Biz proje üzerinde kendi yardım için M. Channey, E. Chau, ve K. Tomas teşekkür ederiz. Proje malzemeleri kısmen California Polytechnic State Üniversitesi tarafından finanse edilmiştir.

1. Medya ve Mikrobiyal Suşlarının Kültürleme NOT: Tüm deneylerde kullan aseptik teknikler. Steril malzemeler kullanıyoruz. Kullanmadan önce tüm kaplar, alet ve reaktifi sterilize edin. biyolojik tehlikeye kabul edilir çünkü atmadan önce tüm atık maddeleri otoklavlayın. aşağıdaki prosedürleri için otoklav sıcaklık ve zaman kombinasyonu ≥121 ° C x ≥15 dk. <ol><li> ~ 1-L triptik soya agar (TSA) yapmak için, önce bir manyetik karıştırma çubuğu içeren 2 L&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içinde deiyonize su 1 L ilave edin. nihai hacim daha az iki kat daha büyük olan bir şişeyi kullanarak. triptik soya suyu tozu 30 g ve şişeye granüller agar 20 g ekleyin. NOT:% 2 ağar yerine% 1.5 bazı Vibrio spp swarming sınırlamak için. <ol><li> karıştırıcı açarak iyice karıştırın. Karıştırılırken, karışımın kaynamasına ısı açın. Karışım kaynamaya başlar kısa sürede ısıtıcı şişeyi çıkarın. Gevşek inci kapakBir kalay folyo ile e şişesi. otoklav önce balona sabitlemek için folyoyu bantlayın. </li><li> triptik soya suyu (TSB) yapmak için, adım 1.1 tarifi agar atlayabilirsiniz. NOT: yerine Erlenmeyer şişesinde şişe kullanabilir miyim. </li><li> % 2 sodyum klorür ya da NaCI (TSA&#39;lar) ile desteklenmiş triptik soya agar yapmak için, önce, karıştırma ve ısıtma karışımın NaCl 20 g ekleyin. % 2 NaCI (TSBs) ile desteklenmiş triptik soya suyu yapmak için, agar ihmal önceden karıştırma ve ısıtma karışımın NaCl 20 g ekleyin. </li></ol></li><li> , Beyin kalp infüzyon (BHI) agarı hale BHI tozu 37 g saf su, 1 L 15 gr agar granüller askıya almak için. sık ajitasyon ile ısı tozu çözmek için. Otoklav. BHI suyu yapmak için agar atlayın. </li><li> , TCBS agar hale saf su, 1 L TCBS tozu 89 g askıya almak için. 1 dakika boyunca sık sık ajitasyon ve kaynatın ile ısı tamamen tozu çözmek için. otoklavlamayın. </li><li> Tüm ağar ortamlar için, 45-5 sıcak agar serinBir su banyosu içinde 0 ° C ile. beş-altı plakalar yığınlarının boş Petri plakaları düzenleyin. yığının altından başlayarak, yaklaşık yarım dolu ulaşmak için her Petri plakasına erimiş agar dökün. döküldükten sonra Petri plaka kapağını kapatın. agar plakaları oda sıcaklığında oturup izin vererek katılaşmaya izin verin. <ol><li> Agar plakaları ertesi gün ya da 12 saat sonra kullanın. iki haftaya kadar buzdolabında kullanılmayan tabak saklayın. Kullanımdan önce, buzdolabı plakaları kaldırmak ve en az 15 dakika boyunca oda ısısında dengeye. NOT: Bir litre agar ~ 45 agar plakaları yapar. Agar plakaları hazırlama gününde, yeterli miktarda kurumasına ve etkili bir şekilde koloni yayılmasını azaltmak için, soğuk depolamadan sonra, oda sıcaklığına kadar bunları dengelenmeye gelmeye bırakın. </li></ol></li><li> Çikolata ve kromojenik agar elde edilir ve her bir deney öncesi oda ısısında dengeye. </li><li> Tablo 1&#39;de her birkaç da gösterilen 54 mikrobiyal suşları altkültürüys. <ol><li> donmuş bir hisse senedi veya böyle BHI, TSB / TSA veya çikolata agar olarak seçici olmayan medya bir önceki partiden kültürleri aktarmak için steril bir aşılama döngü kullanın. Halofilik Vibrio spp büyütün. TSBs / TSA&#39;larm üzerinde. </li><li> kültür saflığını kontrol etmek için, çizgi izole kolonilerin gözlem için izin verecek bir desen tüm suşlar. Örneğin, en sonunda izole koloniler veren, daha az miktarda bakteri büyük miktarda seyreltik üç fazlı bir çizilme kalıbı kullanın. </li></ol></li><li> kadar 48 saat süreyle 35-37 ° C&#39;de plakalar baş aşağı inkübe edin. Campylobacter spp., Tüpler veya plakalar inkübe Bir gaz keseyi içeren bir kapalı kapak kavanoza bir mikroaerofilik bir ortam oluşturmak için. kuluçkadan sonra koloni morfolojisi gözlemleyin. Saf kültürler benzer koloni morfolojisi sergileyen koloniler boyun eğmek zorundadır. NOT: col üzerine düşen kapağın alt kısmında oluşan yoğunlaşmış su damlacıkları önlemek için tüm plakaları baş aşağı inkübeonies. </li></ol> PCR ile 2. Türler Belirlenmesi <ol><li> V. kimliğini doğrulamak için tlh -PCR Davranış parahaemolyticus suşları. Kullanım primerleri -F (5 &#39;AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3&#39;) ve tlh-R (5 &#39;GTT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3&#39;) termal olarak hemolisin geni 20 bir 450-bp fragmanı amplifiye etmek için tlh . <ol><li> Her V. birkaç izole koloniler aktarmak için steril bir aşılama döngü kullanın TSA&#39;lar ile ilgili TSBs 5 ml parahaemolyticus soyu. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj kültürleri 1 dakika için 14,000 x g&#39;de. Süpernatantı ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez pelet yıkayın. Hücre lizatı elde etmek için 3 dakika boyunca bir süspansiyon kaynatılır. NOT: V. parahaemolyticus lize edilmesi kolaydır. Bu nedenle, liziz reaktifi gerekli değildir. Şablon olarak doğrudan koloni biraz kullanmak da mümkündür. </li><li> 25-ul reaksiyon v PCR gerçekleştirinolume. 1x PCR tampon maddesi bir son konsantrasyon, 1.5 mM MgCl2, her dNTP, 100 uM, her bir primerden 1 uM, 1 U Taq polimeraz ve hücre lizatı 1 ul ihtiva eden bir reaksiyon karışımı hazırlandı. 30 saniye, 30 saniye için 58 ° C, 60 saniye 21 ° C 72 94 ° C&#39;de 35 amplifikasyon döngüleri çalıştırmak 5 dakika boyunca 94 ° C&#39;de ön-kuluçka sonrası. </li><li> % 1.5 agaroz jelleri içinde 5-il amplikon yük alikotları. elektroforez başlatmak için güç kaynağı açın. etidyum bromid boyama işlemi sonrası UV ışıması altında amplikonların varlığını ya da yokluğunu görselleştirme. </li></ol></li></ol> Seçici ve Diferansiyel Medya 3. Büyüme <ol><li> Iki ila dört gün önce deney, çizgi koloni izolasyonu için seçici olmayan ortam (TSA&#39;lar BHI veya çikolata agar) Tablo 1 &#39;de gösterilen tüm mikrobiyal soylar. 48 saat boyunca 35-37 ° C&#39;de inkübe edin. kuluçkadan sonra koloni morfolojisi gözlemleyerek kültürleri saflığını kontrol. Saf kültürler benzer koloni morfolojisi sergileyen koloniler boyun eğmek zorundadır. </li><li> suyu 5 ml Aşama 3.1 birkaç izole koloniler aktarın. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: en az dört gün geçmiş kullanın genç koloniler, tüm deneylerde gecede kültürleri hazırlamak. </li><li> Streak koloni izolasyonu için seçici ve diferansiyel medya (TCBS ve kromojenik agar) gecede kültürlerin bir öze. 96 adete kadar saat 35-37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> plaka üzerinde kültür yoğunluğu ve izole kolonilerin boyutunu hem de inceleyerek tüm suşlar genel büyüme kaydetmesi. çevre sıcaklığı ve / veya UV ışığı altında Kolonilerin rengi kaydedin. Böyle yükseklik, kenar boşluğu ve form olarak izole koloninin diğer özelliklerini unutmayın. </li></ol> 4. Kurtarma Testi <ol><li> V. temsili bir alt kümesini seçin parahaemolyticus suşları farklı serotipler ve izolasyon kaynağını kapsamaktadır (n = 14) <s&gt; 22 kadar. TSBs 5 ml plakaları genç kültürlerin aşılanmasında. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> aşağıda tarif edildiği gibi bir gecede kültürlerin bir standart Plaka Sayısı yöntemini yürütün. <ol><li> Vortex iyice gecede kültürleri karıştırın. 900 ul PBS içeren bir tüp içine gecelik kültüründen 100 ul aktarılarak 10 kat veya 10 -1 seyreltme sağlayın. Vortex iyice karıştırın. </li><li> 900 ul PBS içeren başka tüpe 10 -1 seyreltme tüpünden 100 ul aktarmak için yeni bir pipet ucu kullanın. Vortex iyice karıştırın. Bu 10 -2 seyreltme oluşturmaktadır. 10 -7 seyreltme elde etmek için işlem sırayla tekrarlayın. </li><li> 10 -4 -7 10 seyreltme tüpleri kullanarak, kromojenik, TCBS ve TSA&#39;larm agar plakaları üzerinde 100 ul her plaka. NOT: plaka üzerinde seyreltme faktörü (df) 10 -5 sırasıyla -8 ila 10 olur. </li><li> t eşit hacimde yaymakO yüzeye ağar. NOT: Bu en seyreltilmiş kısım ilk yayılır sürece, aynı ortamda suş başına aynı serpme kullanmak gayet (yani, 10 -8 -5 10 ila). Farklı ortamlar için aynı dağıtıcısı kullanmayın. </li><li> 96 adete kadar saat 35-37 ° C&#39;de inkübe edin. plakalar üzerinde koloniler sayın. çok saymak çok sayıda (TNTC) ya da / ml aşağıdakilere göre 25. hesaplayın CFU az olan koloniler taşıyan plakaları görmezden: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Nerede N, seyreltilmemiş bir tüp içinde hücre sayısı = / g CFU / ml veya CFU olarak bahsedildi C 25-300 koloni taşıyan plakalar üzerinde sayılan koloni sayısını = n, 1 sayılan koloniler düşük df olan plaka (lar) sayısı = n, 2 sayılan koloniler daha sonra 10-kat seyreltme vardır plaka (lar) sayısı = df alt seyreltme faktörü = (yani, daha konsantre seyreltme) </li></ol></li><li> Farklı medya arasında CFU / ml karşılaştırın. % 100 olarak TSA&#39;larda CFU / ml kullanın V.% kurtarma hesaplamak parahaemolyticus Kromojenik ve TCBS-Agar kültür. </li></ol> 5. Rekabet Tahlili <ol><li> kromojenik ve TCBS agarda farklı koloni morfolojileri sergileyen soyların bir alt kümesini seçin. NOT: şekilde, koloniler V. kökenli saymak mümkün olacaktır aşı maddesi için başka türlerin mevcudiyetine rağmen, sadece parahaemolyticus. <ol><li> Bir V Seç sırasıyla, TCBS ve kromojenik agarda beklenen turkuaz ve mavi koloniler verir parahaemolyticus süzün. </li><li> Olmayan bir V seçin parahaemolyticus bu ortamın da büyür veya farklı koloni rengi sergilemeyen olmayan bir Vibrio türü. Not: Örneğin, V. metschnikovii o çok zayıf büyürn TCBS ve. kromojenik agarda büyümek değildi Shigella sonnei TCBS üzerinde büyüyecek ama kromojenik agarda kırmızı kolonileri verir vermez. </li></ol></li><li> Yukarıdaki suşların seçildikten sonra, seçici olmayan ortamda gelişen izole koloniler kullanarak bir gecede suyu kültürleri hazırlamak. <ol><li> V. gecelik kültürleri yapmak parahaemolyticus ve V. TSA&#39;lar ile ilgili TSBs 5 ml birkaç izole koloniler aktararak metschnikovii. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> BHI suyu 5 ml BHI agar birkaç izole koloniler aktarılarak Shigella sonnei gecelik kültürleri yapmak. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> her bir suş için Adımlar 4.2.1 ve 4.2.2 benzer bir seyreltme serisi yerine getirir. TSA&#39;larm veya BHI Plaka uygun dilüsyonları Adım 4.2.5 gösterilen denklem kullanılarak, gecede kültür CFU / ml belirlemek için. NOT: Genellikle, 10 -5 10 -7 seyreltme 100 ultüpler çoğu kültürler için çalışıyor. bir sonraki aşamada kullanılan hücreler tam miktarını hesaplamak geri CFU / ml değerleri kullanın. Aşağıdaki adımlar, Aşama 5.3 ile aynı tarihte gerçekleştirilir, ancak hesaplanan mi CFU / değerler, kuluçkadan sonra elde edilir. </li><li> Adım 5.2 ve 5.3 içinde gece boyunca kültürler ve seyreltme tüpleri kullanılarak, bir V farklı miktarlarda karıştırmak parahaemolyticus zorlanma ve olmayan bir V. parahaemolyticus türleri. Örneğin, V. 10 -5 seyreltme tüpünden 500 ul karışımı V. gece boyunca kültürler 500 ul parahaemolyticus metschnikovii. NOT: Bu karışım yüksek mikroflora arka plan taklit eder. Düşük mikroflora arka plan simüle iki türün 500 ul 10 -5 seyreltme tüpün her karıştırmak için. </li><li> kromojenik, TCBS ve TSA&#39;larm agar plakaları üzerinde karışımın 100 ul her yayıldı. </li><li> 35-37 ° C&#39;de inkübasyondan sonra 96 saat kadar V. kolonileri saymayın için parahaemolyticus ve olmayan V. kromojenik ve TCBS agarda büyüme ve koloni morfolojisi onların farkına dayalı parahaemolyticus türler. NOT: Örneğin, eğer olmayan V. parahaemolyticus türler tüm kolonileri V. olacak, kromojenik ve TCBS agarda büyümek değil parahaemolyticus. Olmayan V. ise parahaemolyticus türler hem medya yetişir, kromojenik agarda TCBS ve camgöbeği koloniler sadece turkuaz kolonileri V. olacak parahaemolyticus. Olmayan V. parahaemolyticus türler ya da V. benzer koloni morfolojisi sergilemek olmayabilir TSA&#39;larm üzerinde parahaemolyticus. <ol><li> Olmayan V. ise parahaemolyticus türleri V&#39;a Benzer büyür Bu seçici olmayan ortamda parahaemolyticus, V. numaralarını elde etmek için iki ile koloni sayısı bölmek Sadece parahaemolyticus. Adım 5.3 türetilen beklenen sayısı ile gerçek koloni sayısını karşılaştırın. </li></ol></li></ol> 6. Effİstiridye homojenatlarma ECTS <ol><li> et ve içki de dahil olmak üzere ≥12 mollusk kabuklu ≥50 g istiridye et tartılır. <ol><li> istiridye et ve içki PBS eşit miktarda ekleyin. 90 sn için yüksek hızda karışımı karıştırın. Bu 2 -1 seyreltilmiş istiridye Homojenat oluşturmaktadır. </li><li> PBS 400 g 2 -1 seyreltildi istiridye homojenat 100 g ekleyin. kilo değil, hacim ölçmek için bir ölçek kullanın. 1 dakika için yüksek hızda karışımı karıştırın. istiridye Homojenat Otoklav. NOT: Bu spiking için kullanılan istiridye Homojenat olacaktır. </li></ol></li><li> istiridye homojenat mevcudiyetinde kurtarma deneyi (Aşama 4) tekrar edin. <ol><li> 500 gr istiridye Homojenat soğuduktan sonra, V. 100 ul ekleyin buna TSBs yetiştirilen gecelik kültürler parahaemolyticus. V. gerçek miktarını belirlemek Adım 4.2 açıklanan Standart Plaka Sayısı prosedürleri yaparak inokulum olarak parahaemolyticus hücreleri. </li></ol></li><li> temsilciistiridye homojenat varlığında rekabet analizi (Aşama 5) yer. <ol><li> 500 gr istiridye Homojenat soğuduktan sonra, V. gecede kültürlerin her ul 100 eklemek parahaemolyticus ve olmayan V. buna parahaemolyticus. Bakteriyel gerçek miktarını belirlemek Standart Plaka Sayısı prosedürleri yaparak inokulum hücreler Adım 4.2 tarif </li></ol></li><li> iyi bir homojenleştirici kullanarak istiridye homojenat ile bakteri hücreleri karıştırın. NOT: karıştırıldıktan sonra, denir kasıtlı eklenen hücreleri içeren istiridye homojenat istiridye Homojenat çivili. </li><li> Çivili istiridye Homojenat seyreltileri Aşama 4.2.2&#39;de açıklanan prosedürlere göre 10 -1 -3 10 seyreltme tüpleri elde edilmesini mümkün kılar. Kromojenik, TCBS ve TSA&#39;lar agara her seyreltme oranından 100 ul yayıldı. 96 adete kadar saat 35-37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> eski ile kromojenik ve TCBS agarda gerçek koloni sayısını karşılaştırınbeklenmeyen koloni sayımı 6.2.1 ve 6.3.1 Adımlar çıkarılabilir. Not: Örneğin, V bir tüp parahaemolyticus Gece boyunca kültür 10 8 CFU / mL, 100 ul&#39;lik bir aşı 10 7 hücreleri 5 x 10 4 hücre / g, istiridye homojenat 500 g ilave edilir demektir içerir. Seyreltme ve sonra kaplama, plaka df sahip = 10 -2 500 koloniler vermelidir; Bu sahip df ise = 10 -3 50 koloniler boyun eğmek zorundadır. Bunlar beklenen koloni sayımı vardır. </li></ol>

<ol>
	<li>Yeung, P. S., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+pathogenesis,+and+prevention+of+foodborne+Vibrio+parahaemolyticus+infections.">Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections.</a> Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).</li><li>Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+molecular+biology,+and+detection+of+foodborne+Vibrio+parahaemolyticus+infections.">Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections.</a> Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).</li><li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+Signs:+Incidence+and+Trends+of+Infection+with+Pathogens+Transmitted+Commonly+Through+Food+-+Foodborne+Diseases+Active+Surveillance+Network,+10+U.S.+Sites,+1996-2010.">Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).</li><li>. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: <a target="_blank" href="https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591">https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591</a> (2008)</li><li>Scallan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foodborne+illness+acquired+in+the+United+States+-+major+pathogens.">Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens.</a> Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).</li><li>Baross, J., Liston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Vibrio+parahaemolyticus+and+related+hemolytic+vibrios+in+marine+environments+of+Washington+State.">Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State.</a> Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).</li><li>Baross, J., Liston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vibrio+parahaemolyticus+from+the+Northwest+Pacific.">Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific.</a> Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).</li><li>Kueh, C. S., Chan, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+bivalve+shellfish+with+special+reference+to+the+oyster.">Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster.</a> J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).</li><li>Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).</li><li>Qadri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+inflammatory+immune+responses+in+patients+infected+with+strains+of+Vibrio+parahaemolyticus.">Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).</li><li>MacFaddin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).</li><li>Bottone, E. J., Robin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus:+suspicion+of+presence+based+on+aberrant+biochemical+and+morphological+features.">Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features.</a> J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).</li><li>Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiosulfate-citrate-bile+salts-sucrose+agar+and+its+selectivity+for+clinical+and+marine+vibrio+organisms.">Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms.</a> Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).</li><li>Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+detection+of+Vibrio+parahaemolyticus+in+seafood.">Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).</li><li>Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+chromogenic+medium,+chromID+Vibrio,+for+the+isolation+and+presumptive+identification+of+Vibrio+choleare+and+Vibrio+parahaemolyticus+from+human+clinical+specimens.">Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).</li><li>Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Compact+Dry+VP+method+for+screening+raw+seafood+for+total+Vibrio+parahaemolyticus.">Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).</li><li>Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+and+specificity+of+a+chromogenic+medium+for+detecting+Vibrio+parahaemolyticus.">Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).</li><li>Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+total+and+hemolysin-producing+Vibrio+parahaemolyticus+in+shellfish+using+multiplex+PCR+amplification+of+tl,+tdh+and+trh.">Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh.</a> J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).</li><li>Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+assay+for+specific+detection+of+the+pandemic+Vibrio+parahaemolyticus+O3:K6+clone+from+shellfish.">A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish.</a> J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).</li><li>Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+phenotypic,+molecular,+and+virulence+characterization+of+Vibrio+parahaemolyticus+O3:K6+isolates.">Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).</li><li>Duan, J., Su, Y. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+chromogenic+medium+with+thiosulfate-citrate-bile+salts-sucrose+agar+for+detecting+Vibrio+parahaemolyticus.">Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).</li><li>Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+thiosulphate-citrate-bile+salt+sucrose+(TCBS)+agar+and+CHROMagar+Vibrio+for+isolating+Vibrio+parahaemolyticus.">Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus.</a> Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).</li><li>Canizalez-Roman, A., Flores-Villase&#241;or, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Le&#242;n-Sicairos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+a+chromogenic+agar+medium-PCR+protocol+with+a+conventional+method+for+isolation+of+Vibrio+parahaemolyticus+strains+from+environmental+and+clinical+samples.">Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples.</a> Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).</li><li>Kriem, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Vibrio+spp.+in+raw+shrimps+(Parapenaeus+longirostris)+and+performance+of+a+chromogenic+medium+for+the+isolation+of+Vibrio+strains.">Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains.</a> Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).</li><li>Food Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+guidance+on+reporting+results+from+studies+evaluating+diagnostic+tests.">Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests.</a> http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).</li><li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+laboratory-developed+molecular+assays+for+infectious+diseases.">Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases.</a> Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).</li></ol>

Some media were generously provided by Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA. Thorsen conducted this study while a student at California Polytechnic State University. He is currently an employee of Hardy Diagnostics.

Bu çalışma kültür ortamı geliştirilmesi ve değerlendirilmesi üzerinde duruluyor. Geleneksel olarak, TCBS olan seçici ve orta V izole ve tespit etmek için kullanılan diferansiyel parahaemolyticus, V. cholerae ve V. vulnificus 12. Ancak, kısıtlamalar gibi V. ayrım yapamama olarak, bu ortam için rapor edilmiştir Diğer Vibrio cholerae türlerden. Sakaroz ve pH göstergesi TCBS farklılaşması maddelerdir. Böylece, sukroz fermentasyon cihazı tarafından asit üretimi ortamının renk değişikliğine neden olur. bu koloni morfolojisi gözlem gizleyebilir, çünkü orta boyama TCBS bir dezavantajı. Yeni geliştirilen kromojenik ortamı birçok deniz örneklerde bulunan dışı Vibrio türlerinin gelişimini baskılamak için yüksek pH ve tuzluluk kullanmaktadır. Yeni kromojenik ortamı 8.6 ± 0.2 bir son pH değerine sahiptir. iyonu giderilmiş su litresi başına, bu pepton 10 g, deniz tuz karışımından 10 g, öküz safra 10 g sodyum, 10 g oluşmaktadırMaya ekstresi, 5 g, sodyum sitrat, 5 g sodyum karbonat, 2.2 g, laktoz, 2 g sodyum piruvat 0.5 g, kromojenik bir karışımı, 0.3 g agar 15 g tiyosülfat. Kromojenik karışımı Vibrio türleri arasında farklılaşma sağlar. ayırıcı yeteneklerine göre belli enzimler üretmek. Bunun yerine TCBS agar ortamında farklı Vibrio spp rengini değiştiren. Yeni kromojenik ortamda farklı koloni rengi sergiler olacaktır. Buna karşın, ticari olarak temin edilebilir kromojenik ortamı agar 15 g, pepton ve maya ekstresi 8 g, tuzların 51.4 g, 0.3 kromojenik bir karışımı g ve 9.0 ± 0.2 bir son pH içerir. bir deney değerlendirmenin sağlamlığı örneklem büyüklüğüne bağlıdır. Bu çalışmada yeni kromojenik ortamda etkinliğine vurgu beri yalıtmak ve V algılamak için parahaemolyticus, birçok farklı V. biriktirmek için önemlidir parahaemolyticus suşları. TCBS karşılaştıran Önceki çalışmalar veYeni kültür ortamları genellikle bilinmeyen türleri ve mikroorganizmaların 23,24,25,26 miktarını içeren çevresel veya gıda örnekleri çıkıyor. numune başına birden fazla koloniler izole edildi ancak izolatların klonal doğası genellikle belirsiz oldu. İdeal olarak, farklı suşları tahlil geliştirme test edilmelidir, aksi takdirde testin doğruluğu şişer. Gerilme kimliği gibi pulsed-field jel elektroforezi (PFGE) veya çoklu lokus sıralama gibi geleneksel alttiplendirmesi yöntemlerle tespit edilebilir. V. Bu çalışmada parahaemolyticus suşları daha önce Ribotyping ve PFGE 19 ile karakterize edilmiştir. Tahlil gelişimi sırasında, duyarlılık, seçicilik ve saptama limiti araştırılması için önemli faktörler arasında yer almaktadır. Ayrıca doğruluğu veya tanı duyarlılığı olarak da bilinen Hassasiyet, referans ve test yöntemleri arasında pozitif yüzde anlaşmadır. Ayrıca hassas veya teşhis özgüllüğü olarak bilinen Özgünlük, negatif yüzde ise<html> referans ve test yöntemleri arasında Greement. Sonuçlar farklı gruplar arasında doğrulandı, çünkü bu çalışmada, biz referans yöntem olarak PCR bazlı yöntem kullanılır. TCBS ve kromojenik medya test yöntemleri vardı. Hassasiyetini belirlemek için, V. sonucu parahaemolyticus suşları kullanıldı; yani Hassasiyet =% 100 x True Pozitif / (Gerçek Pozitif + Negatif False). Öte yandan, dışı V. sonucu parahaemolyticus suşları özgüllüğünü belirlemek için kullanıldı; ve dolayısıyla, Özgünlük =% 100 x True Negatif / (Doğru Negatif + Yanlış Pozitif). Daha güvenilir özgüllük sonuçlar sağlamak için, sivil V. parahaemolyticus suşları örnekleme yapılacaktır bir ortamdan izole edilmelidir. Bizim duyarlılık ve özgüllük hesapları tahlil geliştirme ve doğrulama ile ilgili bir konuda hükümete 27, akademi 28 ve bilimsel organizasyon 29 tarafından yazılı belgeler dayanmaktadır. nt &quot;&gt; bizim sonuçlara dayanarak, kromojenik ortam V. parahaemolyticus belirlenmesinde TCBS daha iyi performans gösterdi. referans yöntem ve kromojenik ortamda arasındaki genel yüzde anlaşması referans yöntem ve TCBS arasında% 77.8 oranla,% 94.4 olduğunu. kromojenik orta duyarlılık ve özgüllüğü TCBS (% 86,4 ve% 71.9, sırasıyla) göre daha yüksek olduğu, sırasıyla% 90.9 ve% 96.9 bulunmaktadır. V. parahaemolyticus tespiti için diğer kromojenik medya değerlendiren Önceki çalışmalar hassasiyetleri değiştiğini gördüler 85% 94 23,24,25 95. Ancak, bu çalışmalar bizim çalışmamızda olduğu gibi aynı hesaplama yöntemini kullanmak vermedi gelen özgüllükleri değişmekteydi ise% 88. Ayrıca, bazen farklı bir referans yöntem kullanılır ya da biyokimyasal hem sonuçlarını kombine analiz eder ve bir test yöntemi olarak kromojenik araç. bunun bir sonucu olarak, doğrudan bu çalışmalarda ile karşılaştırılması zordur. V saptanmasında daha iyi bir performans sergileyen ek olarak &quot;jove_content&quot;&gt; parahaemolyticus, bu çalışmada kullanılan kromojenik agar, birden çok renk elde nedeniyle orta formül bir kromojenik karışımı dahil edilmesi TCBS daha Vibrio türü ayırt olabilir. O V. algılamak için bu çalışmanın odak noktası olmamasına rağmen cholerae ve V. vulnificus, türlerin tarafından sergilenen kırmızı koloniler daha UV altında floresan ayırt edilebilir unutmayın değer. Bir sınırlama V. tespiti için kromojenik agar kullanmak cholerae ve V. vulnificus bu türler için onun belirgin düşük kurtarma olduğunu. Bu sorunu aşmak için, bir zenginleştirme aşaması dahil edilmelidir. Kromojenik agar olası bir başka sınırlama TCBS daha da kısa raf ömrü olduğunu. bu yeni ortamın devam eden optimizasyon depolama sırasında pH sağlamak için gereklidir. moleküler tekniklerin popülerliğine rağmengenellikle daha az maliyetli ve daha iyi bir algılama sınırı olarak, kültür-bağlı yöntemleri hala değerlidir. Bu kültürleme metotları bir tarama aracı olarak kullanılabilir. Bunun aksine, bu moleküler analizler aşağıdaki mikroorganizmalara kimliği ve canlılığı teyit etmek için kullanılabilir. bir kültür-bağlı bir yaklaşım aracılığıyla bakteri saymak, Standart Plaka Sayısı standart yöntem olarak kabul edilmektedir. Adım 4.2.5 gösterilen denklem CFU / g veya farklı seyreltme faktörler CFU ortalama daha CFU / ml belirlemek için daha doğru bir yoldur. Prosedürler boyunca tüm sulandırıcılar ve medya gibi V. olarak halofilik bakterilerin canlılığını korumak için yeterli tuz içermesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir parahaemolyticus. Kuluçka sıcaklık ve çevre bakteri üremesi için en uygun olmalıdır. Kromojenik ortam önemli insan patojenlerdir Vibrio türlerinin tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu nedenle, daha ileri çalışmalara Belirlenme yapılmalıdırne etkinliği tıbben uygun olmayan diğer çevre Vibrio türleri tespit etmek için. Gelecekteki uygulamalarda, yeni kromojenik ağar V için çevresel örneklerin rutin testler dahil edilebilir parahaemolyticus. Bu varsayımsal V. varlığını tespit etmek için kromojenik agarı üzerinde numunelerin doğrudan çizgiler ile yapılabilir parahaemolyticus. Kromojenik agar da V numaralandırmak için kullanılabilir dilüsyonlarda aşağıdaki parahaemolyticus. Niceleme da onay için kromojenik agar üzerinde çizgiler ardından zenginleştirme suyu kullanarak bir En Muhtemel Sayı yöntemi gerçekleştirmek tahmin edilebilir.

Vibrio cinsi, V. bir üyesi olarak parahaemolyticus Gram negatif, spor oluşturan eğik, çubuk şeklinde bir bakteridir. Sıvı ve yarı-katı ortamları yüksek hareketliliğini göstermektedir. Çoğu V. parahaemolyticus suşları insanlara patojenik olmayan, henüz patojen alt tipi bir çok ülkede 1,2 dolayısıyla bu türün önemli gıda kaynaklı patojen olarak kabul edilir salgınlara, yol açmıştır. ABD&#39;de Vibrio enfeksiyon insidansı 2000 3 itibaren artış eğilimi göstermiştir. Vibrio spp arasında., V. parahaemolyticus ABD 4,5 yılında hastalıklara neden olan en sık bildirilen türdür. Diğer klinik olarak anlamlı türler V. dahil alginolyticus&#39;un, V. vulnificus, V. cholerae vb hastalıkların küçük bir yüzdesi, aynı anda birden fazla türün neden olur. V. parahaemolyticus doğal iDeniz suyu nhabitant ve bu nedenle yaygın olarak haliç dahil olmak üzere dünya çapında deniz sularında dağıttı. türler Japonya&#39;da gıda zehirlenmesi salgını aşağıdaki 1950 yılında keşfedildi. ABD&#39;de, türler ilk Puget Sound bölgesinde 6,7 deniz suyu, sediment, ve kabuklu deniz ürünleri izole edildi. Böyle çift kabuklu kabuklu deniz ürünleri gibi deniz habitatlarının, Filtre besleyiciler, V. liman olabilir doğal floranın 8 parçası olarak parahaemolyticus. Bu, V. olarak İnsanda parahaemolyticus enfeksiyonları genellikle kontamine deniz ürünleri, özellikle çiğ veya az pişmiş kabuklu deniz ürünleri tüketimi ile bağlantılıdır. açık yara cilt enfeksiyona yol açan, deniz suyuna maruz kaldığında giriş Daha az yaygın yol meydana gelir. Çoğu V. parahaemolyticus suşları insan hastalığına neden olmaz, henüz böyle termostabil doğrudan hemolizin (TDH) olarak virülans faktörleri barındıran bazı alt tipler patojenik bulunmaktadır. Gıda kaynaklı V. en yaygın belirtileri parahaemolyticus enfeksiyonubulantı, kusma ve ateş takip ishal ve karın ağrısı. Baş ağrısı ve titreme de bildirilmiştir. Medyan kuluçka süresi 15 saat, ama patojenik 9 yeterli miktarda tüketiminden sonra 96 saat olabilir. hastalık iki üç gün sürer. V. neden gastroenterit belirtileri parahaemolyticus büyük ölçüde kendi kendini sınırlayıcı değildir ve bu yüzden, özel bir tedavi gerekli değildir. gastroenterit Hafif vakalarda etkin bir ağızdan rehidrasyon ile tedavi edilebilir. Daha ağır hastalıklar tetrasiklin veya siprofloksasin 10 antibiyotikler ile tedavi edilebilir. Ölüm oranı gastroenterit vakaların yaklaşık% 2, ancak kan dolaşımı enfeksiyonu veya septisemi geliştirmek isteyenler için% 29 gibi yüksek olabilir. Deniz suyuna maruz kalan açık yara deniz tüketir veya sahip herhangi bir kişi V. riski altındadır parahaemolyticus enfeksiyon. hastalıklar, yaşamı tehdit eden septisemi daha şiddetli formu, altta yatan tıbbi işbirliği ile bir alt grubunda daha sık görülüralkolizm, karaciğer hastalığı, diyabet, böbrek hastalığı, malignansi ve zayıflamış bağışıklık tepkisi veren diğer sağlık durumları arasında olan şulları 11. Özellikle, bireylerin bu grup V. neden ağır hastalıklara yakalanma için daha yüksek risk altındadır da V. benzer doğal habitatların bulunabilir vulnificus, parahaemolyticus. V. parahaemolyticus rutin seçici ve ayırıcı araç olarak tiyosülfat-sitrat safra tuzları sakaroz (TCBS) agarı kullanılarak izole edilir. Alkali pepton suda zenginleştirilmesi TCBS agarda izolasyon önce ortaya çıkabilir. TCBS ilgili olası koloniler daha sonra türe özgü genlerin varlığı hedefleme biyokimyasal testler ve / veya moleküler yöntemler bir dizi test edilir. PCR bazlı yöntemler genellikle V kimliklerini teyit etmek için kullanılan 12 tlh, termal olarak hemolisin geni yükselterek parahaemolyticus. Ne olursa olsun chOnay yöntemlerinin Ses Bildirim, o V. izole etmek ve ayırt etmek için etkili bir ortam olması önemlidir ilk etapta diğer deniz vibrios gelen parahaemolyticus. TCBS rutin sakaroz 12 mayalanmaya kendi yeteneklerine göre Vibrio cinsi içinde türlerin ayırt etmek için kullanılır olmuştur. Pozitif fermantasyon reaksiyon pH indikatör bromtimol mavi bir renk değişikliği ile eşlik ediyor. V. parahaemolyticus koloniler yeşil renk mavi sergileyen TCBS üzerinde oldukça belirgindir. Ancak, bu orta kolaylıkla V. ayırt edemez alginolyticus&#39;un ve V. cholerae. Sakkaroz fermente Proteus türleri V. benzeyen sarı koloniler oluşturabilir cholerae veya V&#39;dir alginolyticus&#39;un 13. TCBS, V. başlangıç izolasyon üzerine parahaemolyticus da Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, ve Pseudomonas spp 14 olarak misidentified olabilir. gecikmiş sakaroz halden ile suşlarıentation V. dahil Vibrio 13 fermente diğer sakaroz ile karışabilir parahaemolyticus. TCBS diğerleri arasında Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens&#39;in karşı değil, duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Birkaç diğer türler potansiyel V ile karıştırılmamalıdır gri koloniler yeşil verim parahaemolyticus ya da V. vulnificus 15. Bunun bir sonucu olarak, tespit ve V izole karşı daha iyi hassasiyet ve özgüllük ile alternatif bir kültür ortamı geliştirilmesi arzu edilmektedir parahaemolyticus ve diğerlerinin yanında yakın ilişkili tür. Çeşitli medya alternatifleri son zamanlarda geliştirilmiştir. Seçici maddelerin dahil edilmesi ek olarak, en ayırıcı enzimsel faaliyetlerin göre türlerin ayırt etmek için kromojenik substratlar içermektedir. Örneğin, indoksil-β-glukozit ve indoksil-β-galaktozid V ayırt etmek için kromojenik substratlar olarak kullanılmaktadır paragrafV. olanlardan (mavimsi-yeşil görünür) haemolyticus kolonileri nedeniyle diferansiyel yetenekleri (mor) cholerae β-glukozidaz ve β-galaktosidaz 16 üretmek. Çeşitli gruplar tarafından geliştirilen kromojenik agar Farklı formülasyonları değerlendirilmiştir ve nispeten veya TCBS 17,18,19 daha iyi performans bildirilmiştir. kromojenik ortam kullanmanın bir avantajı, çevreleyen ortamın renk ve böylece belirli bir koloni izolasyonu kolaylaştırmak az olmasıdır. Bu çalışmada, V tespit etmek ve izole etmek için yeni formüle kromojenik ortamın yeteneği değerlendirildi cholerae, V. parahaemolyticus ve V. vulnificus; V. ayırt etme yeteneği üzerine özel bir odaklanma ile Diğer türlerden parahaemolyticus.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0418-17-7</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Blender</td><td>Any</td><td></td><td>to blend oyster meat</td></tr><tr><td>CampyGen gas generator</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>CN035A</td><td>to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands</td></tr><tr><td>Chocolate agar plates</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>E14</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Common PCR reagents (dNTPs, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; Polymerase)</td><td>Any</td><td></td><td>or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)</td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50712</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S348903</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Gel doc</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HardyChrom Vibrio agar plates</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>G319</td><td>This study evaluates this medium</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>10 microliter-size was used in this study</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Oysters</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>R23701</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Pipette and tips</td><td>Any</td><td></td><td>Sterilized tips</td></tr><tr><td>Primers for &lt;em&gt;tlh&lt;/em&gt;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreader</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td>Beads may be used instead</td></tr><tr><td>Stomacher blender</td><td>Stomacher</td><td>400</td><td>Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.&amp;nbsp; Other homogenizer can be used.</td></tr><tr><td>Sterile filter bags for blenders</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-5</td><td></td></tr><tr><td>TCBS powder</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>265020</td><td>This study evaluates this medium</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSB powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-07-5</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>UV viewing cabinet</td><td>Any</td><td></td><td>Emit long-wave UV light</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Any</td><td></td><td>&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Sources&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial species and strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aeromonas hydrophila&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Campylobacter jejuni&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Proteus mirabilis&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt; Choleraesuis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella boydii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella flexneri&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella sonnei&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Vibrio alginolyticus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. cholerae&lt;/em&gt; (serotypes include &lt;em&gt;O139, O1,&lt;/em&gt; non &lt;em&gt;O1, El Tor&lt;/em&gt; biovars)</td><td>FDA, ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. damsela&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fisheri&lt;/em&gt;</td><td>Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fluvialis&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. furnissii&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. hollisae&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. metschnikovii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. mimicus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. parahaemolyticus&lt;/em&gt; (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td>ATCC, FDA, CDC, Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. proteolyticus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. vulnificus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of a more sensitive and specific chromogenic agar medium for the detection of vibrio parahaemolyticus and other vibrio species

Vibrio türlerinin neden olduğu ABD&#39;de Gıda kaynaklı enfeksiyonlar artış eğilimine göstermiştir. Cins Vibrio, V. parahaemolyticus Vibrio -associated enfeksiyonların çoğunluğu sorumludur. Böylece, Vibrio türleri arasında doğru farklılaşma. ve V. algılama parahaemolyticus gıda arzının güvenliğini sağlamak için büyük önem taşımaktadır. moleküler teknikler giderek daha yaygın olmakla birlikte, kültür-bağlı yöntemleri hala rutin yapılır ve bunlar bazı durumlarda standart yöntemler olarak kabul edilir. Bu nedenle, yeni bir kromojenik agar ortamı izolasyon ve klinik olarak anlamlı Vibrio spp farklılaşması için daha iyi bir yöntem sağlamak amacı ile test edilmiştir. Protokol V. tespiti için duyarlılık, özgüllük ve algılama limitini karşılaştırıldı Yeni kromojenik orta ve geleneksel bir ortam arasında parahaemolyticus. Çeşitli V. parahaemolyticus suşları (n = 22), yenidenfarklı serotipleri ve kökenlerden kaynağını sunan kullanılmıştır. Daha önce Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından tanımlanan ve ayrıca tlh -PCR tarafından laboratuvarda doğrulanmıştır. En az dört ayrı deneylerde, bu suşlara 24 için 35-37 ° C &#39;de inkübasyon takip kromojenik agar tiyosülfat-sitrat safra tuzları sakaroz, bu tür kültürlenmesi için tavsiye edilen orta (TCBS) ağar, üzerine aşılanmıştır -96 saat. Üç V. Büyüme varsa parahaemolyticus suşları (% 13.6) yine, TCBS üzerinde optimum büyümek yeşil koloniler sergiledi vermedi. İki suş (% 9.1) kromojenik agar üzerinde beklenen camgöbeği kolonileri vermemiştir. Olmayan V. parahaemolyticus suşları (n = 32), aynı zamanda kromojenik agar özgünlüğünü belirlemek için test edildi. Bu suşların arasında, 31 büyüyecek ya da diğer koloni morfolojileri sergilenmektedir vermedi. V. ortalama geri chromoge üzerinde parahaemolyticusnic Agar ~% 2 NaCl ile desteklenmiş triptik soya agar% 96.4 akrabasıydı. Sonuç olarak, yeni kromojenik ağar V. algılamak için etkili bir orta parahaemolyticus ve vibrios ayırmak için.

Bu çalışmada, 54 mikrobiyal soylar V olan 22 suşu olan monte edilmiştir parahaemolyticus türleri, diğer 19 Vibrio türü, 13 dışı Vibrio türü (Tablo 1). Çoğu V. parahaemolyticus suşları ya FDA, CDC ya da diğer devlet sağlık birimlerinden gelen bulundu. Onlar farklı serotipleri ve izolasyon kaynaklarını temsil etmektedir. Bu suşlar, daha önce düzenleyici kurumlar tarafından tespit edilmiştir. Biz ayrıca bu V. kimliklerini teyit Bir TLH -PCR 21,22 yaparak parahaemolyticus. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> tür </td><td rowspan="2"> Suşların sayılı test </td><td colspan="2"> Büyüme ve Kolonilerin rengi </td></tr><tr><td> TCBS </td><td> Chromogenic orta </td></tr><tr><td rowspan="2"> Aeromonas hydrophila </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> Büyüme yok </td><td> 1 Hiçbir büyümeyi süzün; </td></tr><tr><td> 1 suşu eflatun rengi </td></tr><tr><td> Candida albicans </td><td> 1 </td><td> Zayıf büyüme, sarı </td><td> Büyüme yok </td></tr><tr><td> Campylobacter jejuni </td><td> 1 </td><td> Büyüme yok </td><td> Büyüme yok </td></tr><tr><td> Escherichia coli </td><td> 1 </td><td> Büyüme yok </td><td> Zayıf büyüme, eflatun </td></tr><tr><td> Proteus mirabilis </td><td> 1 </td><td> Büyüme yok </td><td> Büyüme yok </td></tr><tr><td> Pseudomonas aeruginosa </td><td> 2 </td><td> Turkuaz </td><td> Sarı </td></tr><tr><td> Staphylococcus aureus </td><td> 1 </td><td> Zayıf büyüme, sarı </td><td> Büyüme yok </td></tr><tr><td> Salmonella choleraesuolduğunu </td><td> 1 </td><td> Büyüme yok </td><td> Büyüme yok </td></tr><tr><td> Shigella boydii </td><td> 1 </td><td> Büyüme yok </td><td> Büyüme yok </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 1 </td><td> Büyüme yok </td><td> Büyüme yok </td></tr><tr><td> Shigella sonnei </td><td> 1 </td><td> Büyüme yok </td><td> Zayıf büyüme, eflatun </td></tr><tr><td> Vibrio alginolyticus&#39;un </td><td> 3 </td><td> Sarı ya da turkuaz </td><td> Sarı </td></tr><tr><td> V. cholerae </td><td> 4 </td><td> Sarı ya da turkuaz </td><td> eflatun </td></tr><tr><td> V. damsela </td><td> 1 </td><td> Turkuaz </td><td> Kobalt </td></tr><tr><td> V. flsheri </td><td> 1 </td><td> Zayıf büyüme, sarı </td><td> Büyüme yok </td></tr><tr><td> V. fluvialis </td><td> 1 </td><td> Turkuaz </td><td> Kobalt </td></tr><tr><td> V.furnissii </td><td> 1 </td><td> Sarı </td><td> Sarı </td></tr><tr><td> V. hollisae </td><td> 1 </td><td> Turkuaz </td><td> Sarı </td></tr><tr><td> V. metschnikovii </td><td> 1 </td><td> Büyüme yok </td><td> Büyüme yok </td></tr><tr><td> V. mimicus </td><td> 1 </td><td> Turkuaz </td><td> eflatun </td></tr><tr><td> V. parahaemolyticus </td><td> 22 </td><td> Çoğu suş turkuaz </td><td> Çoğu suş camgöbeği; açik az </td></tr><tr><td> V. proteolyticus </td><td> 1 </td><td> Turkuaz </td><td> Kobalt </td></tr><tr><td> V. vulnificus </td><td> 4 </td><td> Turkuaz ya da net </td><td> eflatun </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Mikrobiyal Bu çalışmada kullanılan türler ve seçici ve diferansiyel medyada onların büyüme özellikleri. Renk çağıran ba olduBir renk tekerleği üzerinde sed. Mavi Teal benzer; eflatun pembemsi lavanta benzer, turkuaz yeşil benzer, sarı zeytin ve kahverengi kapsar. TCBS ve kromojenik agar - Dört ayrı çalışmalar seçici ve diferansiyel medyada bu suşların büyüme ve koloni morfolojisinin belirlenmesi için yapılmıştır. TCBS V dahil olmak üzere bazı Vibrio türlerinin izolasyonu için kullanılan geleneksel orta cholerae ve V. parahaemolyticus 12. TCBS yetiştirilen kolonilerin renk değişimi, turkuaz (yeşil) ya da açık (Şekil 1) sarıydı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig1.jpg" /> Vibrio spp Şekil 1. Koloni morfolojisi. TCBS ağar. V&#39;de parahaemolyticus (turkuaz), V. cholerae (sarı) ve am<html> iki türün ixed aşılama (a) dır. V. Kolonileri parahaemolyticus dairesel, entire ve dışbükey morfolojisi (b) ile turkuvaz görünür. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54493/54493fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Gıda ve çevresel örneklerden klinik olarak ilgili Vibrio türleri için seçmek için yeni bir kromojenik orta kabiliyeti test edildi. Buna ek olarak, aynı zamanda, birbirinden bu türlerin ayırmak için bu orta kabiliyeti değerlendirildi. Kromojenik agar gözlenen koloni renk kobalt, camgöbeği, macenta, sarı ya da açık (Şekil 2). Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, TCBS ve kromojenik agar hem dışı Vibrio mikroorganizmalara karşı seçicilik, belirli derecelerini göstermiştir. 1 &quot;&gt; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig2.jpg" /> Vibrio spp Şekil 2. Koloni morfolojisi. Yeni geliştirilen kromojenik agar üzerinde. V. parahaemolyticus (mavi), V. cholerae (kırmızı) ve iki türün bir karma aşı: (a). V. Kolonileri parahaemolyticus dairesel, entire ve dışbükey morfolojisi (b) ile mavi görünür. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54493/54493fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> V. gecede kültürleri Standart Plaka Sayısı yöntemi takiben, koloniler parahaemolyticus (yani, df = 10 -8) en yüksek dilüsyon faktörü alıcı kromojenik agar plakaları üzerine gözlenmiştir. Bu sonuçlar, bir seçici olmayan ortam üzerinde kıyaslanabilir (TSA&#39;lar). Bu kromojenik ortamın saptama limiti yaklaşık gıda matris yokluğunda 10 hücre veya daha düşük seçici olmayan ortam, benzer olduğunu göstermektedir. Örneğin V. diğer Vibrio türler için algılama kapasitesi alginolyticus&#39;un, V. fluvialis ve V. genç kız seçici olmayan ortama göre de iyi oldu. V. Bununla birlikte, bazı suşları cholerae, V. vulnificus ve V. mimicus 10- kromojenik agar üzerinde daha az CFU 100 kat vermiştir. kromojenik veya diğer seçilmiş medya kullanılan selektif ajanlar kaçınılmaz olarak bazı hücrelerini inhibe. Yaralı hücreler, örneğin, seçici ortam içinde geri olabilir. Bununla birlikte, biraz daha düşük algılama yeteneği bir zenginleştirme adımı istihdam çoğu rutin işlemler olmayan bir konudur. Gıda ya da çevresel numune mikroorganizmaların az miktarda tespit limiti aşan, zenginleştirme suyu yüksek bir seviyeye katlayacak. Alkali pepton suda zenginleştirilmesi ofte olduğunun çevresel numunelerde 12 Vibrio türlerinin sıklığını belirlemek için yapılır. istiridye homojenat varlığında, kromojenik agar iyileşme iyi derecede sergilendi. Diğer bir deyişle, büyük bir bölümü (&gt;% 70) V. parahaemolyticus hücreleri istiridye matrisi (Şekil 3a) varlığında etkilenmez, kromojenik agar üzerinde büyümeye başardık. Büyüme ve V. kazanımı parahaemolyticus hücreler de bir Vibrio türleri (Şekil 3b) mevcudiyetinde etkilenmemiştir. Çevresel örnekler, farklı Vibrio türü içeren bağlanmıştır, bu önemli bir özellik olan özellikle zenginleştirme işleminden sonra yüksek sayılar altındadır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54493/54493fig3.jpg" /> Şekil 3. </Bir V. strong&gt; Yüzde kurtarma ve bakteriyel rakip olmadan istiridye homojenatında parahaemolyticus süzün. Kurtarma (ortalama ± SD) agar plaklarına saymak beklenen CFU vs gözlenen göre hesaplanmıştır. Beklenen CFU sayısı inokulum bakteriyel yükü ile hesaplanmıştır. Bir V değerinde yüksek bir geri kazanım parahaemolyticus suşu rekabet olmadan tüm medya üzerinde gözlenmiştir (a). Kurtarma Benzer seviyesi V. yüksek seviyede gözlenmiştir metschnikovii hücreler (b). mevcuttu <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54493/54493fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Ayrıca kromojenik ve TCBS agar karşılaştırmak için duyarlılık ve özgüllük hesaplandı. Tablo 2 Accu bu medya kabiliyetini gösterirsi anlamlarını V. tespit parahaemolyticus. Hassasiyet V anlamına gerçek pozitif yüzdesi ile ilgilidir parahaemolyticus suşları medyada beklenen koloni morfolojisi vermiştir. Özelliği olmayan V anlamına gelmektedir, gerçek negatif yüzdesi ile ilgilidir parahaemolyticus soylar büyüme ya da V farklı koloni morfolojisi zayıf sergilemelidir parahaemolyticus. TCBS için duyarlılık ve özgüllüğü V tanımlamak için parahaemolyticus sırasıyla% 86.4 ve% 71.8 idi. Buna karşılık, kromojenik ortamın duyarlılığı ve özgüllüğü% 90.9 ve% 96.9 idi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> a) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCBS ağar </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> Sigara V. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> İyi büyüme ve turkuaz colonies </td><td> 19 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Zayıf büyüme veya non-turkuaz koloniler </td><td> 3 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> b) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> kromojenik ağar </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> Sigara V. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> İyi büyüme ve mavi koloniler </td><td> 20 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Zayıf büyüme veya non-mavi koloniler </td><td> 2 </td><td> 31 </td></tr></tbody></table> V. saptanması Tablo 2. duyarlılık ve TCBS özgüllüğü (a) ve kromojenik (b) ağar parahaemolyticus. V. kimlikleri parahaemolyticus biyokimyasal test ve tlh- PCR ile daha önce saptanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species at JoVE.com

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Tespiti için daha duyarlı ve özgül Chromogenic Agar Orta Gelişimi<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Ve Diğer<em&gt; Vibrio</em&gt; Türler

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

14.4K Görüntüleme.  California Polytechnic State University. Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium. 

Video: Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Deniz Bakterileri ile Ekotoksikolojik Yöntem<emVibrio anguillarum</em&gt; Çevresel Kirleticilerin Akut Zehirliliğini Değerlendirmek

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Çevre

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Gıda kaynaklı patojen tespit etmek için bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı gelişimi

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Biyomühendislik

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

Biyotiplerin Bakımında ve Türevinde Kullanılan Laboratuvar Teknikleri<emVibrio cholerae</em&gt; Klinik ve Çevresel İzolatlar

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu<emVibrio parahaemolyticus</em&gt; Yüzücü ve Swarmer Hücreleri

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

Vibrio fischeri Izolatlar arasında rekabetçi etkileşimleri ölçmek için kokuluçak assay

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Tespiti için daha duyarlı ve özgül Chromogenic Agar Orta Gelişimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler 'Bioluminescent' Muhabir Faj

Deniz Bakterileri ile Ekotoksikolojik Yöntem

Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri

Gıda kaynaklı patojen tespit etmek için bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı gelişimi

Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil

Biyotiplerin Bakımında ve Türevinde Kullanılan Laboratuvar Teknikleri

Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Vibrio fischeri Izolatlar arasında rekabetçi etkileşimleri ölçmek için kokuluçak assay

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü