Wir danken M. Channey, E. Chau, und K. Tomas für ihre Unterstützung für das Projekt. Projekt Lieferungen wurden zum Teil von der California Polytechnic State University finanziert.

1. Medien und Anzucht von Bakterienstämmen HINWEIS: Die Verwendung aseptischer Techniken in allen Experimenten. Verwenden Sie sterile Materialien. Sterilisieren alle Behälter, Geräte und Reagenzien vor der Verwendung. Autoklav alle Abfälle vor der Entsorgung, da sie biologisch gefährlichen betrachtet werden. Autoklaventemperatur und Zeitkombination ist ≥121 ° C x ≥15 min für alle folgenden Verfahren. <ol><li> Um ~ 1-L CASO-Agar (TSA), fügen Sie zuerst 1 L VE-Wasser in einem 2-L-Erlenmeyerkolben einen magnetischen Rührstab enthält. Verwenden einen Kolben, der mindestens zwei Mal größer ist als das Endvolumen ist. In 30 g tryptische Sojabrühe Pulver und 20 g Agar-Granulat in den Kolben. HINWEIS: Die Verwendung von 2% Agar anstelle von 1,5% Schwärmen einiger Vibrio spp zu begrenzen. <ol><li> Gut mischen, indem Sie auf das Rührwerk drehen. Unter Rühren, schalten Sie die Wärme der Mischung zum Kochen bringen. Man nimmt den Kolben von der Heizeinrichtung, sobald das Gemisch zu sieden beginnt. Lose Abdeckung the-Kolben mit Alufolie. Kleben Sie die Folie es in den Kolben vor dem Autoklaven zu sichern. </li><li> Um tryptische Sojabrühe (TSB) machen, lassen Sie den Agar aus dem Rezept in Schritt 1.1. HINWEIS: Flaschen anstelle von Erlenmeyer-Kolben verwenden. </li><li> Um tryptischen Soja-Agar mit 2% Natriumchlorid oder NaCl (TSAS) ergänzt, fügen Sie 20 g NaCl in dem Gemisch vor dem Rühren und Erwärmen. Um tryptischer Sojabrühe mit 2% NaCl (TSBS) ergänzt machen, lassen Sie den Agar, fügen Sie 20 g NaCl in dem Gemisch vor dem Rühren und Erwärmen. </li></ol></li><li> Um Hirn-Herz-Infusion (BHI) Agar, zu suspendieren 37 g BHI-Pulver und 15 g Agar-Granulat in 1 l gereinigtes Wasser zu machen. Erhitze unter häufigem Rühren das Pulver zu lösen. Autoklav. Lassen Sie den Agar zu BHI-Brühe zu machen. </li><li> Um TCBS Agar, auszusetzen 89 g des TCBS Pulver in 1 l gereinigtes Wasser. Erhitze unter häufigem Rühren und kochen für 1 min vollständig um das Pulver aufzulösen. Sterilisieren nicht. </li><li> Für alle Agar-Medien, kühlen die heißen Agar auf 45-50 ° C in einem Wasserbad. Ordnen Sie leere Petriplatten in Stapeln von fünf bis sechs Platten. Ausgehend von der Unterseite des Stapels, gießen Sie die geschmolzene Agar in jede Petrischale etwa halb voll zu erreichen. Schließen Sie die Petrischale Deckel nach dem Gießen. Lassen Sie den Agar, indem man die Platten sitzen bei Raumtemperatur zu verfestigen. <ol><li> Verwenden Sie die Agar-Platten am nächsten Tag oder nach 12 Stunden. Nicht gebrauchte Platten in einem Kühlschrank für bis zu zwei Wochen. Vor der Anwendung entfernen Platten aus dem Kühlschrank und äquilibrieren sie bei Raumtemperatur für mindestens 15 min. HINWEIS: Ein-Liter-Agar macht ~ 45-Agar-Platten. Lassen Sie die Agarplatten ausreichend am Tag der Zubereitung zu trocknen, und äquilibrieren sie nach Kühllagerung auf Raumtemperatur, um wirksam die Ausbreitung der Kolonien reduzieren. </li></ol></li><li> Erhalten Schokolade und chromogenen Agarplatten und äquilibrieren sie bei Raumtemperatur vor jedem Experiment. </li><li> Subkultur alle 54 mikrobieller in Tabelle 1 alle paar da gezeigt Stämmeys. <ol><li> Verwenden Sie eine sterile Impföse Kulturen aus einem gefrorenen Lager oder einer früheren Charge zu nicht-selektiven Medien zu übertragen, wie BHI, TSB / TSA oder Schokolade-Agar. Wachsen halophilen Vibrio spp. auf TSBS / TSAS. </li><li> Um zu überprüfen, um die Reinheit der Kultur, Streifen alle Stämme in einem Muster, das für die Beobachtung von isolierten Kolonien erlauben würde. Zum Beispiel verwenden ein Muster dreiphasigen Streifen eine große Menge an Bakterien zu kleineren Menge zu verdünnen, was schließlich isolierte Kolonien erhalten wurden. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Platten upside-down bei 35-37 ° C bis zu 48 Stunden. Für Campylobacter spp., Röhrchen oder Platten in einem geschlossenen Deckel jar einen Gas Beutel enthält eine microaerophilic Umgebung zu erzeugen. Beobachten Koloniemorphologie nach der Inkubation. Reinkulturen sollten Kolonien ergeben, die ähnliche Kolonie Morphologie aufweisen. HINWEIS: Inkubieren alle Platten upside-down kondensierte Wassertröpfchen auf der Unterseite des Deckels fallen auf dem col gebildet zu verhindernOnies. </li></ol> 2. Artbestimmung durch PCR <ol><li> Führen Sie tLH -PCR die Identität von V. zu bestätigen parahaemolyticus - Stämme. Verwendung Primern TLH -F (5 &#39;AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3&#39;) und TLH -R (5 &#39;GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3&#39;) eine 450-bp - Fragment des thermolabilen Hämolysin - Gens 20 zu amplifizieren . <ol><li> Verwenden Sie Schleife ein Sterile ein paar isolierte Kolonien von jeder V. zu übertragen parahaemolyticus Stamm von TSAS zu 5 ml TSBS. Inkubieren bei 35-37 ° C für 16-24 Std. </li><li> Zentrifugen Kulturen bei 14.000 × g für 1 min. Überstand entfernen und wasche das Pellet zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Man kocht die Suspension 3 min Zelllysat zu erhalten. HINWEIS: V. parahaemolyticus ist einfach aufgelöst werden. Daher Lysereagenz ist nicht erforderlich. Es ist auch möglich, ein Bit der kolonie direkt als Matrize zu verwenden. </li><li> Führen Sie die PCR in einem 25-ul-Reaktions volume. Bereiten eines Reaktionsgemisches , um eine Endkonzentration von 1 × PCR - Puffer, 1,5 mM MgCl 2, 100 &amp; mgr; M von jedem dNTP, 1 &amp; mgr; M jedes Primers, 1 U Taq - Polymerase und 1 &amp; mgr; l Zelllysat enthält. Nach Vorinkubation bei 94 ° C für 5 min, laufen 35 Amplifikationszyklen bei 94 ° C für 30 sec, 58 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 60 sec 21. </li><li> Last Aliquots von 5 &amp; mgr; l-Amplikon in 1,5% Agarose-Gelen. Stromversorgung einschalten Elektrophorese starten. Visualisieren der Anwesenheit oder Abwesenheit von Amplicons unter UV-Beleuchtung nach Ethidiumbromidfärbung. </li></ol></li></ol> 3. Wachstum auf selektiven und differentiellen Medien <ol><li> Zwei bis vier Tage vor dem Experiment Streifen alle in der Tabelle gezeigt mikrobielle Stämme 1 auf nicht - selektiven Medium (TSAS, BHI oder Schokolade - Agar) zur Kolonieisolierung. Inkubiere Platten bei 35-37 ° C für 48 Stunden. Überprüfen Sie die Reinheit der Kulturen durch die Beobachtung Koloniemorphologie nach der Inkubation. Reinkulturen sollten Kolonien ergeben, die ähnliche Kolonie Morphologie aufweisen. </li><li> Bringen Sie ein paar isolierte Kolonien aus Schritt 3.1 in 5 ml Brühe. Röhrchen bei 35-37 ° C für 16-24 Stunden. HINWEIS: Verwenden Sie junge Kolonien, die weniger als vier Tage alt, um über Nacht Kulturen in allen Experimenten vorzubereiten. </li><li> Streak eine Öse voll über Nacht Kulturen auf selektiven und differentiellen Medien (TCBS und chromogenen Agar) zur Kolonieisolierung. Inkubiere Platten bei 35-37 ° C für bis zu 96 Stunden. </li><li> Notieren Sie die Gesamt Wachstum aller Stämme, die durch sowohl die Kulturdichte auf der Platte zu prüfen und die Größe der isolierten Kolonien. Notieren Sie sich die Farbe der Kolonien unter der Umgebungs- und / oder UV-Licht. Hinweis andere Eigenschaften der isolierten Kolonie wie die Erhebung, Marge und Form. </li></ol> 4. Wiederherstellungs Assay <ol><li> Wählen Sie eine repräsentative Teilmenge von V. parahaemolyticus - Stämme (n = 14) , die verschiedenen Serotypen und Herkunft der Isolation umfassen <sbis&gt; 22. Beimpfen junge Kulturen von den Platten in 5 ml TSBS. Die Röhrchen bei 35-37 ° C für 16-24 Stunden. </li><li> Führen Sie eine Standardplatte Zählweise der Nacht-Kulturen wie unten beschrieben. <ol><li> Vortex gut die Nacht-Kulturen zu mischen. Machen Sie eine 10-fache oder 10 -1 Verdünnung von 100 ul der Übernachtkultur in ein Röhrchen übertragen , enthaltend 900 &amp; mgr; l PBS. Vortex gut mischen. </li><li> Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze 100 &amp; mgr; l aus der 10 -1 Verdünnung Rohr in ein anderes Röhrchen zu übertragen , enthaltend 900 &amp; mgr; l PBS. Vortex gut mischen. Das sind 10 -2 Verdünnung. Wiederholen Sie den Vorgang nacheinander 10 -7 Verdünnung zu erhalten. </li><li> Unter Verwendung der 10 -4 bis 10 -7 Verdünnungsröhrchen, Platte 100 ul jeweils an den chromogenen, TCBS und TSAS Agarplatten. HINWEIS: Der Verdünnungsfaktor (DF) auf der Platte wird 10 -5 bis 10 -8, respectively. </li><li> Verbreiten Sie die Aliquots gleichmäßig auf ter Agar-Oberfläche. HINWEIS: Es ist in Ordnung denselben Spreader pro Stamm auf dem gleichen Medium zu verwenden, solange die meisten verdünnten Aliquot zuerst gespreizt wird (dh von 10 -8 bis 10 -5). Sie nicht den gleichen Spreader für unterschiedliche Medien verwenden. </li><li> Inkubiere Platten bei 35-37 ° C für bis zu 96 Stunden. Zählen Kolonien auf den Platten. Ignorieren Platten tragenden Kolonien, die zu zahlreich sind, zu zählen (TNTC) oder weniger als 25 berechnen CFU / ml nach der folgenden: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Woher N die Anzahl der Zellen in der unverdünnten Rohr =, ausgedrückt in CFU / ml oder CFU / g C = die Gesamtzahl der Kolonien auf den Platten gezählt , die 25-300 Kolonien ertragen n 1 = die Anzahl der Platte (n) in dem gezählten Kolonien von der unteren df sind n 2 = die Anzahl der Platte (n) in dem gezählten Kolonien aus der nachfolgenden 10-fache Verdünnung sind df = die untere Verdünnungsfaktor (dh konzentrierter Verdünnung) </li></ol></li><li> Vergleichen CFU / ml unter den verschiedenen Medien. Verwenden Sie KBE / ml auf TSAS als 100%, berechnen die% Rückgewinnung von V. parahaemolyticus auf dem chromogenen und TCBS Agar gezüchtet. </li></ol> 5. Wettbewerb Assay <ol><li> Wählen Sie eine Teilmenge von Stämmen, die unterschiedliche Morphologien Kolonie auf dem chromogenen und TCBS Agar aufweisen. HINWEIS: Auf diese Weise wird es möglich sein , Kolonien von V. entstanden zu zählen nur parahaemolyticus, trotz der Anwesenheit von anderen Spezies in dem Inokulum. <ol><li> Wählen Sie eine V. parahaemolyticus - Stamm, der die erwarteten Türkis und Cyan - Kolonien auf TCBS und dem chromogenen Agar jeweils ergibt. </li><li> Wählen Sie eine nicht V. parahaemolyticus und eine nicht Vibrio Spezies , die auf jedem dieser Medien nicht wächst, oder andere Koloniefarbe aufweisen. HINWEIS: Zum Beispiel V. metschnikovii wächst sehr schwach on TCBS und wuchs nicht auf dem chromogenen Agar. Shigella sonnei wächst nicht auf TCBS sondern ergibt Magenta Kolonien auf dem chromogenen Agar. </li></ol></li><li> Nach der Auswahl der Stämme oben, bereiten über Nacht Brühekulturen unter Verwendung von isolierten Kolonien auf nicht-selektiven Medien gezüchtet. <ol><li> Machen Sie über Nacht Kulturen von V. parahaemolyticus und V. metschnikovii durch ein paar isolierte Kolonien von TSAS zu 5 ml TSBS übertragen. Inkubieren bei 35-37 ° C für 16-24 Std. </li><li> Machen Nacht - Kulturen von Shigella sonnei durch ein paar isolierte Kolonien von BHI - Agar zu 5 ml BHI - Brühe zu übertragen. Inkubieren bei 35-37 ° C für 16-24 Std. </li></ol></li><li> Für jeden Stamm, führen Sie eine Verdünnungsreihe ähnlich den Schritten 4.2.1 und 4.2.2. Platte geeignete Verdünnungen auf TSAS oder BHI zu CFU / ml der Übernachtkultur zu bestimmen, wird die Gleichung in Schritt 4.2.5 dargestellt werden. HINWEIS: In der Regel 100 &amp; mgr; l von 10 -5 bis 10 -7 VerdünnungRöhren funktioniert für die meisten Kulturen. Verwenden Sie die KBE / ml Werte, die genaue Menge an Zellen im nächsten Schritt verwendet berechnen zu unterstützen. Die berechneten CFU / ml-Werte werden nach der Inkubation erhalten wird, obwohl die folgenden Schritte am selben Tag wie Schritt 5.3 durchgeführt werden. </li><li> Mit Hilfe der über Nacht Kulturen und Verdünnungsröhrchen in den Schritten 5.2 und 5.3, mischen verschiedene Mengen eines V. parahaemolyticus - Stamm und ein nicht V. parahaemolyticus Arten. Beispielsweise 500 &amp; mgr; l der 10 -5 Verdünnungsröhrchen von V. Mischungs parahaemolyticus mit 500 ul der Übernachtkulturen von V. metschnikovii. HINWEIS: Diese Mischung hohe Mikroflora Hintergrund simuliert. Um einen niedrigen Mikroflora Hintergrund simulieren, mischen 500 ul jeder der 10 -5 Verdünnungsröhrchen aus beiden Spezies. </li><li> Verbreiten Sie 100 ul der Mischung jeweils auf den chromogenen, TCBS und TSAS Agarplatten. </li><li> Nach der Inkubation bei 35 bis 37 ° C bis zu 96 Stunden, zählen Kolonien von V. parahaemolyticus und die Nicht- V. parahaemolyticus Spezies auf der Grundlage ihrer Differenz in Wachstum und Morphologie der Kolonie auf dem chromogenen und TCBS Agar. HINWEIS: Wenn beispielsweise die nicht V. parahaemolyticus Arten wächst nicht auf dem chromogenen und TCBS Agar, alle Kolonien von V. sein parahaemolyticus. Wenn der nicht V. parahaemolyticus Art wächst auf beiden Medien, nur die türkisfarbene Kolonien auf TCBS und Cyan - Kolonien auf chromogenen Agar wird von V. sein parahaemolyticus. Die nicht V. parahaemolyticus Arten aufweisen kann oder nicht ähnliche Morphologie der Kolonie bis V. parahaemolyticus auf TSAS. <ol><li> Wenn der nicht V. parahaemolyticus Art wächst ähnlich wie V. parahaemolyticus in diesem nicht - selektiven Medium, teilen Sie die Koloniezahl durch zwei Zahlen für V zu erhalten parahaemolyticus nur. Vergleichen Sie die aktuelle Zählung der Kolonien mit dem erwarteten Zählwert abgeleitet aus Schritt 5.3. </li></ol></li></ol> 6. Effjekte von Oyster Homogenate <ol><li> Wiegen ≥50 g Austernfleisch von ≥12 Weichtiere einschließlich Fleisch und Schnaps. <ol><li> In gleichen Menge PBS in die Auster Fleisch und Schnaps. Mischen Sie die Mischung bei hoher Geschwindigkeit für 90 Sekunden. Dies stellt 2 -1 verdünnt Auster Homogenat. </li><li> Werden 100 g 2 -1 verdünnt Auster Homogenat zu 400 g PBS. Verwenden Sie eine Skala das Gewicht zu messen, nicht Volumen. Mischen Sie die Mischung bei hoher Geschwindigkeit 1 min. Autoclave die Auster Homogenat. Hinweis: das wird die Auster Homogenat für Spick verwendet werden. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie den Recovery-Test (Schritt 4) in Gegenwart von Auster Homogenat. <ol><li> Nach dem 500 g Austern Homogenat abkühlt, werden 100 &amp; mgr; l V. Nacht - Kulturen parahaemolyticus in TSBS ihm gewachsen. Bestimmen Sie die tatsächliche Menge an V. parahaemolyticus Zellen in dem Inokulum durch die Standardzählverfahren berechnet 4.2 in Schritt beschrieben durch. </li></ol></li><li> Vertreteressen, um den Wettbewerb Test (Schritt 5) in Gegenwart von Auster Homogenat. <ol><li> Nachdem die 500 g kühlt Auster Homogenat, fügen Sie unten jeweils 100 ul der Übernachtkulturen von V. parahaemolyticus und nicht V. parahaemolyticus zu. Bestimmen Sie die tatsächliche Menge der Bakterien Zellen in dem Inokulum durch die Standardzählverfahren berechnet die Durchführung in Schritt 4.2 beschrieben </li></ol></li><li> Mischen Sie die Bakterienzellen mit Auster Homogenat gut unter Verwendung eines Homogenisators. HINWEIS: Nach dem Mischen der Auster Homogenat die absichtlich zugesetzt Zellen enthält Auster Homogenat genannt wird versetzt. </li><li> Machen Verdünnungen der spiked Auster Homogenat zu erhalten 10 -1 bis 10 -3 Verdünnungsröhrchen nach den beschriebenen Verfahren in Schritt 4.2.2. Striches 100 ul jeder Verdünnung auf dem chromogenen, TCBS und TSAS Agar. Inkubiere Platten bei 35-37 ° C für bis zu 96 Stunden. </li><li> Vergleichen Sie die aktuelle Zählung der Kolonien auf chromogenen und TCBS Agar mit dem Exteten Koloniezahl aus den Schritten 6.2.1 und 6.3.1 abgeleitet. HINWEIS: Wenn beispielsweise ein Rohr aus V. parahaemolyticus Übernachtkultur enthält 10 8 CFU / ml, ein Inokulum von 100 &amp; mgr; l bedeutet , dass 10 &amp; sup7 ; Zellen in den 500-g Austern Homogenat zugesetzt werden, wodurch man 5 x 10 4 Zellen / g. Nach Verdünnung und Plattierung sollte die Platte df = 10 -2 500 Kolonien erhalten; während dieser mit df = 10 -3 sollte 50 Kolonien ergeben. Dies sind die erwarteten Koloniezahlen. </li></ol>

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D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+thiosulphate-citrate-bile+salt+sucrose+(TCBS)+agar+and+CHROMagar+Vibrio+for+isolating+Vibrio+parahaemolyticus.">Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus.</a> Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).</li><li>Canizalez-Roman, A., Flores-Villase&#241;or, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Le&#242;n-Sicairos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+a+chromogenic+agar+medium-PCR+protocol+with+a+conventional+method+for+isolation+of+Vibrio+parahaemolyticus+strains+from+environmental+and+clinical+samples.">Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples.</a> Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).</li><li>Kriem, M. 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Some media were generously provided by Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA. Thorsen conducted this study while a student at California Polytechnic State University. He is currently an employee of Hardy Diagnostics.

Diese Studie konzentriert sich auf Kulturmedien Entwicklung und Evaluierung. Herkömmlicherweise TCBS ist die selektive und Medium zur Isolierung und Detektion V. Differential verwendet parahaemolyticus, V. cholerae und V. vulnificus 12. Es wurden jedoch Einschränkungen berichtet V. für dieses Medium, wie die Unfähigkeit , zu differenzieren cholerae aus anderen Vibrio - Spezies. Sucrose und pH-Indikator sind die Differenzierungsmittel von TCBS. Somit verursacht die Säureproduktion durch Saccharose-Fermenter Farbwechsel des Mediums. Die Färbung des Mediums ist ein Nachteil, weil es TCBS Beobachtung der Koloniemorphologie verdunkeln kann. Das neu entwickelte chromogenes Medium nutzt hohen pH - Wert und Salzgehalt das Wachstum von nicht - Vibrio - Spezies in vielen marinen Proben gefunden zu unterdrücken. Das neue chromogene Medium einen pH-Endwert von 8,6 ± 0,2. Pro Liter entionisiertes Wasser, es besteht aus 10 g Pepton, 10 g Meersalz-Gemisch, 10 g Rindergalle, 10 g NatriumThiosulfat, 5 g Hefeextrakt, 5 g Natriumcitrat, 2,2 g Natriumcarbonat, 2 g Lactose, 0,5 g Natriumpyruvat, 0,3 g eines chromogenen Mischung und 15 g Agar. Das chromogene Mischung ermöglicht die Differenzierung zwischen Vibrio spp. entsprechend ihrer unterschiedlichen Fähigkeiten bestimmte Enzyme zu produzieren. Anstatt die Farbe des TCBS Agarmedium, verschiedene Vibrio spp verändern. würde eine unterschiedliche Koloniefarbe auf dem neuen chromogenes Medium. Im Vergleich dazu enthält ein kommerziell erhältliches chromogenes Medium 15 g Agar, 8 g Pepton und Hefeextrakt, 51,4 g von Salzen, 0,3 g eines chromogenen Mischung und einen pH-Endwert von 9,0 ± 0,2. Die Robustheit eines Testauswertung ist abhängig von der Probengröße. Da diese Studie über die Wirksamkeit des neuen chromogenes Medium betont V. zu isolieren und zu erkennen , parahaemolyticus ist es wichtig , viele verschiedene V. anhäufen parahaemolyticus - Stämme. Frühere Studien vergleichen TCBS undneue Kulturmedien häufig Umwelt- oder Lebensmittelproben mit unbekannten Arten und Menge der Mikroorganismen 23,24,25,26 beteiligt. Mehrere Kolonien pro Probe wurden isoliert noch die klonalen Natur der Isolate war oft unbestimmt. Idealerweise sollten verschiedene Stämme in Assay-Entwicklung getestet werden, da sonst die Genauigkeit des Assays würde aufgeblasen werden. Dehnungs Identität kann durch herkömmliche Methoden wie Subtypisierung Pulsfeld - Gelelektrophorese (PFGE) oder Multi-Locus - Sequenzierung hergestellt werden. V. parahaemolyticus - Stämme in dieser Studie wurden zuvor von Ribotypisierung und PFGE 19 gekennzeichnet. Während der Assay-Entwicklung, Sensitivität, Spezifität und Nachweisgrenze gehören zu den wichtigsten Faktoren untersucht werden. Die Empfindlichkeit, die auch als Genauigkeit oder diagnostische Sensitivität bekannt ist, ist die positive prozentuale Übereinstimmung zwischen den Referenz- und Testmethoden. Spezifität, die auch als Präzisions oder diagnostische Spezifität bekannt ist, ist die negative Prozent a<html> zwischen den Referenz- und Testmethoden Gréement. In dieser Studie verwendeten wir PCR-basierte Verfahren als Referenzmethode, da die Ergebnisse zwischen verschiedenen Gruppen wurden überprüft. TCBS und die chromogenen Medien wurden die Testmethoden. Um zu bestimmen , Empfindlichkeit, ergibt sich aus der V. parahaemolyticus - Stämme wurden verwendet, dh Empfindlichkeit = 100% x Wahr Positive / (wahre Positive + falsch Negative). Auf der anderen Seite ergibt sich aus nicht V. parahaemolyticus - Stämme wurden verwendet Spezifität zu bestimmen; und damit Spezifität = 100% x Echte Negative / (True Negative + Falsch-Positiv). Um zuverlässiger Spezifität Ergebnisse, nicht V. parahaemolyticus Stämme sollten aus einer Umgebung isoliert werden , in denen Probenahme durchgeführt werden. Unsere Sensitivität und Spezifität Berechnungen basieren auf der Dokumente , die Regierung 27, der Wissenschaft 28 und wissenschaftliche Organisation 29 zu einem Thema der Assay - Entwicklung und Validierung im Zusammenhang. nt &quot;&gt; Basierend auf unseren Ergebnissen, zeigte das chromogene Medium eine bessere Leistung als TCBS bei der Identifizierung von V. parahaemolyticus. Die gesamte prozentuale Übereinstimmung zwischen dem Referenzverfahren und chromogenes Medium beträgt 94,4%, im Vergleich zu 77,8% zwischen dem Referenzverfahren und TCBS. die Sensitivität und Spezifität des chromogenen Mediums sind 90,9% bzw. 96,9%, die größer sind als die der TCBS (86,4% bzw. 71,9% betrugen). Frühere Studien andere chromogene Medien zum Nachweis von V. parahaemolyticus Auswertung festgestellt , dass Empfindlichkeiten reichten 85 bis 88% , während die Spezifität von 94 bis 95% 23,24,25 reichten. Allerdings sind diese Studien nicht die gleiche Berechnungsmethode wie unsere Studie verwendet haben. Außerdem verwendet sie manchmal eine andere Referenzmethode oder sie kombinierten Ergebnisse aus beiden biochemischen Analysen und chromogenes Medium als ein Testverfahren. als Ergebnis ist es schwierig, direkt unsere Ergebnisse mit diesen früheren Studien vergleichen. V. bei der Aufdeckung parahaemolyticus, das chromogene Agar in dieser Studie verwendet wird, könnte auch Vibrio Spezies als TCBS aufgrund des Einschlusses eines chromogenen Mischung in dem Medium Formel, wodurch man mehrere Farben unterscheiden. Es war zwar nicht im Mittelpunkt dieser Studie V. zu erkennen cholerae und V. vulnificus, ist es erwähnenswert , dass die magentafarbene Kolonien von diesen Spezies zeigten zu beachten , kann durch Fluoreszenz unter UV unterschieden werden. Eine Begrenzung des chromogenen Agar zum Nachweis von V. verwenden cholerae und V. vulnificus ist seine scheinbare geringe Erholung für diese Arten. Um dieses Problem zu umgehen, muss ein Anreicherungsschritt einbezogen werden. Eine weitere mögliche Einschränkung des chromogenen Agar ist die kürzere Haltbarkeit als TCBS. Laufende Optimierung des neuen Mediums erforderlich pH während der Lagerung aufrechtzuerhalten. Trotz der Popularität von molekularen TechnikenKultur je Methoden sind noch wertvoller, da sie häufig weniger kostspielig sind und eine bessere Nachweisgrenze. Diese Kultivierungsverfahren kann als Screening-Werkzeug verwendet werden. Umgekehrt können sie die Identität und Lebensfähigkeit von Mikroorganismen folgenden molekularen Analysen zur Bestätigung verwendet werden. Aufzuzählen Bakterien über eine kultur je Ansatz wird Standard-Keimzahl als Standardmethode anerkannt. Die Gleichung in Schritt 4.2.5 dargestellt ist eine genauere Weise CFU / g oder CFU / ml zu bestimmen als CFUs aus unterschiedlichen Verdünnungsfaktoren gemittelt werden. Es ist wichtig zu beachten , dass alle Verdünnungsmittel und Medien in den Verfahren ausreichend Salz enthalten die Lebensfähigkeit der halophilen Bakterien wie V. aufrechtzuerhalten parahaemolyticus. Inkubationstemperatur und Umwelt muss für das Bakterienwachstum optimal. Das chromogene Medium ist so konzipiert , Vibrio - Spezies zu erkennen , die wichtige menschliche Krankheitserreger sind. Daher müssen weitere Studien durchgeführt werden, um Bestimne seine Wirksamkeit anderer Umwelt Vibrio Spezies zu erkennen , die nicht medizinisch relevant sind. In zukünftigen Anwendungen kann die neue chromogenen Agar in der Routineprüfung von Umweltproben für V. aufgenommen werden parahaemolyticus. Dies kann durch direkte Streifen von Proben auf dem chromogenen Agar durchgeführt werden auf das Vorhandensein von vermutlichen V. nachzuweisen parahaemolyticus. Das chromogene Agar kann auch verwendet werden , V. aufzuzählen parahaemolyticus folgende Verdünnungen. Die Quantifizierung kann auch durch Ausführen einer Most Probable Number Methode Anreicherungsbrühe, gefolgt durch Ausstreichen auf dem chromogenen Agar zur Bestätigung abgeschätzt werden.

Als Mitglied der Gattung Vibrio, V. parahaemolyticus ist ein Gram-negative, nicht-sporenbildende, gekrümmte, stabförmiges Bakterium. Es weist eine hohe Beweglichkeit in sowohl flüssigen als auch halbfesten Umgebungen. Die meisten V. parahaemolyticus Stämme sind nicht pathogen für den Menschen, aber die pathogenen Subtypen Epidemien und Pandemien verursacht, daher ist diese Spezies als 1,2 ein wichtiges Lebensmittel übertragene Erreger in vielen Ländern zu sein. Die Inzidenz von Vibrio - Infektion in den USA hat sich seit dem Jahr 2000 3 einen Aufwärtstrend gezeigt. Unter Vibrio spp., V. parahaemolyticus ist die am häufigsten Spezies berichtet Krankheiten in den USA 4,5 verursacht. Andere klinisch relevante Arten gehören V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae usw. Ein kleiner Prozentsatz der Erkrankungen wird gleichzeitig von mehreren Arten verursacht. V. parahaemolyticus ist eine natürliche inhabitant von Meerwasser und damit in Meeresgewässern in der ganzen Welt, einschließlich der Mündungen weit verbreitet. Die Art wurde im Jahr 1950 nach einem Ausbruch der Lebensmittelvergiftung in Japan entdeckt. In den USA wurde die Art erstmals in Meerwasser, Sedimenten und Muscheln in der Region 6,7 Puget Sound isoliert. Filtrierer und in der marinen Lebensräume, wie Muscheln Muscheln, kann V. Hafen parahaemolyticus als Teil ihrer natürlichen Flora 8. Als solche V. parahaemolyticus Infektionen bei Mensch sind oft auf den Verzehr von kontaminierten Meeresfrüchten zurückzuführen sind, insbesondere rohen oder ungekochten Schalentiere. Eine weniger häufige Route der Eintrag erfolgt, wenn offene Wunde dem Meerwasser ausgesetzt ist, was zu einer Infektion der Haut. Die meisten V. parahaemolyticus - Stämme verursachen keine Krankheit beim Menschen, noch bestimmte Subtypen Virulenzfaktoren wie thermo direkte Hämolysin (TDH) sind beherbergen pathogen. Die häufigsten Symptome von Lebensmittelvergiftungen V. parahaemolyticus - InfektionDurchfall und Bauchschmerzen, gefolgt von Übelkeit, Erbrechen und Fieber. Kopfschmerzen und Schüttelfrost sind auch berichtet. Die mediane Inkubationszeit beträgt 15 Stunden, kann jedoch bis zu 96 Stunden nach dem Verzehr einer ausreichenden Menge an pathogenen Stämmen 9 sein. Die Krankheit dauert von zwei bis drei Tagen. Die Gastroenteritis Symptome verursacht durch V. parahaemolyticus sind weitgehend selbstlimitierend und deshalb Spezialbehandlung ist nicht erforderlich. Leichte Fälle von Gastroenteritis wirksam durch orale Rehydratation behandelt werden. Weitere schwere Erkrankungen können 10 von Antibiotika wie Tetracyclin oder Ciprofloxacin behandelt werden. Die Sterblichkeit liegt bei etwa 2% für Gastroenteritis Fällen, kann aber als 29% für die so hoch sein, die Blut-Infektion oder Sepsis zu entwickeln. Jede Person , die Meeresfrüchte verzehrt oder hat offene Wunde dem Meerwasser ausgesetzt ist gefährdet von V. parahaemolyticus Infektion. Die schwere Form von Krankheiten, lebensbedrohlichen Sepsis, ist häufiger in einer Subpopulation mit zugrunde liegenden medizinischen coBedingungen ausgebracht 11, der Alkoholismus, Lebererkrankungen, Diabetes, Nierenkrankheit, Bösartigkeit und andere Bedingungen zu einer geschwächten Immunantwort führt. Bemerkenswert ist , ist diese Gruppe von Individuen , auch zu einem höheren Risiko für schwere Vertrags von V. verursachte Krankheiten vulnificus, die in natürlichen Lebensräume ähnlich wie V. gefunden werden kann parahaemolyticus. V. parahaemolyticus wird routinemäßig unter Verwendung von Thiosulfat-Citrat-Gallensalze-Saccharose (TCBS) Agar als selektiver und Differenzierungsmedium isoliert. Die Anreicherung in alkalischem Peptonwasser kann Isolation auf TCBS Agar vorangehen. Präsumptive Kolonien auf TCBS werden dann weiter in einer Reihe von biochemischen Tests getestet und / oder molekulare Assays, die die Anwesenheit von Spezies-spezifischen Gene Targeting. PCR-basierten Verfahren werden häufig verwendet , um die Identität von V. bestätigen parahaemolyticus durch das thermolabile Hämolysin - Gen verstärkt, tlh 12. Unabhängig von der chStimm - Bestätigungsverfahren ist es wichtig , ein wirksames Medium zu haben , V. , zu isolieren und zu differenzieren parahaemolyticus von anderen Meeres Vibrionen in den ersten Platz. TCBS hat routinemäßig innerhalb der Vibrio Gattung Spezies zu unterscheiden , entsprechend ihren Fähigkeiten Saccharose 12 zu gären eingesetzt. Positive Fermentationsreaktion wird durch eine Farbänderung des pH - Indikators Bromthymolblau begleitet. V. parahaemolyticus Kolonien sind ziemlich unverwechselbar auf TCBS, Ausstellen blau zu grün. Jedoch kann dieses Medium nicht leicht unterscheiden V. alginolyticus und V. cholerae. Sucrose-Fermentation von Proteusarten gelbe Kolonien ähnlich V. produzieren kann cholerae oder V. alginolyticus 13. Bei der ersten Isolation auf TCBS, V. parahaemolyticus kann auch als Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides falsch identifiziert werden, und Pseudomonas spp 14. Stämme mit verzögerter Saccharose fermsentation kann mit anderen Saccharose nonfermenting Vibrio 13, verwechselt werden , die V. umfassen parahaemolyticus. TCBS wurde als nicht empfindlich gegen Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens unter anderem gefunden. Mehrere andere Arten ergeben grün zu grau Kolonien , die mit V. möglicherweise verwechselt werden parahaemolyticus oder V. vulnificus 15. Als Ergebnis ist es wünschenswert , alternative Kulturmedien zu Erfassung mit einer besseren Empfindlichkeit und Spezifität und V. Isolierung zu entwickeln , parahaemolyticus und andere eng verwandte Arten. Mehrere Medien Alternativen vor kurzem entwickelt wurden. Neben der Aufnahme von selektiven Agenzien, inkorporieren meisten chromogene Substrate Spezies zu unterscheiden, basierend auf ihrer unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten. Beispielsweise Indoxyl-β-glucosid und indoxyl-β-galactosid wurden als chromogene Substrate verwendet , zu unterscheiden V. parahaemolyticus Kolonien (die blaugrün erscheinen) von denen V. cholerae (lila) aufgrund ihrer unterschiedlichen Fähigkeiten β-Glucosidase und 16 β-Galactosidase zu produzieren. Verschiedene Formulierungen von chromogenen Agar von mehreren Gruppen entwickelt wurden bewertet und wurden zur Durchführung vergleichsweise gemeldet oder besser als TCBS 17,18,19. Ein Vorteil eines chromogenen Mediums besteht darin, dass die Färbung des umgebenden Mediums minimal ist, wodurch die Isolierung von bestimmten Kolonien zu erleichtern. In dieser Studie haben wir die Fähigkeit eines neu chromogenes Medium formuliert zu detektieren und zu isolieren , V. cholerae, V. parahaemolyticus und V. vulnificus; mit einem besonderen Fokus auf seine Fähigkeit , V. zu unterscheiden parahaemolyticus von anderen Spezies.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0418-17-7</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Blender</td><td>Any</td><td></td><td>to blend oyster meat</td></tr><tr><td>CampyGen gas generator</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>CN035A</td><td>to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands</td></tr><tr><td>Chocolate agar plates</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>E14</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Common PCR reagents (dNTPs, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; Polymerase)</td><td>Any</td><td></td><td>or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)</td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50712</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S348903</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Gel doc</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HardyChrom Vibrio agar plates</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>G319</td><td>This study evaluates this medium</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>10 microliter-size was used in this study</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Oysters</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>R23701</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Pipette and tips</td><td>Any</td><td></td><td>Sterilized tips</td></tr><tr><td>Primers for &lt;em&gt;tlh&lt;/em&gt;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreader</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td>Beads may be used instead</td></tr><tr><td>Stomacher blender</td><td>Stomacher</td><td>400</td><td>Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.&amp;nbsp; Other homogenizer can be used.</td></tr><tr><td>Sterile filter bags for blenders</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-5</td><td></td></tr><tr><td>TCBS powder</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>265020</td><td>This study evaluates this medium</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSB powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-07-5</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>UV viewing cabinet</td><td>Any</td><td></td><td>Emit long-wave UV light</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Any</td><td></td><td>&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Sources&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial species and strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aeromonas hydrophila&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Campylobacter jejuni&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Proteus mirabilis&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt; Choleraesuis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella boydii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella flexneri&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella sonnei&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Vibrio alginolyticus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. cholerae&lt;/em&gt; (serotypes include &lt;em&gt;O139, O1,&lt;/em&gt; non &lt;em&gt;O1, El Tor&lt;/em&gt; biovars)</td><td>FDA, ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. damsela&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fisheri&lt;/em&gt;</td><td>Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fluvialis&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. furnissii&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. hollisae&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. metschnikovii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. mimicus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. parahaemolyticus&lt;/em&gt; (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td>ATCC, FDA, CDC, Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. proteolyticus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. vulnificus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of a more sensitive and specific chromogenic agar medium for the detection of vibrio parahaemolyticus and other vibrio species

Lebensmittelbedingte Infektionen in der durch Vibrio - Spezies verursacht USA haben einen Aufwärtstrend gezeigt. In der Gattung Vibrio, V. parahaemolyticus verantwortlich für die meisten Vibrio -assoziierten Infektionen. So präzise Differenzierung zwischen Vibrio spp. und Detektion von V. parahaemolyticus ist von entscheidender Bedeutung für die Sicherheit unserer Nahrungsmittelversorgung zu gewährleisten. Obwohl molekulare Techniken immer häufiger sind, kultur je Methoden sind immer noch routinemäßig durchgeführt, und sie sind unter bestimmten Umständen von Standardmethoden in Betracht gezogen. Daher wurde eine neue chromogene Agarmedium mit dem Ziel untersucht , eine bessere Methode zur Isolierung und der Differenzierung von klinisch relevanten Vibrio spp bereitzustellen. Das Protokoll verglichen , um die Sensitivität, Spezifität und Nachweisgrenze für die Detektion von V. parahaemolyticus zwischen dem neuen chromogenes Medium und einem herkömmlichen Medium. Verschiedene V. parahaemolyticus - Stämme (n = 22) rediverse Serotypen und die Quelle der Herkunft präsentiert wurden verwendet. Sie waren zuvor von der Food and Drug Administration (FDA) und Centers for Disease Control and Prevention (CDC) identifiziert und weiter in unserem Labor von TLH -PCR verifiziert. In mindestens vier getrennten Versuchen wurden diese Stämme auf dem chromogenen Agar und Thiosulfat-Citrat-Gallensalze-Saccharose (TCBS) Agar beimpft, die die empfohlene Medium zum Kultivieren dieser Spezies ist, gefolgt von einer Inkubation bei 35-37 ° C für 24 -96 h. Drei V. parahaemolyticus - Stämme (13,6%) wuchs nicht optimal auf TCBS, dennoch zeigte grüne Kolonien , wenn es Wachstum war. Zwei Stämme (9,1%) brachte nicht die erwarteten Cyan Kolonien auf dem chromogenen Agar. Nicht V. parahaemolyticus - Stämme (n = 32) wurden auch die Spezifität des chromogenen Agar zu bestimmen getestet. Unter diesen Stämmen wuchsen, 31 nicht oder anderen Morphologien Kolonie ausgestellt. Die mittlere Rückgewinnung von V. parahaemolyticus auf der chromogenic Agar war ~ 96,4%, bezogen auf CASO-Agar mit 2% NaCl ergänzt. Im Ergebnis ist die neue chromogene Agar ein effektives Medium V. nachzuweisen parahaemolyticus und es von anderen Vibrionen zu unterscheiden.

In dieser Studie wurden 54 Mikrobenstämme zusammengebaut, das in der V. 22 - Stämme enthalten parahaemolyticus Spezies Vibrio 19 andere Arten und 13 nicht Vibrio - Spezies (Tabelle 1). Die meisten V. parahaemolyticus Stämme wurden entweder von der FDA, CDC oder anderen staatlichen Gesundheitsbehörden erhalten. Sie stellen diverse Serotypen und Isolation Quellen. Diese Stämme wurden zuvor von den Aufsichtsbehörden identifiziert. Wir bestätigten weiter die Identität dieser V. parahaemolyticus durch eine tlh -PCR 21,22 durch. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Spezies </td><td rowspan="2"> Anzahl der getesteten Stämme </td><td colspan="2"> Wachstum und Farbe der Kolonien </td></tr><tr><td> TCBS </td><td> Chromogenic Medium </td></tr><tr><td rowspan="2"> Aeromonas hydrophila </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> Kein Wachstum </td><td> 1-Stamm kein Wachstum; </td></tr><tr><td> 1-Stamm Farbe Magenta </td></tr><tr><td> Candida albicans </td><td> 1 </td><td> Schwaches Wachstum, gelb </td><td> Kein Wachstum </td></tr><tr><td> Campylobacter jejuni </td><td> 1 </td><td> Kein Wachstum </td><td> Kein Wachstum </td></tr><tr><td> Escherichia coli </td><td> 1 </td><td> Kein Wachstum </td><td> Schwaches Wachstum, Magenta </td></tr><tr><td> Proteus mirabilis </td><td> 1 </td><td> Kein Wachstum </td><td> Kein Wachstum </td></tr><tr><td> Pseudomonas aeruginosa </td><td> 2 </td><td> Türkis </td><td> Gelb </td></tr><tr><td> Staphylococcus aureus </td><td> 1 </td><td> Schwaches Wachstum, gelb </td><td> Kein Wachstum </td></tr><tr><td> Salmonellen choleraesuist </td><td> 1 </td><td> Kein Wachstum </td><td> Kein Wachstum </td></tr><tr><td> Shigella boydii </td><td> 1 </td><td> Kein Wachstum </td><td> Kein Wachstum </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 1 </td><td> Kein Wachstum </td><td> Kein Wachstum </td></tr><tr><td> Shigella sonnei </td><td> 1 </td><td> Kein Wachstum </td><td> Schwaches Wachstum, Magenta </td></tr><tr><td> Vibrio alginolyticus </td><td> 3 </td><td> Gelb oder Türkis </td><td> Gelb </td></tr><tr><td> V. cholerae </td><td> 4 </td><td> Gelb oder Türkis </td><td> Magenta </td></tr><tr><td> V. damsela </td><td> 1 </td><td> Türkis </td><td> Kobalt </td></tr><tr><td> V. fisheri </td><td> 1 </td><td> Schwaches Wachstum, gelb </td><td> Kein Wachstum </td></tr><tr><td> V. fluvialis </td><td> 1 </td><td> Türkis </td><td> Kobalt </td></tr><tr><td> V.furnissii </td><td> 1 </td><td> Gelb </td><td> Gelb </td></tr><tr><td> V. hollisae </td><td> 1 </td><td> Türkis </td><td> Gelb </td></tr><tr><td> V. metschnikovii </td><td> 1 </td><td> Kein Wachstum </td><td> Kein Wachstum </td></tr><tr><td> V. mimicus </td><td> 1 </td><td> Türkis </td><td> Magenta </td></tr><tr><td> V. parahaemolyticus </td><td> 22 </td><td> Die meisten Stämme türkis </td><td> Die meisten Stämme Cyan; wenige klar </td></tr><tr><td> V. proteolyticus </td><td> 1 </td><td> Türkis </td><td> Kobalt </td></tr><tr><td> V. vulnificus </td><td> 4 </td><td> Türkis oder klar </td><td> Magenta </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Mikrobielle Spezies verwendet in dieser Studie und ihrer Wachstumseigenschaften auf selektiven und differentiellen Medien. Farbe Berufung war based auf ein Farbrad. Cyan ist ähnlich teal; Magenta ist ähnlich rötlichen Lavendel, türkis bis grün ähnlich, gelb umfasst Oliv und Braun. Vier separate Studien wurden durchgeführt, um das Wachstum und Koloniemorphologie dieser Stämme auf selektiven und differentiellen Medien zu bestimmen - TCBS und dem chromogenen Agar. TCBS ist das herkömmliche Medium für die Isolierung einiger Vibrio Spezies, einschließlich V. cholerae und V. parahaemolyticus 12. Farbvariation der Kolonien auf TCBS gewachsen war gelb, türkis (grün) oder klar (Abbildung 1). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig1.jpg" /> Abbildung 1. Koloniemorphologie von Vibrio spp. auf TCBS Agar. V. parahaemolyticus (türkis), V. cholerae (gelb), und am<html> ixed Inokulation der beiden Arten (a). Kolonien von V. parahaemolyticus erscheinen türkis, mit einem kreisförmigen, ganze und konvexe Morphologie (b). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54493/54493fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54493/54493fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Fähigkeit eines neuen chromogenen Medium für klinisch relevante Spezies Vibrio ausgewählt aus der Lebensmittel- und Umweltproben wurde getestet. Zusätzlich zu der Fähigkeit dieses Medium gleichzeitig diese Arten sich voneinander unterscheiden, wurde bewertet. Colony Farbe auf dem chromogenen Agar beobachtet wurden , Kobalt, Cyan, Magenta, Gelb oder klar (Abbildung 2). Wie in Tabelle 1 gezeigt ist , sowohl TCBS und das chromogene Agar zeigten bestimmte Grad an Selektivität gegenüber nicht - Vibrio Mikroorganismen. 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig2.jpg" /> Abbildung 2. Koloniemorphologie von Vibrio spp. auf dem neu entwickelten chromogenen Agar. V. parahaemolyticus (cyan), V. cholerae (Magenta) und eine gemischte Inokulation der beiden Arten (a). Kolonien von V. parahaemolyticus erscheinen Cyan, mit einem kreisförmigen, ganze und konvexe Morphologie (b). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54493/54493fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54493/54493fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Im Anschluss an die Standard - Platte Count - Methode über Nacht Kulturen, Kolonien von V. parahaemolyticus wurden auf den chromogenen Agar - Platten beobachtet den höchsten Verdünnungsfaktor empfangen (dh df = 10 -8). Diese Ergebnisse waren vergleichbar mit denen auf einem nicht-selektiven Medium (TSAS). Dies legt nahe, dass die Nachweisgrenze des chromogenen Mediums auf nicht-selektiven Medien ähnlich ist, die etwa 10 Zellen oder weniger in Abwesenheit von Nahrungsmittelmatrix ist. Die Erkennungsleistung für andere Vibrio - Arten , wie V. alginolyticus, V. fluvialis und V. Dirne war auch anständig im Vergleich zu den nicht - selektiven Medium. Jedoch einige Stämme von V. cholerae, V. vulnificus und V. mimicus ergab 10- bis 100-fach weniger CFU auf dem chromogenen Agar. Die selektive Mittel in den chromogenen oder anderen selektiven Medien unweigerlich einige Zellen hemmen. Verletzten Zellen, zum Beispiel, könnte nicht in selektivem Medium zu erholen. Dennoch ist die etwas schlechtere Nachweisfähigkeit ein Nicht-Thema in den meisten Routineverfahren, das einen Anreicherungsschritt einzusetzen. Geringe Menge an Mikroorganismen in der Nahrungsmittel- oder Umweltprobe würde zu einem hohen Niveau in der Anreicherungsbrühe multiplizieren, übertraf der Nachweisgrenze. Die Anreicherung in alkalischem Peptonwasser ist often durchgeführt 12 , um die Prävalenz von Vibrio - Spezies in Umweltproben zu bestimmen. In Gegenwart von Auster Homogenat setzte sich der chromogenen Agar ein gutes Maß an Erholung anzuzeigen. Mit anderen Worten, ein großer Teil (&gt; 70%) von V. parahaemolyticus Zellen konnten sich auf dem chromogenen Agar, unbeeinflußt von der Gegenwart von Auster - Matrix (Abbildung 3a) zu wachsen. Das Wachstum und die Erholung von V. parahaemolyticus Zellen wurde auch nicht durch das Vorhandensein einer anderen Vibrio - Spezies (3b) beeinflußt. Dies ist ein wichtiges Merkmal , weil Umweltproben sind gebunden an verschiedene Vibrio - Arten enthalten, die sind bei hohen Stückzahlen vor allem nach einem Anreicherungsverfahren. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig3.jpg" /> Abbildung 3. </strong&gt; Prozent Rückgewinnung eines V. parahaemolyticus Stamm in Auster Homogenat mit und ohne bakterielle Konkurrenten. Recovery (Mittelwert ± SD) wurde nach den vs der erwarteten CFU auf den Agarplatten zählen beobachtet berechnet. Erwartet wurde CFU Zahl basierend auf der Bakterienlast in dem Inokulum berechnet. Hohe Rückgewinnung eines V. parahaemolyticus Stamm wurde auf allen Medien , ohne den Wettbewerb zu beobachten (a). Ähnliche Niveau der Erholung wurde , wenn ein hohes Maß an V. beobachtet metschnikovii Zellen vorhanden war (b). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54493/54493fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54493/54493fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Um die chromogene und TCBS Agar vergleichen, die Empfindlichkeit und Spezifität wurden berechnet. Tabelle 2 zeigt die Fähigkeit dieser Medien in AKKUrat V. identifizieren parahaemolyticus. Die Empfindlichkeit wird auf den Prozentsatz der echten positiven Zusammenhang, die die V. bedeutet parahaemolyticus - Stämme ergab die erwartete Morphologie der Kolonie auf dem Medium. Die Spezifität wird auf den Prozentsatz der wahren negativen Zusammenhang, die nicht V. bedeutet parahaemolyticus Stämme sollte kein Wachstum schlecht zeigen, oder einer anderen Kolonie Morphologie als V. parahaemolyticus. Die Sensitivität und Spezifität für TCBS V. zu identifizieren parahaemolyticus waren 86,4% und 71,8% betragen. Im Vergleich dazu waren die Sensitivität und Spezifität des chromogenen Medium 90,9% bzw. 96,9% betragen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ein) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCBS Agar </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> Non-V. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> Gutes Wachstum und Türkis colonies </td><td> 19 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Schlechtes Wachstum oder nicht-türkis Kolonien </td><td> 3 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> b) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chromogene Agar </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> Non-V. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> Gutes Wachstum und cyan Kolonien </td><td> 20 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Schlechtes Wachstum oder nicht-Cyan Kolonien </td><td> 2 </td><td> 31 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2 Sensitivität und Spezifität von TCBS (a) und chromogenem (b) Agar in der Detektion von V. parahaemolyticus. Die Identitäten von V. parahaemolyticus wurden zuvor durch biochemische Tests und tlh- PCR bestimmt.

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Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Und andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Arten

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

14.4K Aufrufe.  California Polytechnic State University. Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium. 

Serie: Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent &#39;Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Ökotoxikologische Methode mit Meeresbakterien<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Zur Beurteilung der akuten Toxizität von Umweltschadstoffen

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Umwelt

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

Colonization von Euprymna scolopes Squid durch Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Biotechnik

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Klinische und umweltliche Isolate

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Schwimmer und Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von

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"Bioluminescent 'Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Ökotoxikologische Methode mit Meeresbakterien

Colonization von Euprymna scolopes Squid durch Vibrio fischeri

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

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