We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité institucional de los animales en la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati. Para este estudio, se aislaron células madre hematopoyéticas de la médula ósea de ratones C57BL / 6 ratones endogámicos de entre 2 - 4 meses. Clasificación de células mediante FACS después de la tinción de BM con diferentes fabricantes de superficie incluyendo Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 y CD34 se utilizó para la purificación de HSC basado en Flt3 Lin- Sca-1 + c-Kit + - estrategia gating - CD34 como protocolo estándar descrito antes de las 8. PRECAUCIÓN: Varios productos químicos altamente tóxicos se utilizan durante este procedimiento. Estos son tóxicos por inhalación y contacto con la piel. Por favor, use guantes y ropa de protección. Trabajar en campana de humos mientras se trabaja con estos productos químicos. 1. células, la fijación, tinción y Pre-incrustación <ol><li> Ordenar 10.000 células madre hematopoyéticas (utilizando Lin - Sca-1 <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating estrategia; población LT-HSC) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 600 l de modificación de Dulbecco de Iscove Medio (IMDM) con suero bovino fetal al 10% usando FACS. </li><li> Centrifugar las CMH ordenados a 1.000 xg durante 10 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando una centrífuga con cubos que oscila hacia afuera. Retire medio por aspiración suave y dejar 200 l de medio en los tubos en cada paso. En esta etapa, el sedimento celular permanece invisible en el tubo. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 0,2 ml de solución de fijación 2x a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora 1,9. <ol><li> Hacer la solución de fijación fresca antes de su uso. En 1x, la solución se compone de 3% de paraformaldehído y 2,5% de glutaraldehído en tampón de cacodilato 0,1 M. </li></ol></li><li> Centrifugar las células a 1000 xg durante 10 minutos a 30 ° C utilizando una centrífuga con cubos basculante. </li><li> Lavar las células con 600 l de tampón de 0,1 M de cacodilatousando centrifugación y dejar tampón de 200 l en el tubo después de la centrifugación. </li><li> Tinción de las células fijadas mediante la adición de 200 l de solución / ml 2 mg de azul de Evans en tampón cacodilato y se incuba durante 20 min a TA. Las células serán de color azul. </li><li> Lavar las células 3 veces con 600 l de tampón de cacodilato 0,1 M usando centrifugación y dejar tampón de 200 l en el tubo cada vez. </li><li> Vuelva a suspender las células en tampón de 200 l y transferir la suspensión celular a un tubo de 0,5 ml. Centrifugar a 1000 xg durante 10 min utilizando una centrífuga de mesa. Eliminar el tampón suavemente sin alterar el sedimento celular pequeña ahora visible, y dejar tampón de 50 l en el tubo. </li><li> Añadir 200 mg bajo punto de fusión de agarosa para 5 ml de tampón de cacodilato 0,1 M en el tubo de 15 ml de una solución de agarosa al 4%. Fundir la agarosa mediante la transferencia del tubo de agua hirviendo en una botella de vidrio de 100 ml y mantener tibia hasta que se usaron. </li><li> Añadir 200 l de 4% de agarosa de baja fusión disolvieron en 0,1 M cacodylatampón TE a la suspensión celular en un tubo de 0,5 ml e inmediatamente se centrifuga a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C usando una centrífuga de mesa. </li><li> Después de confirmar que las células sedimentaron en el fondo del tubo de 0,5 ml en la agarosa semisólida después de la centrifugación, transferir inmediatamente el tubo a 4 ° C o de hielo durante 20 min para solidificar la agarosa. Este paso es muy crítico, ya que un pequeño sedimento celular visible en este paso resulta en un buen grupo de células bajo el microscopio electrónico. </li><li> Transferir con cuidado la agarosa solidificada que contiene el sedimento celular del tubo de plástico a un plato de 35 mm de Petri que contenía tampón utilizando un G 3,10 27 aguja. </li><li> Recortar los agarosa solidificada que contiene el sedimento celular en una sola pieza de aproximadamente 1 - 2 mm con un bisturí. La transferencia de la pieza de agarosa que contiene el sedimento celular a un nuevo tubo de 1,5 ml. </li><li> Lavar 2 - 3 veces con 600 l de tampón cacodilato 0,1 M mediante la adición y la eliminación de buffer usando la pipeta sin centrifugación. Utilice esta pieza de agarosa que contiene el sedimento celular para el siguiente paso. En este paso, la muestra se puede almacenar a 4 ° C durante la noche antes de pasar al siguiente paso. </li></ol> 2. Osmification, deshidratación, incrustación <ol><li> Eliminar el tampón de cacodilato desde el tubo de 1,5 ml con el sedimento celular que contiene agarosa usando una pipeta. Añadir 1,0 ml de 1% tetraóxido de osmio (OsO4) de solución en una campana de humos, y se incuba durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Lavar tres veces con 600 l de tampón de cacodilato 0,1 M y transferir la muestra a un vial de centelleo de vidrio de 20 ml con una tapa. </li><li> Procesar la muestra para la deshidratación, la infiltración y la incrustación en resina (por ejemplo, LX-112) con los cambios de serie de las siguientes soluciones en una placa de 6 pocillos. Mover la pieza de agarosa por células de pellets con unas pinzas. <ol><li> Sumergir la muestra en 25% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Sumergir la muestra en 50% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Sumergir la muestra en el 75%etanol a TA durante 15 min. </li><li> Sumergir la muestra en 95% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Sumergir la muestra en 100% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min, dos veces. </li><li> Sumergir la muestra en etanol: resina (3: 1) a TA durante 30 min. </li><li> Sumergir la muestra en etanol: resina (1: 1) a TA durante 30 min. </li><li> Sumergir la muestra en etanol: resina (1: 3) a TA durante 30 min. </li><li> Sumergir la muestra en resina pura a temperatura ambiente durante 60 min, dos veces. </li></ol></li><li> Transferir la muestra a la parte inferior de la punta de la pirámide molde de goma en forma de uso de fórceps con cuidado y añadir la resina más pura en la parte superior de la muestra para llenar el molde. Incubar la muestra a 60 ° C durante 72 hr para la polimerización de la resina. </li><li> Retire la pirámide resina polimerizada de los moldes girando el molde de goma. Un pequeño grupo de células negro debe ser visible en la pirámide de resina polimerizada, como se ha descrito anteriormente 7. Coloque la pirámide de resina polimerizada en el cilindro de montaje con cianoacrilato. </li></ol><ol><li> Recorte el bloque de pirámide con una hoja de afeitar y un cuchillo de diamante después de montar el bloque en un ultra-micrótomo. Hacer una forma trapezoidal ancha corta con la parte superior y la parte inferior del bloque en paralelo entre sí, y con los lados de manera uniforme en ángulo. Esta forma de la pirámide ayuda de cortes seriados. </li><li> Además, recortar el bloque de todo el sedimento celular con el bisturí de diamante y quitar las secciones de plástico alrededor de la pieza de agarosa al sedimento celular. </li><li> Cortar 1 micras secciones usando un ultra-micrótomo. Mover las secciones 1 m desde el barco del agua a un portaobjetos de vidrio utilizando una herramienta de pestañas y una herramienta de lazo de metal como se informó anteriormente 7. secciones de transferencia de diapositivas y diapositivas de transferencia a la placa caliente (37 ° C) para el secado. </li><li> Añadir una gota de solución de azul de toluidina a las secciones utilizando una jeringa equipada con 0,22 micras filtro y se incuba durante 3 min. Enjuague los portaobjetos con agua destilada y ly las secciones se sequen. Consulte con un microscopio de luz para identificar la posición de las células. </li><li> Los cortes de secciones ultrafinas (70 - 100 nm) utilizando un cuchillo de diamante. Mueve 2 - 3 secciones en las redes de malla 200 de la embarcación del agua a un plato de Petri de vidrio usando una herramienta de pestañas. </li><li> Transferir el cristal placa de Petri que contiene cuadrículas con secciones de una placa caliente a 30 ° C para secar las secciones durante 30 minutos. </li><li> Tinción de las rejillas con gotas de acetato de uranilo al 1% a temperatura ambiente durante 10 min y luego enjuague en agua destilada 6 - 8 veces. Mancha con citrato de plomo de Reynolds, a TA durante 5 min y enjuague en agua destilada 6 - 8 veces. Transferir el cristal placa de Petri que contiene las cuadrículas en una placa caliente a 37 ° C para secar las secciones. </li><li> Analizar las secciones con un microscopio electrónico, a 80 kV 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este método permite el análisis TEM de bajo número de células, mediante el uso de la tinción de azul de Evans y la incrustación de agarosa para localizar un pequeño sedimento celular durante la deshidratación, la incrustación de resina y los procesos de corte. Es importante destacar, que mantiene juntos los grupos de células y preserva la ultra-estructura de la célula, que es deseable para examinar células múltiples para la cuantificación de datos. En estudios TEM, a menudo se requiere un sedimento de células que contienen millones de células para empotramiento eficiente en una matriz de agarosa / gelatina y para el lavado, la deshidratación y la infiltración para obtener datos de numerosas células. Los investigadores han adoptado la inmovilización de la suspensión de células en una resina polimerizada BSA-bisacrilamida, la tinción de las monocapas sobre un soporte fino, o cytospins para análisis TEM en el número de células de baja / escasos muestras 4-6. Sin embargo, sigue siendo un trabajo tedioso para localizar y cortar células bajo el TEM debido a la distribución dispersa de las células dentro de la matriz yposibles alteraciones de la morfología de las células, debido a la difusión y una hendidura entre las células durante la preparación citospina que a menudo requieren reincrustación antes de seccionar. Además, la monocapa sigue siendo un reto para localizar para seccionar 11. Por lo tanto, un sedimento de células incluso a partir de muestras biológicas escasos del número de células bajo es mucho más fácil para el análisis TEM 1. Este método representa una ventaja significativa a los métodos publicados anteriores 4,5 en términos de análisis de ultra-estructural cualitativo y cuantitativo de muestras limitadas. Juntos, este protocolo se describe una forma eficiente de localizar los sedimentos celulares para TEM utilizando azul de Evans, que hace que el procesamiento de la muestra a partir de los números de células bajos fáciles para TEM para permitir el análisis de datos cualitativos y cuantitativos. Típicamente, la preparación de muestras para TEM requiere un mayor número de células que lo que normalmente se requieren para la microscopía de luz, debido a las múltiples etapas de procesamiento de la muestra fo TEM y la orientación apropiada del bloque de celdas para el corte en la posición correcta 1,10. Se sabe que osmification post-fijación proporciona un mejor contraste de las imágenes, especialmente las de las membranas y las partículas de glucógeno bajo un microscopio electrónico 9, y aún más tinción apoyo con acetato de uranilo, una mancha relativamente no específico para proteínas, y citrato de plomo que tiñe membranas, ácidos nucleicos y glucógeno. Sin embargo, osmification es casi imposible de realizar con muestras biológicas escasos en suspensión después de pre-incrustación en BSA-BA debido a la alta probabilidad de pérdida de la muestra durante el corte y el oscurecimiento de la matriz. Por lo tanto la calidad de las micrografías electrónicas se ha visto comprometida en estudios previos 4,9. Osmification aquí llevó a oscurecimiento del sedimento celular con un cambio mínimo en el color de la agarosa. Así, la presente protocolo permite osmification después de pre-incrustación en agarosa con el fin de proporcionar un buen contraste en TEM imsiglos. grupos de células fueron bastante fácil de analizar con microscopía electrónica utilizando este método. El pre-tinción con azul de Evans ayudó a localizar sedimentos celulares diminutos durante la preparación de la muestra sin afectar a los detalles de células sub-orgánulo. Este método ofrece un enfoque alternativo para la preparación de muestras para llevar a cabo con éxito el análisis TEM de bajo número de células. En este método, el análisis TEM se realizó eficazmente utilizando células de un tamaño pequeño (5-8 micras). Por lo tanto, este enfoque puede ser fácilmente adoptado con número par inferior de células (~ 1000 células) de las células más grandes, tales como fibroblastos y células endoteliales. Aunque el azul de Evans no afectó a los detalles de células sub-orgánulos en el presente estudio, el uso de azul de Evans para microscopía electrónica de inmuno-oro con el bajo número de células no ha sido probado. En conjunto, se describe un método eficiente para la preparación de muestras para llevar a cabo estudios de TEM de un número bajo de células. Se requieren estudios de TEM para revelar critical información sobre la morfología y los ultra-estructuras de las células. Por lo tanto, la información ultra-estructural es a menudo falta en diversas poblaciones de células escasos. Esta alternativa y enfoque novedoso para la preparación de la muestra serán útiles para realizar estudios de TEM de cualquier población de células raras. Además, este método permite que los datos cualitativos y cuantitativos de los análisis de grupos de células. Como microscopía electrónica ofrece detalles sin igual de la ultra estructura y organización celular, este método será muy útil para entender muchos procesos biológicos en clave, pero rara, las poblaciones celulares.

Detalles-Ultra estructurales y sub-orgánulos de células se han puesto de manifiesto principalmente por microscopía electrónica de transmisión (TEM) estudios de tejidos o sedimentos celulares 1,2. piezas sólidas de tejidos se pueden utilizar fácilmente para estudios de microscopía electrónica. Sin embargo, los análisis de TEM 1,3 en las células en suspensión siguen siendo difíciles y requieren altos números de células, es decir, millones de células. Debido a esto, los análisis ultra-estructurales de las poblaciones de células raras en suspensión, por ejemplo, células madre hematopoyéticas (HSC), no son evaluados fácilmente. Múltiples intentos para el análisis de TEM de las muestras de los escasos utilizando cytospin o monocapa enfoques no pueden conseguir datos cuantitativos significativa del número limitado de células. Por lo tanto, el requisito de un número alto de células limita el uso de esta potente herramienta para entender los detalles ultraestructurales subcelulares de las poblaciones de células raras. Una limitación clave para los estudios TEM con un número limitado de célulass en suspensión es la localización de las células para el procesamiento y, por tanto, los estudios de TEM de las células limitadas con particular tamaños pequeños siguen siendo difíciles. Varios enfoques alternativos se han adoptado para hacer frente a esta limitación: la BSA / bisacrilamida (BSA-BA) polimerización mediada por la suspensión celular, la tinción de las células con un tinte para que sean visibles en un soporte de película delgada incluyendo cubreobjetos, y análisis TEM de las preparaciones de citospina 4-6. Sin embargo, se logró un éxito muy limitado, como se encontraron muy pocas células en secciones después de ultra-seccionamiento. El desafío clave de identificación de células dispersas persiste debido a la monocapa de células se mantiene prácticamente invisible en el gel solidificado para seccionar. Además, la preparación de citospina de células puede alterar su organización celular debido a la propagación de células y la fragilidad de la estructura celular. Por lo tanto, estos inconvenientes inherentes justifican un enfoque novedoso para llevar a cabo estudios de TEM de las poblaciones de células raras con másconsistencia. Para superar este problema, hemos descrito un método nuevo y preparación de la muestra alternativa para los estudios de TEM de las poblaciones de células raras 7. Aquí, se presenta un protocolo de preparación de muestras eficiente para llevar a cabo TEM de las muestras biológicas con escasos resultados cualitativos y cuantitativos consistentes. Evans tinción con azul se llevó a cabo después de la fijación para localizar un pequeño sedimento celular a partir de células de bajo número, es decir, 10.000 médula ósea madre hematopoyéticas y células progenitoras que de otro modo habrían permanecido invisible, y el sedimento se incrusta en agarosa antes de procesos de deshidratación y de la resina de inclusión. Este método agrupa las células juntos y permite el análisis eficaz de la ultraestructura y organización subcelular de las células madre hematopoyéticas (identificado como Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -; HSC), una rara 0,2 - población de células 0,5% en la médula ósea. Este pro experimentaltocol puede ser útil para llevar a cabo estudios de ultra-estructurales y obtener resultados cuantitativos en muchas poblaciones raras pero altamente importantes.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>15713</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>16350</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Cacodyladate buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 &amp;deg;C. &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td></tr><tr><td>Evans Blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; stock, &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LX-112 Embedding Kits (LADD&amp;reg;)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Uranyl acetate (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composition: NaCl, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Pyramid tip mold&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>mounting cylinders</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome&amp;nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mesh grids (nikil)</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>Hitachi model H-7650&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image capture engine software</td><td>AMT-600&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic Petri dishes</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eyelash tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Loop tool&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporciona detalles de la organización celular y ultraestructura. Sin embargo, el análisis de TEM de las poblaciones de células raras, especialmente células en suspensión, tales como células madre hematopoyéticas (HSC), sigue siendo limitada debido a la exigencia de un número de células de alta durante la preparación de la muestra. Hay algunos enfoques Cytospin o monocapa para el análisis TEM de las muestras de los escasos, pero estos enfoques no pueden conseguir datos cuantitativos significativos a partir del número limitado de células. Aquí, se describe un enfoque alternativo y novedoso para la preparación de muestras en los estudios TEM para poblaciones de células raras que permite el análisis cuantitativo. Un número relativamente bajo de células, es decir, 10.000 HSC, se utilizó con éxito para el análisis de TEM en comparación con los millones de células utilizadas normalmente para estudios de TEM. En particular, la tinción de azul de Evans se realizó después de paraformaldehído-glutaraldehído fijación (PFA-GA) para visualizar la pequeña pel celulardejar, lo que facilitó la incorporación de agarosa. No se observaron agrupaciones de numerosas células en cortes ultrafinos. Las células tenían una morfología bien conservada, y los detalles ultra-estructurales de la mitocondria complejos y varios de Golgi eran visibles. Este protocolo eficiente, fácil y reproducible permite la preparación de muestras de un número bajo de células y se puede utilizar para el análisis TEM cualitativa y cuantitativa sobre las poblaciones de células raras de muestras biológicas limitados.

Un protocolo eficiente y consistente para la preparación de muestras para realizar análisis de TEM se describe de bajo número de células. Tinción posterior a la fijación con azul de Evans y la transferencia de las células a un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml ayudó a visualizar el pequeño sedimento celular 7. Osmification con tetraóxido de osmio en agarosa condujo a una fácil detección del sedimento celular oscuro durante la deshidratación y la incrustación. Semi-delgadas secciones de los bloques que contienen una pequeña sedimento celular confirmaron un grupo de numerosas células juntos (Figura 1A y 1B). Las secciones ultra delgadas fueron cortadas de la zona agrupado por células y se analizaron con microscopía de electrones (Figura 1C). La morfología y ultraestructura de estas células estaban bien conservados (Figura 1D). La micrografía electrónica de la célula individual mostró altos detalles sobre el intracelular-estructuras de ultra (Figura 1E). Por otra parte, los (50.000X) imágenes de alta magnificación mostraron una estructura bien conservada y la integridad de los orgánulos subcelulares, tales como las mitocondrias (Figura 1F). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54724/54724fig1.jpg" /> Figura 1: Análisis de imágenes bajo luz y microscopio electrónico. La imagen baja magnificación de un campo representativo de una sección teñido con azul de toluidina de 1 m de espesor bajo microscopio de luz (A). Fotografía del microscopio de luz que muestra la morfología de las células intactas en clúster después de la tinción con azul de toluidina de 1 micra de espesor sección (B). (C) Un campo de visión general del grupo de células se observaron bajo microscopio electrónico después de la tinción con acetato de uranilo y citrato de plomo. (D) Un único LT-HSC bajo microscopio electrónico. (E) superior magnificación imagen de HSC que muestra las estructuras subcelulares. (F) Imagen Mayor aumento de las mitocondrias de HSPC. Barra de escala: A / B, 100 m; C, 10 micras; D, 2 micras; E / F, 500 nm. &#160; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54724/54724fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis at JoVE.com

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K vistas.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

Video: An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

Investigación

Ingeniería

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers of multi-layered samples. This removal of layers prior to plunge freezing can aid in reducing sample thickness to a level suitable for cryo-EM data collection, improving sample flatness, and facilitating image processing. The peel-blot technique allows for the separation of multilamellar membranes into single layers, of layered 2D crystals into individual crystals, and of stacked, sheet-like structures of soluble proteins to likewise be separated into single layers. The high sample thickness of these types of samples frequently poses insurmountable problems for cryo-EM data collection and cryo-EM image processing, especially when the microscope stage must be tilted for data collection. Furthermore, grids of high concentrations of any of these samples can be prepared for efficient data collection since sample concentration prior to grid preparation can be increased and the peel-blot technique adjusted to result in a dense distribution of single-layered specimen.

The peel-blot technique is a cryo-EM grid preparation method that allows for the separation of multilayered and concentrated biological samples into single layers to reduce thickness, increase sample concentration, and facilitate image processing.

La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Bioquímica

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

Optimización de la preparación de muestras para microscopía electrónica criogénica

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

Un enfoque imparcial del muestreo secciones TEM en Neurociencia

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Neurociencias

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-Microscopía Electrónica de Preparación de Muestras por medio de un haz de iones focalizados

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Biología

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo optimizado para la preparación de muestras de organoides de retina para TEM

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Análisis de la ultraestructura sináptica en organoides retinales maduros utilizando TEM

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas

Optimización de la preparación de muestras para microscopía electrónica criogénica

Un enfoque imparcial del muestreo secciones TEM en Neurociencia

Cryo-Microscopía Electrónica de Preparación de Muestras por medio de un haz de iones focalizados

Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión