We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الحيوان المؤسسية في مؤسسة أبحاث سينسيناتي للأطفال. لهذه الدراسة، تم عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم من نخاع العظام من C57BL / 6 الفئران الفطرية الذين تتراوح أعمارهم بين 2-4 أشهر. الفرز الخلية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بعد تلطيخ BM مع صناع سطح مختلفة بما في ذلك النسب، ج كيت، هيئة السلع التموينية-1، واستخدمت Flt3 وCD34 لتنقية شهادة الثانوية العامة على أساس Lin- هيئة السلع التموينية-1 + ج + كيت Flt3 - CD34 - النابضة استراتيجية كما وصف بروتوكول قياسي قبل 8. تنبيه: وتستخدم عدة مواد كيميائية شديدة السمية أثناء هذا الإجراء. هذه هي سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد. يرجى ارتداء القفازات والملابس الواقية. العمل في غطاء الدخان بينما كان يعمل مع هذه المواد الكيميائية. 1. الخلايا، التثبيت، تلطيخ وقبل التضمين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوع 10000 الخلايا الجذعية المكونة للدم (باستخدام لين - هيئة السلع التموينية-1 <suص&gt; + ج + كيت Flt3 - CD34 - النابضة الاستراتيجية؛ السكان LT-شهادة الثانوية العامة) في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge تحتوي 600 ميكرولتر التعديل Dulbecco Iscove لوالمتوسطة (IMDM) مع 10٪ مصل بقري جنيني باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار HSCs فرزها في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل باستخدام جهاز للطرد المركزي مع دلاء أرجوحة بها. إزالة المتوسطة من قبل التطلع لطيف وترك 200 ميكرولتر المتوسطة في أنابيب في كل خطوة. في هذه المرحلة، لا يزال بيليه خلية غير مرئية في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.2 مل من محلول تثبيتي 2X في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة 1،9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحل تثبيتي الطازجة قبل استخدامها. في 1X، ويتألف الحل من 3٪ امتصاص العرق و 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 م العازلة كاكوديلات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية باستخدام أجهزة الطرد المركزي مع دلاء البديل التدريجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 600 ميكرولتر من العازلة 0.1 M كاكوديلاتباستخدام الطرد المركزي وترك العازلة 200 ميكرولتر في الأنبوب بعد الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الخلايا الثابتة بإضافة 200 ميكرولتر من 2 ملغ حل / مل من إيفانس الأزرق في المخزن كاكوديلات واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. سوف تكون ملونة الخلايا الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع 600 ميكرولتر من 0.1 M عازلة كاكوديلات باستخدام الطرد المركزي وترك العازلة 200 ميكرولتر في الأنبوب في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في 200 العازلة ميكرولتر ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 0.5 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة باستخدام جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول. إزالة العازلة بلطف من دون إزعاج الآن مرئية بيليه خلية صغيرة، وترك عازلة 50 ميكرولتر في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ملغ انصهار منخفضة الاغاروز إلى 5 مل من 0.1 M عازلة كاكوديلات في أنبوب 15 مل عن حل الاغاروز 4٪. إذابة الاغاروز عن طريق نقل أنبوب إلى الماء المغلي في زجاجة 100 مل والحفاظ فاتر حتى استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ انصهار منخفضة حل الاغاروز في 0.1 M cacodylaالشركة المصرية للاتصالات عازلة لتعليق الخلية في أنبوب 0.5 مل وعلى الفور أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية باستخدام أعلى الجدول الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التأكد من أن الخلايا مكعبات في الجزء السفلي من أنبوب 0.5 مل في الاغاروز شبه صلبة بعد الطرد المركزي، ونقل على الفور الأنبوب إلى 4 درجات مئوية أو الثلج لمدة 20 دقيقة لترسيخ الاغاروز. هذه الخطوة هي حرجة للغاية، وبيليه خلية مرئية صغير في هذه النتائج خطوة في كتلة جيدة من الخلايا تحت المجهر الالكتروني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الاغاروز طدت تحتوي على بيليه خلية من الأنبوب إلى 35 مم البلاستيك طبق بتري تحتوي العازلة باستخدام 27 إبرة G 3،10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم الاغاروز المتصلبة التي تحتوي على بيليه خلية في قطعة واحدة من حوالي 1-2 ملم مع مشرط. نقل قطعة الاغاروز التي تحتوي على بيليه الخلية إلى أنبوب 1.5 مل جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 2-3 مرات باستخدام 600 ميكرولتر من العازلة 0.1 M كاكوديلات عن طريق إضافة وإزالة العازلة باستخدام ماصة دون الطرد المركزي. استخدام هذه القطعة الاغاروز التي تحتوي على بيليه خلية للخطوة التالية. في هذه الخطوة، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. </li></ol> 2. المعاملة بالأوزميك، الجفاف، تضمين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المنطقة العازلة كاكوديلات من أنبوب 1.5 مل مع بيليه الخلية التي تحتوي على الاغاروز باستخدام ماصة. إضافة 1.0 مل من 1٪ أكسيد الأوزميوم الثماني (أوسو 4) حل في غطاء الدخان، واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات مع 600 ميكرولتر من 0.1 M عازلة كاكوديلات ونقل العينة إلى 20 مل الزجاج التلألؤ قنينة مع غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة عينة من الجفاف، تسلل وتضمينها في الراتنج (على سبيل المثال، LX-112) مع تغييرات المسلسل من الحلول التالية في لوحة 6 جيدا. نقل الاغاروز قطعة خلية بيليه باستخدام ملقط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في 25٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في 50٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في 75٪<html> الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في 95٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الإيثانول بنسبة 100٪ في RT لمدة 15 دقيقة، مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (3: 1) في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (1: 1) في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (1: 3) في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الراتنج النقي في RT لمدة 60 دقيقة، مرتين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينة إلى الجزء السفلي من الهرم طرف العفن على شكل المطاط باستخدام ملقط بعناية وإضافة الراتنج أكثر نقاء على رأس عينة لملء القالب. احتضان العينة على 60 درجة مئوية لمدة 72 ساعة للبلمرة الراتنج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هرم راتنج بلمرة من القوالب قبل التواء في قالب من المطاط. وينبغي أن تكون كتلة سوداء صغيرة من الخلايا مرئية في هرم راتنج بلمرة، كما هو موضح سابقا 7. إرفاق هرم راتنج بلمرة على اسطوانة تصاعد استخدام cyanoacrylate. </li></ol>معشوقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. باجتزاء ونقل المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم كتلة الهرم بشفرة حلاقة وسكين الماس بعد تصاعد كتلة على مشراح-فائقة. جعل قصيرة شكل شبه منحرف واسعة مع الجزء العلوي والجزء السفلي من كتلة موازية لبعضها البعض، ومع الجانبين الزاوية بالتساوي. هذا الشكل من الهرم يساعد لباجتزاء المسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعلاوة على ذلك، وتقليم كتلة حول الخلية بيليه مع سكين الماس وإزالة الأجزاء البلاستيكية حول الخلية بيليه الاغاروز قطعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 1 ميكرون المقاطع باستخدام وسيلة مشراح جدا. نقل 1 ميكرون المقاطع من قارب الماء لشريحة زجاجية باستخدام أداة رمش وأداة حلقة معدنية كما ذكرت سابقا 7. نقل المقاطع على الشرائح والشرائح نقل إلى صفيحة ساخنة (37 درجة مئوية) لمدة التجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من طولويدين حل الأزرق إلى أقسام باستخدام حقنة مجهزة 0.22 ميكرون تصفية واحتضان لمدة 3 دقائق. شطف الشرائح مع الماء المقطر ولوآخرون الأقسام تجف. تحقق مع المجهر الضوئي لتحديد موقف من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المقاطع رقيقة جدا (70-100 نانومتر) باستخدام سكين الماس. نقل 2-3 أقسام على شبكات 200 شبكة من القارب المياه إلى طبق بيتري الزجاج باستخدام أداة رمش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الزجاج طبق بتري تحتوي على شبكات مع أقسام لوحة الساخنة عند 30 درجة مئوية لتجف أقسام لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على شبكات مع قطرات من 1٪ خلات اليورانيل في RT لمدة 10 دقيقة ثم يشطف في الماء المقطر 6-8 مرات. وصمة عار مع رينولدز يؤدي سيترات، في RT لمدة 5 دقائق ويشطف في الماء المقطر 6-8 مرات. نقل الزجاج طبق بتري تحتوي على شبكات لوحة الساخنة عند 37 درجة مئوية لتجف أقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المقاطع باستخدام المجهر الإلكتروني، في 80 كيلو فولت 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تمكن هذه الطريقة تحليل تيم على أرقام الهواتف المحمولة المنخفضة، باستخدام ايفانز تلطيخ الأزرق والاغاروز التضمين في توطين بيليه خلية صغيرة خلال الجفاف، التضمين الراتنج والعمليات باجتزاء. الأهم من ذلك أنها تحتفظ مجموعات الخلايا معا، ويحافظ على الخلية فائقة هيكل، الذي أمر مرغوب فيه لفحص خلايا متعددة لتقدير حجم البيانات. في دراسات تيم، بيليه الخلية التي تحتوي ملايين الخلايا في كثير من الأحيان اللازمة لالغرز كفاءة إلى الاغاروز / الجيلاتين المصفوفة ولغسيل والجفاف وتسلل إلى الحصول على بيانات من خلايا عديدة. وقد اعتمد الباحثون تجميد تعليق خلية في راتنج بلمرة BSA-bisacrylamide، وتلطيخ للالطبقات الوحيدة على دعم رقيقة، أو cytospins لتحليل تيم على أرقام الهواتف المحمولة منخفضة / عينات نادرة 4-6. ومع ذلك، فإنه لا يزال مهمة شاقة في توطين وقطع الخلايا تحت TEM بسبب توزيع متفرق من الخلايا داخل المصفوفة والتعديلات المحتملة للمورفولوجيا الخلايا، وذلك بسبب انتشار والانقسام بين الخلايا أثناء إعداد cytospin التي غالبا ما يتطلب إعادة تضمين قبل باجتزاء. وعلاوة على ذلك، لا يزال أحادي الطبقة الصعبة للتوطين لباجتزاء 11. وهكذا، فإن بيليه الخلية حتى من العينات البيولوجية النادرة من عدد الخلايا منخفض هو أسهل بكثير لتحليل تيم 1. ويمثل هذا الأسلوب ميزة كبيرة لأساليب نشرت السابقة 4،5 من حيث تحليل فائقة الهيكلي النوعي والكمي من عينات محدودة. معا، ويصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لتوطين الكريات خلية لتيم ايفانز باستخدام اللون الأزرق، مما يجعل تجهيز العينات من أرقام الهواتف المحمولة منخفضة سهلة للتيم لتمكين تحليل البيانات النوعية والكمية. عادة، وإعداد نموذج لتيم يتطلب عددا أكبر من الخلايا مما هو مطلوب عادة لالمجهر الضوئي، نظرا للخطوات متعددة في تجهيز العينات وأو تيم والتوجيه السليم للزنزانة لقطع في المكان المناسب 1،10. ومن المعروف أن بعد تثبيت المعاملة بالأوزميك توفر أفضل النقيض من ذلك في الصور، ولا سيما تلك الأغشية وجزيئات الجليكوجين تحت مجهر الكتروني 9، ومزيد من تلطيخ الدعم مع خلات اليورانيل، وصمة عار نسبيا غير محددة للبروتينات، ويؤدي سترات أن البقع الأغشية، والأحماض النووية والجليكوجين. ومع ذلك، المعاملة بالأوزميك يكاد يكون من المستحيل لأداء مع العينات البيولوجية النادرة في تعليق بعد ما قبل التضمين في جيش صرب البوسنة-BA بسبب احتمال كبير لخسارة عينة خلال باجتزاء وسواد المصفوفة. وهكذا نوعية من الميكروسكوب الإلكتروني تعرض للخطر في دراسات سابقة 4،9. هنا أدت المعاملة بالأوزميك إلى سواد بيليه الخلية مع تغيير طفيف في لون الاغاروز. وبالتالي، يسمح هذا البروتوكول المعاملة بالأوزميك بعد قبل التضمين في الاغاروز من أجل توفير النقيض جيدة في تيم ايمالأعمار. وكانت مجموعات الخلايا من السهل جدا لتحليل مع المجهر الإلكتروني باستخدام هذا الأسلوب. ساعد تلطيخ قبل مع ايفانز الأزرق في توطين الكريات خلية صغيرة أثناء إعداد العينات دون أن يؤثر تفاصيل خلية فرعية العضيم. ويوفر هذا الأسلوب نهجا بديلا لإعداد نموذج لأداء بنجاح تحليل تيم من أرقام الهواتف المحمولة منخفضة. في هذه الطريقة، تم إجراء التحليل تيم فعال باستخدام الخلايا صغيرة الحجم (5-8 ميكرون). وبالتالي، يمكن بسهولة أن تعتمد هذا النهج حتى مع انخفاض عدد الخلايا (~ 1000 الخلايا) من الخلايا الكبيرة مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية. على الرغم من إيفانس الأزرق لم تؤثر تفاصيل خلية فرعية العضيم في هذه الدراسة، لم يتم اختباره استخدام ايفانز الأزرق للالمناعية الذهب المجهر الإلكتروني مع أرقام الهواتف المحمولة منخفضة. معا، وصفت وسيلة فعالة لإعداد العينات لإجراء دراسات تيم من عدد الخلايا منخفضة. ويتطلب إجراء دراسات تيم للكشف حرجةمعلومات ل على التشكل وهياكل جدا من الخلايا. وبالتالي، معلومات فائقة الهيكلية في كثير من الأحيان في عداد المفقودين في مختلف السكان الخلية نادرة. وهذا البديل ونهجا جديدا لإعداد العينات تكون مفيدة لإجراء دراسات تيم من أية مجموعة من السكان الخلية نادرة. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا الأسلوب البيانات الكمية والنوعية من تحليل مجموعات الخلايا. كما يقدم المجهر الإلكتروني تفاصيل غير مسبوقة للخلية فائقة هيكل وتنظيم، وسوف تكون هذه الطريقة مفيدة جدا لفهم العديد من العمليات البيولوجية على المفتاح، ولكن نادر، سكان الخلية.

وقد تم كشف النقاب عن تفاصيل فائقة الهيكلية وشبه العضيم بصفة أساسية من الخلايا بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (تيم) دراسات من الأنسجة أو الكريات خلية 1،2. القطع الصلبة من أنسجة يمكن استخدامها بسهولة للدراسات المجهر الإلكتروني. ومع ذلك، تيم يحلل 1،3 على الخلايا في تعليق تظل صعبة وتتطلب أعداد الخلايا عالية، أي الملايين من الخلايا. وبسبب هذا، تحليلات فائقة الهيكلية للسكان الخلية نادر في التعليق، وعلى سبيل المثال، الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يتم تقييمها بسهولة. فشلت محاولات متعددة لتحليل تيم من العينات النادرة باستخدام cytospin أو أحادي الطبقة النهج للحصول على بيانات كمية كبير من عدد محدود من الخلايا. وهكذا، فإن اشتراط وجود عدد الخلايا عالية يحد من استخدام هذه الأداة القوية لفهم تفاصيل التركيبية التحت خلوية من السكان الخلية نادرة. والقيد الرئيسي للدراسات تيم مع عدد محدود من الخلاياالصورة في تعليق هو توطين الخلايا للمعالجة، وبالتالي، لا تزال الدراسات تيم من خلايا محدودة مع بخاصة الأحجام الصغيرة الصعبة. وقد تم اعتماد عدة أساليب بديلة لمواجهة هذا القيد: جيش صرب البوسنة / bisacrylamide (BSA-BA) البلمرة بوساطة من تعليق خلية، وتلطيخ الخلايا مع صبغة لجعلها مرئية على دعم رقيقة بما coverslips، وتيم يحلل من الاستعدادات cytospin 4-6. ومع ذلك، تم تحقيق نجاح محدود جدا، كما تم العثور على عدد قليل جدا من الخلايا في الفروع بعد فائقة باجتزاء. التحدي الرئيسي المتمثل في تحديد الخلايا المتفرقة استمرت لأحادي الطبقة الخلية لا تزال في معظمها غير مرئية في هلام طدت لباجتزاء. وعلاوة على ذلك، وإعداد cytospin من الخلايا قد يغير منظمتهم الخلوية بسبب انتشار الخلايا وهشاشة بنية الخلية. وبالتالي، هذه العيوب المتأصلة تستدعي نهجا جديدا لإجراء دراسات تيم من السكان الخلية نادرة مع أكثرالتناسق. للتغلب على هذه المشكلة، التي وصفناها رواية وعينة بديلة طريقة التحضير للدراسات تيم من السكان الخلية نادرة 7. هنا، نحن الإبلاغ عن كفاءة بروتوكول إعداد نموذج لأداء تيم من العينات البيولوجية النادرة مع النتائج النوعية والكمية متسقة. تم إجراء ايفانز تلطيخ الأزرق بعد تثبيت لتوطين بيليه خلية صغيرة من الخلايا انخفاض عدد، أي 10000 نخاع العظم الجذعية المكونة للدم والخلايا الاولية التي لولاها بقيت غير مرئية، وكان جزءا لا يتجزأ من بيليه إلى الاغاروز قبل عمليات الجفاف والراتنج التضمين. هذه الطريقة مجموعات الخلايا معا، ويمكن تحليل كفاءة التركيب الدقيق وتنظيم التحت خلوية من الخلايا الجذعية المكونة للدم (يدعى لين - هيئة السلع التموينية-1 + ج كيت + Flt3 - CD34 -، شهادة الثانوية العامة)، نادر 0.2 - السكان الخلية 0.5٪ في نخاع العظام. هذا الموالية التجريبيtocol يمكن أن تكون مفيدة لإجراء دراسات فائقة الهيكلية والحصول على النتائج الكمية على العديد من السكان نادر لكنه مهم للغاية.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>15713</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>16350</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Cacodyladate buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 &amp;deg;C. &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td></tr><tr><td>Evans Blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; stock, &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LX-112 Embedding Kits (LADD&amp;reg;)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Uranyl acetate (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composition: NaCl, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Pyramid tip mold&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>mounting cylinders</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome&amp;nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mesh grids (nikil)</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>Hitachi model H-7650&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image capture engine software</td><td>AMT-600&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic Petri dishes</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eyelash tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Loop tool&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) على تفاصيل تنظيم الخلوية والتركيب الدقيق. ومع ذلك، وتحليل تيم من السكان الخلية نادرة، وخاصة الخلايا في تعليق مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يزال محدودا نظرا لاشتراط وجود عدد الخلايا عالية أثناء إعداد العينات. هناك عدد قليل من cytospin أو أحادي الطبقة نهج لتحليل تيم من عينات نادرة، ولكن هذه الأساليب تفشل في الحصول على بيانات كمية كبيرة من عدد محدود من الخلايا. هنا، يتم وصف نهج بديل ورواية لإعداد العينات في الدراسات تيم لسكان الخلية النادرة التي تمكن من تحليل الكمي. عدد الخلايا منخفضة نسبيا، أي 10000 HSCs، وقد استخدمت بنجاح لتحليل تيم مقارنة ملايين الخلايا التي تستخدم عادة لدراسات تيم. على وجه الخصوص، تم تنفيذ ايفانز تلطيخ الأزرق بعد امتصاص العرق، غلوتارالدهيد (PFA-GA) تثبيت لتصور ااا خلية صغيرةالسماح، الأمر الذي سهل مبنية الاغاروز. وقد لوحظت مجموعات من الخلايا عديدة في قطاعات رقيقة جدا. كانت الخلايا التشكل الحفاظ عليها بشكل جيد، وكانت التفاصيل فائقة الهيكلية للالميتوكوندريا جولجي المعقدة وعدة مرئية. يسمح هذا البروتوكول كفاءة، وسهلة وقابلة للتكرار تحضير عينات من عدد الخلايا منخفضة، ويمكن استخدامها لتحليل تيم النوعي والكمي على السكان الخلية نادرة من العينات البيولوجية محدودة.

بروتوكول فعال وثابت لإعداد نموذج لأداء تحليل تيم من يوصف انخفاض عدد الخلايا. ساعد بعد تثبيت تلطيخ مع ايفانز الأزرق ونقل الخلايا إلى أنبوب 0.5 مل microcentrifuge لتصور بيليه خلية صغيرة 7. المعاملة بالأوزميك مع tetraoxide الأوسيميوم في الاغاروز أدى إلى سهولة اكتشاف من بيليه الخلية الظلام خلال الجفاف والتضمين. وأكدت أقسام شبه رقيقة من الكتل التي تحتوي على خلية بيليه الصغير مجموعة من خلايا عديدة معا (الشكل 1A و 1B). قطعت أقسام رقيقة جدا من منطقة عنقودية خلية وتحليلها تحت المجهر الإلكتروني (الشكل 1C). التشكل وبنية فوقية من هذه الخلايا تم الحفاظ عليها بشكل جيد (1D الشكل). وأظهرت صورة مجهرية الإلكترون من الخلايا الفردية تفاصيل عالية على داخل الخلاياهياكل جدا (الشكل 1E). وعلاوة على ذلك، أظهرت ارتفاع التكبير (50،000X) صور هيكل المحفوظة جيدا وسلامة عضيات شبه الخلوية، مثل الميتوكوندريا (الشكل 1F). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54724/54724fig1.jpg" /> الشكل 1: صورة تحليل تحت الضوء والمجهر الإلكتروني. (A) منخفضة صورة التكبير من حقل الممثلين طولويدين القسم الملون الأزرق من 1 ميكرون سمك تحت المجهر الضوئي. (ب) ضوء صورة المجهر تبين التشكل سليمة من الخلايا في الكتلة بعد طولويدين تلطيخ الأزرق من 1 ميكرون سمك الباب. (ج) المجال الشامل من الكتلة خلية لاحظ تحت المجهر الالكتروني بعد تلطيخ مع خلات اليورانيل ويؤدي سترات (D) وحيد LT-شهادة الثانوية العامة تحت المجهر الالكتروني (E) magnif العاليصورة ication من شهادة الثانوية العامة تبين الهياكل التحت خلوية. (F) ارتفاع صورة التكبير من الميتوكوندريا من HSPC. شريط النطاق: A / B، 100 ميكرون. C، 10 ميكرون. D، 2 ميكرون. E / F، 500 نانومتر. &#160; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54724/54724fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis at JoVE.com

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

Video: An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

Engineering

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers of multi-layered samples. This removal of layers prior to plunge freezing can aid in reducing sample thickness to a level suitable for cryo-EM data collection, improving sample flatness, and facilitating image processing. The peel-blot technique allows for the separation of multilamellar membranes into single layers, of layered 2D crystals into individual crystals, and of stacked, sheet-like structures of soluble proteins to likewise be separated into single layers. The high sample thickness of these types of samples frequently poses insurmountable problems for cryo-EM data collection and cryo-EM image processing, especially when the microscope stage must be tilted for data collection. Furthermore, grids of high concentrations of any of these samples can be prepared for efficient data collection since sample concentration prior to grid preparation can be increased and the peel-blot technique adjusted to result in a dense distribution of single-layered specimen.

The peel-blot technique is a cryo-EM grid preparation method that allows for the separation of multilayered and concentrated biological samples into single layers to reduce thickness, increase sample concentration, and facilitate image processing.

تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Biochemistry

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

تحسين تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني المبرد

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

نهج غير منحازة لأخذ العينات الأقسام تيم في علم الأعصاب

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Neuroscience

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

<meta charset="utf8"></head><body>البروتوكول الأمثل لإعداد عينة الشبكية العضوية ل TEM

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>تسليط الضوء على المؤلف: تحليل البنية التحتية المتشابكة في عضويات الشبكية الناضجة باستخدام TEM

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

تحضير عينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

تحسين تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني المبرد

نهج غير منحازة لأخذ العينات الأقسام تيم في علم الأعصاب

البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

تحضير عينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ

تحضير عينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ

تحضير عينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني