyle tespit hücreleri leke ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Hücreler mavi renkli olacak. </li><li> 0.1 M kakodilat tampon kullanarak santrifüj 600 ul hücreleri 3 kere yıkayın ve tüp içinde her zaman 200 ul tampon bırakın. </li><li> 200 ul tampon hücreleri yeniden askıya ve 0.5 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın. bir masa üstü santrifüj kullanılarak 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. yavaşça şimdi görünür küçük hücre pelet bozmadan tamponu çıkarın ve tüp içinde 50 ul tampon bırakın. </li><li> % 4 agaroz çözeltisi 15 ml tüp içinde 0.1 M kakodilat tampon maddesi, 5 ml agaroz 200 mg düşük erime ekleyin. 100 ml&#39;lik bir cam şişeye kaynar su tüpü aktararak agaroz eritin ve kullanılıncaya kadar ılık tutun. </li><li> % 4, erime noktası düşük, 200 ul 0.1 M agaroz cacodyla içinde çözüldü ekleHemen hücre 0.5 ml tüp içinde süspansiyon ve TE tamponu bir masa üstü santrifüj kullanılarak, 30 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Hücreler santrifüj işleminden sonra, yarı-katı bir agaroz 0.5 mi tüpün altındaki topak olduğu doğrulandıktan sonra, hemen agaroz katılaşmaya 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tüp ya da buz aktarın. Bu adım elektron mikroskobu altında hücrelerin iyi bir kümede bu adımı sonuçlarına küçük görünür hücre pelet olarak, bir çok önemlidir. </li><li> Dikkatlice 27 G iğne 3,10 kullanarak tampon içeren bir 35 mm plastik Petri kabı tüpten Hücre topaklarını içeren katılaşmış agaroz aktarın. </li><li> bir neşter ile 2 mm - yaklaşık 1 tek parça içine hücre pelet içeren katılaşmış agaroz Trim. yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe Hücre topaklarını içeren agaroz parça aktarın. </li><li> ekleme ve santrifüj olmadan pipet kullanarak tampon kaldırarak 0.1 M kakodilat tampon 600 ul kullanarak 3 kez - 2 yıkayın. Bir sonraki adım için hücre pelet içeren bu agaroz parça kullanın. Bu adımda, numune bir gece boyunca bir sonraki adıma geçmeden önce 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2. Osmification, Dehidrasyon, Gömme <ol><li> Hücre topağı bir pipet kullanılarak agaroz ihtiva eden 1.5 mi tüp kakodilat tamponu çıkarın. Bir çeker ocak içinde% 1 ozmiyum tetraoksit 1,0 ml (OsO 4) çözeltisi ekleyin ve 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 0.1 M kakodilat tamponu, 600 | il ile üç kere yıkanır ve bir kap ile 20 mL&#39;lik bir cam sintilasyon şişesine örnek aktarmak. </li><li> Dehidrasyon, infiltrasyon örnek işlenir ve reçine içine gömülü (örneğin, LX-112), bir 6 yuvalı plaka aşağıdaki çözümleri seri değişiklikleri. forseps kullanarak hücre pelet agaroz taşı. <ol><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 25 etanol içinde örnek bırakın. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 50 etanol içinde örnek bırakın. </li><li> % 75 örnek daldırın15 dakika boyunca oda sıcaklığında etanol. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 95 etanol içinde örnek bırakın. </li><li> iki kez, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 etanol içinde örnek bırakın. </li><li> etanol örnek daldırın: reçine (3: 1), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı. </li><li> etanol örnek daldırın: Reçine (1: 1), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı. </li><li> etanol örnek daldırın: Reçine (1: 3), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı. </li><li> iki kez, 60 dakika boyunca oda sıcaklığında saf reçine numune bırakın. </li></ol></li><li> dikkatle forseps kullanılarak piramit şekilli uç lastik kalıp tabanına örnek aktarın ve kalıp doldurmaya numunesinin tepesine daha fazla saf reçine ilave edin. Reçine polimerizasyonu için 72 saat boyunca 60 ° C &#39;de örnek inkübe edin. </li><li> lastik kalıp bükerek kalıplardan polimerize reçine piramit çıkarın. Daha önce 7 açıklandığı gibi hücrelerin küçük siyah küme, polimerize reçine piramit görünür olmalıdır. siyanoakrilat kullanarak montaj silindir üzerinde polimerize reçine piramit takın. </li></ol><ol><li> Bir jilet ve ultra-mikrotom bloğu monte edildikten sonra bir elmas bıçak ile piramit bloğu Trim. üst ve birbirine bloğu paralel alt kısa bir geniş trapezoid şekli olun ve eşit açılı kenarları. Piramidin Bu şekil seri kesit için yardımcı olur. </li><li> Ayrıca, elmas bıçak ile hücre pelet etrafında blok kırpın ve hücre pelet agaroz parçası etrafında plastik bölümleri kaldırın. </li><li> ultra-mikrotom kullanılarak 1 um kesitler halinde kesilmiştir. Bir kirpik aracı ve daha önce 7 rapor gibi bir metal döngü aracını kullanarak bir bardak slayt su tekne 1 mikron bölümleri taşıyın. Kurutma için sıcak plaka (37 ° C) slaytlar ve transfer kızaklar üzerinde aktarma bölümleri. </li><li> 0.22 um bir filtre ile donatılmış ve 3 dakika boyunca inkübe bir şırınga kullanılarak bölümlere toluidin mavi bir çözelti damla ekleyin. distile su ve l ile slaytlar durulayınet bölümler kurulayın. Hücrelerin konumunu tanımlamak için bir ışık mikroskobu ile kontrol edin. </li><li> Bir elmas bıçak kullanarak - (100 nm 70) ultra-ince kesitler halinde kesilmiştir. Bir kirpik aracını kullanarak bir cam Petri kabı su tekne 200 mesh ızgaraları 3 bölümden - 2 taşıyın. </li><li> 30 dakika boyunca bölümler kuru, 30 ° C&#39;de bir sıcak plaka bölümleri olan ızgaraları ihtiva eden cam bir Petri tabağına aktarın. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 1 uranil asetat ile damla ızgaraları Leke ve damıtılmış su içinde 6 yıkayın - 8 defa. 8 kat - Reynolds ile Leke 6 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, sitrat, kurşun ve damıtılmış su içinde durulayın. bölümler kuru, 37 ° C&#39;de bir sıcak plaka ızgaraları ihtiva eden cam bir Petri tabağına aktarın. </li><li> 80 kV 7 de, bir elektron mikroskobu ile bölümleri analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yöntem, Evans mavisi boyama kullanarak ve agaroz dehidratasyon, reçine gömme sırasında küçük bir hücre pelletini lokalize gömme ve süreçleri kesit ile, düşük hücre sayıları TEM analizi sağlar. Daha da önemlisi, bu arada, hücre kümeleri korur ve verilerin ölçümü için çok sayıda hücreleri incelemek için arzu edilir, hücre ultra yapısını korur. TEM çalışmalarda, milyonlarca hücreleri ihtiva eden bir hücre pelleti genellikle çok sayıda hücre veri elde etmek için bir agaroz / jelatin matrisine ve yıkamalar, dehidrasyon ve infiltrasyon etkin gömme için gereklidir. Araştırmacılar, bir BSA-bisakrilamid polimerleştirilmiş reçine hücre süspansiyonu immobilizasyon benimsemiş, düşük hücre sayıları / az örnekler 4-6 TEM analizi için ince bir destek üzerinde mono tabakaları, veya sitos- pinler boyanması. Ancak, lokalize çünkü matris içinde hücrelerin seyrek dağılımı TEM altında hücreleri kesmek için sıkıcı bir iş kalır venedeniyle yayılan ve çoğu zaman kesit önce yeniden gömme gerekli Sitospin hazırlanması sırasında hücreler arasındaki bölünme hücre morfolojisi olası değişiklikler. Ayrıca, tek tabaka 11 kesit için lokalize etmek zor kalır. Bu nedenle, daha düşük hücre sayısının az bir biyolojik numune bir hücre pelleti TEM analizi için 1 çok daha kolaydır. Bu yöntem, sınırlı örneklerden nitel ve nicel ultra-yapısal analiz açısından daha önce yayınlanmış yöntemlere 4,5 için önemli bir avantaj oluşturmaktadır. Birlikte, bu protokol TEM nitel ve nicel veri analizi sağlamak için kolay, düşük hücre sayıları örnek işleme yapan Evans mavisi kullanılarak TEM için hücre pelletleri lokalize için etkili bir yol tarif eder. Tipik olarak, TEM için numune hazırlama, çünkü örnek işleme f çoklu adımlar, genellikle ışık mikroskobu için gerekli olandan daha büyük bir hücre sayısını gerektirirTEM ve doğru konumda 1,10 olarak kesim için hücre bloğunun doğru yönelim ya da. Post-fiksasyon osmification, özellikle membran ve glikojen parçacıkların bu uranil asetat, proteinler için nispeten spesifik olmayan boyası ile bir elektron mikroskobu 9 ve daha fazla destek boyama altında, görüntüler daha iyi bir kontrast sağladığı bilinmektedir ve leke kurşun sitrat olduğu membranlar, nükleik asitler ve glikojen. Ancak, osmification nedeniyle kesit ve matris kararması sırasında numune kaybı olasılığı yüksek BSA-ba öncesi gömme sonra süspansiyon kıt biyolojik örneklerin ile gerçekleştirmek için neredeyse imkansızdır. Böylece elektron mikrograflar kalitesi önceki çalışmalarda 4,9 tatlıya. Osmification Burada agaroz renkte çok az değişiklik ile hücre peleti koyulaşma yol açtı. Bu nedenle, bu protokol, TEM im iyi bir kontrast sağlamak için, agaroz içinde önceden gömülen osmification sağlaryaşlar. Hücre kümeleri bu yöntemi kullanarak elektron mikroskobu ile analiz etmek oldukça kolay. Evans mavisi ile ön boyama alt organel hücre ayrıntılarını etkilemeden numune hazırlama sırasında minik hücre pelletleri yerelleştirilmesine yardımcı oldu. Bu yöntem, numune hazırlama başarıyla düşük hücre sayıları TEM analizi gerçekleştirmek için alternatif bir yaklaşım sunuyor. (- 8 um 5) Bu yöntemde, TEM analizi etkili bir şekilde küçük boyutlu hücreler kullanılarak yapıldı. Bu durumda, bu yaklaşımın kolay bir fibroblastlar ve endotel hücreleri gibi daha büyük hücrelerin daha düşük hücre sayısı (~ 1.000 hücre) kabul edilebilir. Evans mavisi bu çalışmada alt organel hücre ayrıntıları etkilemese de, düşük hücre sayıları ile immün-altın elektron mikroskobu için Evans mavisi kullanımı test edilmemiştir. Birlikte, düşük hücre sayısı TEM çalışmalar yapmak numune hazırlama için etkili bir yöntem tarif edilmektedir. TEM çalışmaları Critica ortaya çıkarmak için gerekli olanmorfolojisi ve hücre üst yapılarının l bilgileri. Bu nedenle, ultra-yapısal bilgiler genellikle çeşitli kıt hücre popülasyonları üzerinde eksik. Bu alternatif ve numune hazırlama için yeni bir yaklaşım herhangi bir nadir hücre popülasyonu TEM çalışmalar yapmak yararlı olacaktır. Ayrıca, bu yöntem hücre kümeleri analizinden nitel ve nicel veri sağlar. elektron mikroskobu hücre ultra yapısı ve organizasyon eşsiz ayrıntılar sunuyor olarak, bu yöntem oldukça tuş üzerinde birçok biyolojik süreçleri anlamak için yararlı, ancak nadir, hücre popülasyonları olacaktır.

Hücrelerin Ultra yapısal ve alt organel ayrıntıları ağırlıklı transmisyon elektron mikroskobu (TEM) doku veya hücre pelet 1,2 dan çalışmalar tarafından ortaya konmuştur. dokuların katı parçaları kolayca elektron mikroskopisi çalışmaları için kullanılabilir. Ancak, TEM süspansiyon hücreleri üzerinde 1,3 zorlu kalır ve yüksek hücre yani sayıları, hücrelerin milyonlarca gerektiren analiz eder. Bu nedenle, süspansiyonun nadir hücre popülasyonlarının ultra yapısal analizi, örneğin, hematopoietik kök hücreler (HSC), kolayca değerlendirilmemektedir. sitospin veya tek katmanlı yaklaşımları kullanarak kıt örneklerden TEM analizi için birden fazla girişimleri hücrelerin sınırlı sayıda önemli nicel veriler elde etmek için başarısız. Bu nedenle, yüksek hücre sayısı gereksinimi nadir hücre popülasyonlarının hücre içi ultrastrüktürel detaylarını anlamak için bu güçlü aracın kullanımını sınırlar. Hücrenin sınırlı sayıda TEM çalışmalar için önemli bir sınırlamasısüspansiyondaki s işleme hücre lokalizasyonu ve bu nedenle, özellikle küçük boyutları ile sınırlıdır hücrelerden TEM çalışmaları zor olmaya devam etmektedir. Birkaç alternatif yaklaşımlar bu sınırlama karşı kabul edilmiştir: BSA / bisakrilamid (BSA-BA) hücre süspansiyonu aracılı polimerizasyon, lamelleri içeren ince bir film desteğine onları görünür hale getirmek için bir boya ile hücrelerin boyanması, ve TEM sitospin hazırlıkları 4-6 analizleri. Çok az sayıda hücre ultra kesit sonra bölümlerde bulundu Ancak, çok sınırlı bir başarı elde edilmiştir. Hücre tek tabaka kesit için katılaşmış jel çoğunlukla görünmez kalır çünkü seyrek hücrelerin belirlenmesi önemli zorluk devam etmektedir. Ayrıca, hücrelerin Sitospin hazırlanması nedeniyle hücre yayılması ve hücre yapısının kırılganlık kendi hücresel organizasyonu değiştirebilir. Bu nedenle, bu doğal sakıncaları daha nadir hücre popülasyonlarının TEM çalışmaları yapmak için yeni bir yaklaşım garantitutarlılık. Bu sorunu aşmak için, nadir bir hücre popülasyonlarının 7 TEM çalışmalar için bir yeni ve alternatif örnek hazırlama yöntemi tanımlamaktadır. Burada, tutarlı nitel ve nicel sonuçları ile kıt biyolojik örneklerden TEM gerçekleştirmek için etkili bir örnek hazırlama protokolü sunduk. Evans mavisi boyama, aksi takdirde görünmez kalacaktı düşük sayı hücreleri, yani 10.000 kemik iliği hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden küçük bir hücre pelletini yerelleştirilmesine fiksasyon sonra yapıldı ve pelet dehidratasyon ve reçine gömme süreçlerine önce agaroz içine gömülü edildi. Bu yöntem bir arada hücreleri kümeleri ve ultrastrüktürü ve (Lin olarak tanımlanan - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -; HSC) hematopoetik kök hücrelerin hücre içi organizasyonun verimli analiz sağlar, nadir 0,2-0,5% hücre popülasyonu kemik iliğinde. Bu deneysel protokol ultra yapısal çalışmalar yapmak ve çok nadir ama çok önemli popülasyonları üzerindeki nicel sonuçlar elde etmek yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>15713</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>16350</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Cacodyladate buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 &amp;deg;C. &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td></tr><tr><td>Evans Blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; stock, &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LX-112 Embedding Kits (LADD&amp;reg;)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Uranyl acetate (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composition: NaCl, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Pyramid tip mold&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>mounting cylinders</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome&amp;nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mesh grids (nikil)</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>Hitachi model H-7650&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image capture engine software</td><td>AMT-600&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic Petri dishes</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eyelash tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Loop tool&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), hücresel organizasyon ve ultrastrüktürü ayrıntılı bilgi sağlar. Bununla birlikte, bu hematopoietik kök hücreler (HSC), nadir hücre popülasyonlarının, süspansiyon içinde, özellikle hücre TEM analizi, numune hazırlanması sırasında yüksek hücre sayısı şartı ile sınırlı kalmaktadır. Orada kıt örneklerden TEM analizi için birkaç sitospin veya tek katmanlı yaklaşımlar vardır, ancak bu yaklaşımların hücrelerin sınırlı sayıda önemli nicel veriler elde etmek için başarısız. Burada, TEM çalışmalarda numune hazırlanması için bir seçenek ve yeni bir yaklaşım kantitatif analiz sağlar nadir hücre popülasyonları için tarif edilmektedir. Nispeten düşük bir hücre sayısı, yani, 10,000 HSC hücreleri, başarılı bir şekilde, tipik olarak, TEM çalışmaları için kullanılan hücrelerin, milyonlarca göre TEM analizi için kullanıldı. Özellikle, Evans mavisi boyama paraformaldehit-glutaraldehit sonra minik hücre PEL görselleştirmek için (PFA-GA) tespit yapıldıAgaroz gömme kolaylaştırdı, izin verin. Çok sayıda hücre kümeleri, ultra ince bölümler tespit edilmiştir. Hücreler iyi korunmuş morfolojiye vardı ve Golgi kompleksi ve çeşitli mitokondri ultra-yapısal ayrıntıları görünür. Bu, etkin olarak kolay ve tekrarlanabilir bir protokol, düşük hücre sayısı örnek hazırlama izin verir ve sınırlı biyolojik numunelerden nadir hücre popülasyonları üzerinde nitel ve nicel TEM analizi için kullanılabilir.

Numune hazırlama için verimli ve tutarlı protokol hücrelerin sayısının düşük açıklanan TEM analizi gerçekleştirmek için. Evans mavisi ve 0.5 ml mikrosantrifüj tüp hücreleri transferi ile post-fiksasyon boyama minik hücre pelletini 7 görselleştirmek yardımcı oldu. Agaroz osmiyum tetraoksit ile Osmification dehidrasyon ve gömme sırasında koyu renkli hücre peleti kolay bir algılama yol açtı. Küçücük bir hücre pelletini içeren bloklardan yarı ince kesitler birlikte çok sayıda hücrelerden bir küme (Şekil 1A ve 1B) doğruladı. Ultra-ince kesitler hücre kümelenmiş alandan kesilen ve elektron mikroskobu (Şekil 1C) altında analiz edildi. Bu hücrelerin morfolojisi ve ultra-yapı yanı (Şekil 1D) korunmuştur. Tek bir hücrenin elektron mikroskobu hücre içi yüksek ayrıntıları gösterdiUltra-yapılar (Şekil 1 E). Ayrıca, yüksek büyütme (50,000X) görüntüleri iyi korunmuş yapısı ve mitokondri (Şekil 1F) gibi alt hücresel organelleri, bütünlüğünü gösterdi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54724/54724fig1.jpg" /> Şekil 1: Görüntü Analizi Altında Işık ve Elektron Mikroskobu. (A) ışık mikroskobu altında 1 mikron kalınlığında bir toluidin mavisi lekeli bölümün temsili bir alanın düşük büyütme görüntü. (B) 1 mikron kalınlığında bölümün toluidin mavisi boyama sonra kümedeki hücrelerin sağlam morfolojisi gösteren Işık mikroskobu görüntüsü. (C) uranil asetat ile boyama ve kurşun sitrat sonra elektron mikroskobu altında gözlenen hücre kümesinin bir bakış alanı. (D) elektron mikroskobu altında tek LT-HSC. (E) Yüksek magnifhücre içi yapıları gösteren HSC ication görüntüsü. (F) HSPC gelen mitokondri yüksek büyütmeli görüntü. Ölçek çubuğu: A / B, 100 mikron; Cı, 10 um; D 2 um; E / K, 500 nm. &#160; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54724/54724fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis at JoVE.com

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Görüntüleme.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

Video: An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

Mühendislik

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers of multi-layered samples. This removal of layers prior to plunge freezing can aid in reducing sample thickness to a level suitable for cryo-EM data collection, improving sample flatness, and facilitating image processing. The peel-blot technique allows for the separation of multilamellar membranes into single layers, of layered 2D crystals into individual crystals, and of stacked, sheet-like structures of soluble proteins to likewise be separated into single layers. The high sample thickness of these types of samples frequently poses insurmountable problems for cryo-EM data collection and cryo-EM image processing, especially when the microscope stage must be tilted for data collection. Furthermore, grids of high concentrations of any of these samples can be prepared for efficient data collection since sample concentration prior to grid preparation can be increased and the peel-blot technique adjusted to result in a dense distribution of single-layered specimen.

The peel-blot technique is a cryo-EM grid preparation method that allows for the separation of multilayered and concentrated biological samples into single layers to reduce thickness, increase sample concentration, and facilitate image processing.

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Biyokimya

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

Neuroscience bölümlerinde TEM örnekleme tarafsız bir yaklaşım

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Nörobilim

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Biyoloji

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

<meta charset="utf8"></head><body>TEM için Retinal Organoid Örnek Hazırlama için Optimize Edilmiş Protokol

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: TEM Kullanarak Olgun Retinal Organoidlerde Sinaptik Ultrastructure'ın Analiz Edilmesi

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Neuroscience bölümlerinde TEM örnekleme tarafsız bir yaklaşım

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu