Elektron mikroskobu için tarafsız örnekleme protokolü hayati önem taşımaktadır. Belirli bir beyin bölgesindeki sinapsların veya diğer yapıların sayısal yoğunluğu üzerinde ölçmek isterseniz, tekniğimizin en büyük avantajı tarafsız olması ve en az kullanıcı müdahalesi ile otomatik olarak elektron mikrografları üretmesini sağlamasıdır. Bu teknik aynı zamanda nöroloji gibi diğer araştırma alanlarında da değerlidir, bir sinir ağının gücünü değerlendirmede kullanılabilir nerede.
Protokolümüzü uygulamak için, örnek hazırlama ve geçiş elektron mikroskobu gibi elektron mikroskobik tekniklerinde deneyim sahibi olmak gerekir. Prosedürümüzdr. Bu protokol, elektron mikroskobu için beyin örneklerinin hazırlanmasından, ince kesitlerin kesilmesinden oluşmaktadır.
Daha sonra, otomatik olarak ilgi bir alanda elektron mikrograflar tanımlı sayıda üretmek için nasıl açıklayacağız. Daha sonra, yapısal özelliklerin sayısal yoğunluğunu değerlendirmek için bir sayma çerçevesi kullanır. Başlamak, incelemek, düzeltmek, düzeltmek ve reçineler katıştırma içine ilgi örnekleri gömmek için eşlik eden metin protokolü ile birlikte takip etmek.
Daha sonra, bir ultramicrotome üzerine örnek yerleştirin ve 55 nanometre ultra ince seri bölümleri üretmek. Piola formu ile kaplanmış, iki milimetre bir milimetre boyutları ile bir yuva ızgara üzerinde bölümleri yerleştirin. Daha sonra yuva ızgaralarında %2 uranyl asetat kullanarak ultra ince bölümleri 30 dakika boyunca lekeleyin ve ardından oda sıcaklığında 30 saniye kurşun sitrat elde edin.
Şebekeyi TEM'e yerleştirin ve bölümlerin kalitesini değerlendirmek için düşük büyütme kullanarak TEM ile ızgara üzerindeki bölümleri inceleyin. Daha sonra, TEM Seri Bölümü yazılımını başlatın, Bölüm'ü seçin ve başvuru ve arama bölümü için köşe noktalarını eklemek için Ekle'yi seçin. Açılır pencerenin yönergelerini izleyin.
Başvuru bölümüyle başlayın ve ardından arama bölümüyle devam edin. Bir ve iki noktaları girilirken, bölümün kenarlarının bir sonraki bölüme paralel olduğundan emin olun. Sonraki ilgi bölgesini tanımlamak için düşük büyütme altında referans bölümünü görselleştirin.
Referans bölümündeki TEM görüntü analizini kullanarak mikroskop aşamasını Yatırım Getirisi'nin anahatlarını oluşturmak için Yatırım Getirisi'nin birden çok köşe noktalarına taşıyın. Rasgele Nokta Örnekleme yazılımını kullanarak ortaya çıkan çokgenin koordinatlarını kaydedin. Bunun için, bölümdeki YG'yi anahatize etmek için gereken çokgenin her noktasında Rastgele Nokta Örnekleme yazılımının iletişim kutusunda koordinatları ekle'ye basın.
Sonraki tanımlayın ve Rasgele Nokta Örnekleme yazılımıiçine alanlar arasındaki örnekleme alanları ve mesafeler için uygun bir boyut girin. Daha sonra, mikrografın çokgen içindeki konumları için sistematik, tek düze, rastgele bir şekilde koordinatlar oluşturmak için Raster'ı Hesapla tuşuna basın. Rastgele Nokta Örnekleme yazılımı ve TEM Seri Bölümü yazılımını kullanarak, örnekleme noktalarını referans ve arama bölümlerinde saklayın.
Bunlar daha sonra kaydedilen montajların koordinatlarıdır. Rasgele Nokta Örnekleme yazılımında, mikroskop aşamasını referans bölümündeki her örnekleme alanının x, y-koordinatlarına taşımak için bir sonraki konuma gidin. Ardından, Konum'u seçin ve başvuru bölümündeki TEM Seri Bölümü yazılımında bu koordinatları almak için Ekle'yi seçin.
Tüm koordinatlar için bunu tekrarlayın. Başvuru bölümündeki koordinatları arama bölümüne yansıtmak için Bölüm'ün ve Bölüme Git'i seçin. İletişim penceresine arama bölümünün numarasını girin.
Montajların kaydı için, daha önce açıklandığı gibi başvuru ve arama bölümü arasında geçiş yapmak ve referans bölümündeki konumu konumla birlikte değiştirin ve numaraya gidin. İletişim penceresindeki bir sonraki koordinatı seçin. SerialEM montajları için, her örnekleme koordinatında Dosya'ya gidin ve açılan menüden Yeni Montaj'ı seçin.
İletişim penceresinde doğru kutucuk sayısını ve çakışma yüzdesini seçin. Bu çalışma için, 5000 büyütme çalışmada sinaptik özellikleri tanımak için yeterlidir. Ancak CCD kameranın sınırlı görüş alanı iki görüntü ile iki montaj yapılması nı gerektiriyordu.
Montajlar SerialEM'e yapılır. Her montajı kaydetmeden önce, odağı yeniden yeniden gözden geçirir veya kayıt yazılımındaki otomatik odaklama seçeneğini etkinleştirin. Montaj dosyasını kaydetmek için klasörü seçin ve SerialEM'in sol tarafındaki montaj alt menüsünden Başlat tuşuna basarak montaj Kaydını başlatın.
Mikrodissektörüne başlayın ve sayım çerçevesinin boyutunu ve gerektiğinde segment sayısını tanımlayın. Dissector makroyu kullanarak sinaps yoğunluğunu say. Araç çubuğunda bulunan çok noktalı aracı kullanarak, dissector'un iki yasak çizgisiyle kesişen sinapsları sınırlayın, ancak karşıt kabul satırlarında sinapsları sayın.
Başvuru bölümünde görünen, ancak arama bölümünde görünmeyen sayma çerçevesi içindeki her sinapsı oval bir seçimle işaretleyin. Sinaps parametrelerini ölçmek için, yalnızca başvuru kesitinde bulunan sinaptik yarıklı sinapsları seçin. Bu, dissector için kullanılan aynı görüntü çerçeveleri içinde olmalıdır.
Ardından, Eklentiler'e gidin ve ardından Çözümle'ye gidin ve açılan menüden eklenti ObjectJ'i başlatın. ObjectJ açılır iletişim kutusundan yeni bir proje açın ve bu da kullanıcının işaretaracıyla yapıları anahatlamasına ve işaretlemesine olanak tanıyan bir pencere açabilir. İlk olarak, yapı boyunca bir çizgi çizerek pre-sinaptik membran ve post-sinaptik yoğunluk uzunluğu uzunluğunu ölçmek için marker aracını kullanın.
Daha sonra, hem öncesi hem de sonrası sinaptik membranı kapsayan bir poligon çizerek sinaptik yarık ortalama genişliğini elde edin. Kenetlenmiş vezikül sayısını belirlemek için, bir vezikül çapı veya daha az pre-sinaptik membran maksimum mesafe ye sahip tüm veziküller saymak. Daha sonra, aynı sinapsta bir vezikül çapı maksimum mesafe ile veziküller sayarak undocked veziküllerin sayısını belirleyin.
Protokolün uyarlanmış bir sürümü ultra ince bölüm içinde tarafsız elde edilen yerlerde elementanalizleri sağlar. Bunun için TEM görüntüleme modunda SerialEM'i başlatın ve yeni bir proje açın. Ardından, Navigator'ı açın ve kamera ve komut dosyası kontrollerinde kamera nın ayarlarını kontrol edin ve görüntülemeyi kaydedin ve başlatın.
Ultra ince bölümün köşe haritasını yapmak için Gezgin penceresinde Puan Ekle'yi seçin. Ardından, köşe noktalarını ultra ince bir bölümün kenarlarına ayarlayın. Sağ fare tuşunu basılı tutarak sahneyi bir köşe noktasına taşıyın.
Bölümün bir köşesine ulaşıldığında, sol fare tıklamasıyla bir köşe noktası ekleyin. Üç köşe noktası daha eklemek için yordamı tekrarlayın. Navigator penceresinde, köşe noktaları için C kutusunun depolanan noktalar için işaretlendiğinden emin olun.
Köşe montajını başlatmak için SerialEM menü çubuğundaki Navigator'a gidin ve açılan menüden Montaj Izgaraları ve Kurulum Köşesi Montajı'nı seçin. Gezgin penceresinde Çokgen Ekle'yi seçin ve birden çok sağ fare tıklamasıyla ilgi çekici bölgenin anahatlarını belirleyin. Ardından, Gezgin açılır menüsünde Puan Izgara ekle'yi seçin ve noktalar arasındaki mesafeyi tanımlayın.
EFTEMSerialEM komut dosyasını başlatın, komut komutlarını izleyin, Navigator'da gösterildiği gibi ızgara noktası sayısını girin ve edinme noktalarının sayısını girin. Ardından, komut dosyasının ızgara çubuklarından kaçınabilmesi için aydınlatma eşiğini ayarlayın. Komut dosyası komutlarını izleyin ve kılavuz çubuğunun dörtte biri kadar görüş alanını kapsayacak şekilde sahneyi el ile taşıyın.
Görüntülenen değere göre, görüntülenen değerden daha yüksek bir eşik aydınlatma değeri girin. Satın alma noktaları seçilene ve pişirme rutininin bitmesine kadar bekleyin. Bu uzun zaman alır ve bir gecede yapılabilir.
Enerji filtreli TEM element analizi için kurulum yaptıktan sonra, elemana özel ayarlara sahip bir temel harita edinin. Tarafsız örnekleme yaklaşımı, belirli beyin bölgelerindeki sinaptik özellikleri saymak ve analiz etmek için yararlıdır. Ayrıca, SerialEM yazılımı için EFTEMSerialEM komut dosyası, bu noktaların her birinde enerji filtreli elektron mikrografı elde etmek amacıyla, bir bütün ultra ince bölüm içinde edinme noktalarını rastgele seçmenize olanak tanır.
Komut dosyası rasgele bir dereceleme ile işaretlenmiş olanlardan kullanıcı tarafından önceden tanımlanmış bir dizi nokta seçti. Bir test mikrografı üreterek ve sınıf düzeylerini kontrol ederek, seçilen noktaların bölümün görünür bir bölümünde bulunup bulunmadığı kontrol edilerek, ızgara çubuklarına inen noktaları reddedilmiştir. İş akışının çoğu, kullanıcının en az etkileşimi ile komut dosyası tarafından işlendi.
Ancak, burada gösterilen örnek ile, SerialEM otomatik odaklama rutin için çok az ışık vardı. Bu nedenle, komut dosyası sahneyi her noktaya hareket ettirmez, odak ayarlandı ve bir temel harita demirden yapıldı. İlgi alanını dikkatle seçmek ve aynı sayıda örnekleme noktasının her ilgi alanına girmesini sağlamak önemlidir.
Numune hazırlamada kullanılan kimyasalların çoğunun zehirli olduğunu unutmayın. Bu yüzden bir laboratuvar önlüğü ve koruyucu eldiven giymek ve bir duman kapağı altında çalışmak.
