Name: a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba at JoVE.com

KP ve AS yazdı ve el yazması yeniden düzenlendi. KP deneyler ve analizi yapılır. Bu eser as için Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH) kariyer geçiş Ödülü (K22AI112816) tarafından desteklenmiştir

Tüm deneysel prosedürler University of California, Irvine gerçekleştirilmiştir.
1. arabellekleri ve çözümleri
<ol><li>Lysogeny suyu (LB) 1 L cam şişede 1 litre çift distile su (GKD2O) 25 g LB-Miller karışımı ekleyerek hazırlayın. Petri yemekler için agar bir ek 20 g ekleyin. Sterilize etmek için basınçlı kap. Erimiş agar orta 25 mL 10 cm-çap Petri yemekleri dökün ve oda sıcaklığında kuvvetlendirmek için izin verir. Oda sıcaklığında sıvı medya ve ağar kaplamalar 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>D-glikoz 1 gr karıştırılarak bir 1 L cam şişe glikoz Maya pepton (saçma) levha hazırlamak, pepton, Maya 0, 25 g, 2 g özü, KH2PO44.2 g, Na2HPO47 H2O 5,1 g ve agar GKD2 1 L 25 g O. otoklav sterilize etmek için. Erimiş agar 25 mL 10 cm-çap Petri yemekleri dökün ve oda sıcaklığında kuvvetlendirmek için izin verir. 4 ° C'de mağaza</li>
	<li>10 g pepton karıştırarak 1 L cam şişe pepton S (PS) ortamda hazırlamak, 7 gr maya ekstresi, 15 g D-glikoz, 0,12 g Na2HPO47 H2O, KH2PO41.4 g, vitamin B12 40 µg , ve 80 µg GKD2O. 800 mL folik asit pH metre bir gün içinde kullanılmamış olan pH 4 ve pH 7 standartları kullanarak bir elektronik pH metre kalibre.<ol>
<li>PH metre kullanarak PS orta pH ölçmek. 5 M KOH ya 5 M H3PO4 pH 6.5 ayarlamak için ekleyin. 1 m'ye son ses seviyesini GKD2O. filtre kullanarak 0,22 µm vakum filtre kullanılarak sterilize ve depolamak 4 ° C'de Not: koruyucu ekipman eldiven, koruyucu giysiler, göz koruma da dahil olmak üzere giyerek pH ayarlamaları ile dikkatli bir şekilde sürdürmek ve koruma yüz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 x geliştirme arabellek Prime hazırlamak (DB') arabellek KH2PO4, 13.4 g Na2HPO4 7 H2O, GKD2O 3.4 g 800 mL toplam bir birime ekleyerek bir 1 L cam şişede. PH metre bir gün içinde kullanılmamış olan pH 4 ve pH 7 standartları kullanarak bir elektronik pH metre kalibre.<ol>
<li>Elektronik pH metre kullanarak arabellek pH ölçmek. PH 6.5 yavaşça 5 M KOH veya gerektiği gibi 5 M H3PO4 ekleyerek ayarlayın. 1 GKD2O kullanarak L için son ses seviyesini ve ısıyla tarafından sterilize. Oda sıcaklığında saklayın. Not: koruyucu ekipman eldiven, koruyucu giysiler, göz koruma da dahil olmak üzere giyerek pH ayarlamaları ile dikkatli bir şekilde sürdürmek ve koruma yüz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 x geliştirme arabellek (DB) 100 mL 10 karıştırılarak olun DB x' arabellek ile 1 mL steril 2 M MgCl2ve 1 mL steril 1 M CaCl2. Bir autoclaved sterilize GKD2O. mağaza oda sıcaklığında kullanarak 1 L cam şişede 1 m'ye son ses düzeyini ayarlayın.</li>
	<li>PS:DB orta bir 1 L cam şişe 100 mL steril PS orta karıştırılarak hazır ol, 100 mL steril 10 DB x' tampon ve steril GKD2O birime bir toplam 1 L. ek ile 1 mL steril 2 M MgCl2 ve 1 mL steril 1 M CaCl 2. 4 ° C'de mağaza</li>
	<li>Calcein-AM hisse senedi çözüm calcein-AM üretici tarafından sağlanan plastik kap içinde 50 µg DMSO 50 µL ekleyerek hazırlayın. -20 ° C'de mağaza</li>
</ol>2. büyüme ve amip Bakımı
<ol><li>E. coli zorlanma B/r17 amip için bir besin kaynağı olarak ilk büyüme döneminde büyümek. Çizgi E. coli B/r donmuş bir stoktan bir LB agar plaka üzerine-80 ° C'de depolanan ve 37 ° tek kolonileri elde etmek için C bir gecede kuluçkaya.</li>
	<li>E. coli B/r bir koloni 2 mL LB orta içine aşılamak ve bir rulo davul veya bir shaker 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Gecede E. coli kültür oda sıcaklığına getirmek. Tahta bir sopa kullanarak, amip gecede kültür 750 µL-80 ° C'de tutulan bir donmuş stoktan aşılamak. Not: axenic büyüme18yeteneğine sahip olan kullanım D. discoideum gerilme AX3. Axenic büyüme bu adım gerekli değildir, ancak sonraki adımları onun gereksinimi olacaktır.</li>
	<li>Hemen 700 µL amip -E. coli karışımdan bir glikoz Maya pepton (saçma) plaka üzerine ekleyin. Kültür plaka yüzeyine eşit olarak ileri geri ve yan-yan gerektiği gibi eğerek yayıldı. Bir dağıtıcı kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>DOLANDIRMAK plaka agar yüksek nem korur bir kutu içinde yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. İki tek kullanımlık plastik kaplar kullanın (183 cm x 183 cm x 91 cm) birbiri üstüne yığılmış. Alt kapsayıcı yaklaşık 25 mL su doldurun ve nem su deposu üst kapsayıcıya taşımak izin vermek için kapsayıcı döşeme ile delinmiş birkaç 0.5 cm çapında delik top konteyner yerleştirin.</li>
	<li>Kuluçkaya DOLANDIRMAK plaka ve kutusu 22 ° c 4-5 gün kadar amip Sporlar (Şekil 2) plaka yüzey büyüyen gözlenir. Soğutmalı inkübatör kuluçka oda sıcaklığında yerine tabak kuluçkaya için kullanın. Not: Sporlar büyüdü sonra 4 ° C'de saklandığında uygun birkaç hafta plakalar üzerinde kalırlar Tabakları agar yüzü yukarı bakacak şekilde depolar. 3-4 gün sonra kuluçka, bölgelerini Temizleme bakteriyel çim içinde da amip sporulation başlangıcı gösteriyor görülebilmektedir.<ol>
<li>Küçük amip Sporlar plaka yüzeyi yukarıda kuluçka (Şekil 2) 4-5 gün sonra gözlemlemek. Not: Bu süre Sporlar kalitesini düşürür gibi amip bir haftadan uzun büyümek değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amip Sporlar steril 1 mL pipet ucu plaka yüzeyine paralel süpürme tarafından amip axenic büyümesi için hazırlamak için toplamak. Sporlar 10 cm Petri kabına yarısı toplamak. Not: Bu hareket çok sayıda E. colitopladıkça ucunu agar plaka yüzeyine dokunmaktan kaçının.</li>
	<li>Amip pipet ucu ucunu PS orta 1 mL çeker ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetting resuspend.</li>
	<li>İnoculated karışımı 0,25 x konsantrasyon, antibiyotik antimycotic çözüm ile takıma PS orta 25 mL içeren bir 250 mL şişe içine aktarın. Not:-20 ° C'de 250 µL aliquots olarak antibiyotik antimycotic çözüm saklamak Bu onun etkinliğini azaltabilir gibi bu çözümü dondurma ve çözme yinelenen döngüleri kaçının.</li>
	<li>Amip axenically 22 ° C'de 100 rpm'de dönen bir shaker büyümek. Adım 5'te virülans tahlil için 600 ölçülen bir optik yoğunluk için hücrelerin büyümesine nm (OD600) 0,2-0,5. Not: 3-4 gün büyüme aşılama (adım 2.7) zaman bu adımı gerektirir. Hücreler için yüksek yoğunluklu büyüdü Eğer PS orta bir OD600 0,05 veya daha düşük olarak geri kültüründe sulandırmak ve geri bir OD600 0,2-0,5 için büyür.</li>
</ol>3. P. aeruginosa büyüme
<ol><li>P. aeruginosa bir koloni bir LB plaka almak, 2 mL PS:DB kültür aşılamak ve 37 ° C'de doygunluk için bir gecede büyümek. Not: antibiyotik antimycotic çözüm PS:DB ortama eklemeyin.</li>
	<li>1 gecede kültür: 100 veya 1:1,000 6 cm-çap Petri kabına PS:DB kullanarak oranında seyreltin. Planktonik hücre virülans yalnızca denetlesinler Eğer geleneksel Kültür tüpleri yerine kullanmayı kültürler büyümek. 37 ° C'de 100 RPM ayarla benchtop rotator Tarih kültür sallamak</li>
	<li>Hasat kültürleri tekrarlanabilirlik emin olmak için zaman belirli noktalarda. Virülans değerlendirilmesi önce 1 saat 30 dk 4 bölümünde açıklandığı gibi bir agar pad hazırlayın. Not: P. aeruginosa virülans yaklaşık 8 h büyüme yüzeylerde tarafından indüklenen.</li>
	<li>Yüzey bağlı hücreleri izole etmek için sıvı orta Petri kabına kaldırmak, hemen DB arabellek planktonik hücreleri kaldırmak için 1 mL ile yıkayın ve hemen 5.1 adıma geçin. Dikkat: 30'dan daha uzun yıkama yok s olarak bu huzursuz ve hücre yüzey bağlı bağlantısını kesin ve virülans ölçüm etkileyebilir.</li>
	<li>Planktonik hücreleri izole etmek için kültür 10 µL Petri kabına temiz bir Petri kabına aktarmak ve hemen 5.1 adıma geçin.</li>
</ol>4. mikroskobu - Agar Pad hazırlanması
<ol><li>Amip P. aeruginosaile karışık olması hazır önce agar yastıkları yaklaşık 30 dk 1 h için hazır olun.</li>
	<li>Mikrodalga bir 250 mL şişe arabellekte DB %1 (w/v) agar 50 mL. Mix her 20 s agar kümeleri kadar yok.</li>
	<li>Erimiş agar 15 dakika önceden ısıtılmış 55 ° C su banyosunda yerleştirerek serin.</li>
	<li>Calcein-AM hisse senedi çözüm 15 µL 15 mL konik tüp içinde erimiş agar ekleyin. Yavaşça tüp 4 - 5 kez ters çevirme tarafından karıştırın ve hemen sonraki adıma geçin. Not: bir polipropilen 15 mL santrifüj tüpü bu adımı gerçekleştirin. Bu çok hızlı bir şekilde katılaşmaya agar neden olur kalın cam kaba kullanmayın.</li>
	<li>12 cm x 10 cm cam levha üzerine erimiş agar karışımı dökün ve oda sıcaklığında 10 dakika katılaşmaya agar sağlar. Katılaşmış agar yastık daha küçük 1,5 cm x 1,5 cm bölümlere cam levha Yazdırılan kılavuz yerleştirme ve kesme metal cetvel kullanarak kılavuzu boyunca kesilmiş.</li>
	<li>Kullanıma hazır olması ne kadar nemli bir kutu içinde sulu jel tutmak.</li>
</ol>5. mikroskobu - bakteri-amip örnek hazırlanması için görüntüleme
<ol><li>Bakteri hücreleri yüzeye bağlı virülans tahlil için amip hücre 10 µL 2.10 adımından yüzey bağlı bakterilerden adım 3.4 ekleyin. Not: Amip bakteri ile karıştırma bu adımı açıklamaktadır.</li>
	<li>Planktonik hücre virülans tahlil için adım 3.5 planktonik bakterilerin 10 µL adım 2.10 amip hücre 10 µL karıştırın. Not: bakteri ile karıştırma önce axenically yetiştirilen amip hücreleri (adlı bir OD600 0,2-0,5) yıkama yok. Antibiyotik antimycotic çözüm kullanımı nedeniyle amip kültüründe yok E. coli büyüme gözlenir.</li>
	<li>Derhal 1,5 cm x 1,5 cm calcein-AM agar pad adım 4.5 bakteri-amip karışımı üzerine Petri kabına zemine yerleştirin. Not: agar pad hızlı bir yumuşak hareket kullanarak karışımı üzerine yerleştirin. Panelindeki karışım üzerine yavaş yavaş olarak bu hareket çevre doğru ve uzak alt Pad hücreleri itmek eğilimi daha düşük değil. Bu adımı bakteri ve amip eşit olduğundan emin olun karışık, immobilize ve her iki tip hücre aynı uçağa sınırlı.</li>
	<li>Aşırı sıvı yavaşça agar pad çevreleyen kalan herhangi bir sıvı pipetting tarafından kaldırın. Petri kabına oda sıcaklığında 20 dakika kurumasını sağlar.</li>
	<li>Bir kapak ile Petri dish ile kapak ve immobilize amip-bakteri karışımı bir ek 40 dk. Proceed adım 6.1 için oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: Tüm örneklerini zaman içinde arka plan floresans arttıkça aynı süre için kuluçkaya önemlidir. 1 h bir kuluçka süresi önerilir. İncubations 1 saat daha uzun süre amip hücreleri patlamaya başlayabilir daha az tekrarlanabilir.</li>
</ol>6. mikroskobu - resim alma
<ol><li>Aydınlık alan ve yeşil floresans görüntüleri alma yeteneğine sahip bir floresan mikroskop kullanarak görüntü amipler. Yeşil floresan için yeşil floresans protein (GFP) filtreleri 474/27 ile nm ve 525/45 nm uyarma ve emisyon, anılan sıraya göre. Amip görüntü için bir 10 X (≥0.3 sayısal diyafram) hedefi kullanın. Not: Calcein-AM agar yeşil floresans kanalda floresan için ölen amip neden olur. Sağlıklı amip Aksi takdirde floresan değildir.</li>
	<li>Edinme kez GFP kanalları fototoksisite sınırlamak ve dinamik alan görüntü yoğunluklarını optimize faz kontrast için ayarlayın. Fark girişim kontrast (DIC) faz kontrast yerine. Not: 100-200 ms Etkilenmeler faz kontrast ve GFP floresan için mümkünse kullanın. Tüm deney boyunca değişmeden pozlama ve enstrüman ayarlarını almak. Bu ana bilgisayar öldürme dizin bilgi işlem için önemlidir.</li>
	<li>Öldürme Dizin ana hesaplamak için iyi istatistikler elde etmek için en az 100 amip hücreler için görüntüleri elde.</li>
</ol>7. görüntü analizi ve ana bilgisayar öldürme Dizin
<ol><li>ImageJ kullanarak görüntü analizi gerçekleştirin.</li>
	<li>Faz kontrast görüntü dosyası içinde ImageJ Dosya açmak | Açık ve görüntüsü seçin. Görüntü tıklayarak eşik ayarlamak | Analiz | Eşik. Sadece yoğunluğu tepe (Şekil 3A) seçmek için alt ve üst eşik ayarlayın.</li>
	<li>İşlemi tıklatarak görüntü ikiliye dönüştürme | İkili | İkili yapmak. İşlemi seçerek delikleri | İkili | Delikleri. Not: görüntü kaynağı olarak Şekil 1 ' de kullanarak adımları 7.1-7,2 amip ve bakteri yüzey bağlı karanlık bölgeleri (Şekil 3B) görünür bir resim üretecek.</li>
	<li>Analiz alan ve gri değeri demek kutularını işaretli olduğundan emin olun | Ayarla ölçümleri. Ana araç çubuğunda oval aracını seçerek amip yaklaşık boyutunu ölçmek. Tıklayın analiz | Ölçü ve temsilcisi amip alanını not edin.</li>
	<li>Analiz tıklatarak amip için maske oluşturun | Parçacıklar analiz. Boyut kutusunda, amip içerir ancak bakterileri dışarıda alanı girin. Maskeler aşağı açılan menü çubuğunda göster seçeneğiiçin'i seçin. Yöneticisine Ekle kutusunun işaretli olduğundan emin olun.</li>
	<li>Tıkırtı OK ve sadece amip ve bir yatırım getirisi Yöneticisi iletişim kutusu (Şekil 3C) gözükür gösteren bir resim.</li>
	<li>Floresan görüntü kullanarak dosyasını açın | Açık ve uygun dosyayı seçerek. Tüm bölgelerin üst karakter tuşunu basılı tutarak ve tıklamak (Şekil 3D) listesindeki her bölgesindeki ROI Yöneticisi'ni seçin.</li>
	<li>ROI Yöneticisi ölçü birimi düğmesini tıklatın. Bu-ecek açık her amip ortalama yoğunluk değerini görüntüleyen bir sonuçlar pencere.</li>
	<li>Floresans değerleri her amip için bir elektronik tablo programına kopyalama ve dizin tüm floresans değerlerin ortalamasını alarak öldürmek ana hesaplar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease.">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).</li><li>Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella,+the+host+and+disease:+a+brief+review.">Salmonella, the host and disease: a brief review.</a> Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).</li><li>Alibaud, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+virulence+genes+identified+in+a+Dictyostelium+host+model.">Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).</li><li>Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+pathogen+Pseudomonas+aeruginosa+utilizes+conserved+virulence+pathways+to+infect+the+social+amoeba+Dictyostelium+discoideum.">The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).</li><li>Cosson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+Virulence+Analyzed+in+a+Dictyostelium+discoideum+Host+System.">Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).</li><li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+bacterial+protein+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+using+the+Dictyostelium+host+model+system.">Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).</li><li>Steinert, M., Heuner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+as+host+model+for+pathogenesis.">Dictyostelium as host model for pathogenesis.</a> Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).</li><li>Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum:+a+new+host+model+system+for+intracellular+pathogens+of+the+genus+Legionella.">Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).</li><li>Matz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+uses+type+III+secretion+system+to+kill+biofilm-associated+amoebae.">Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae.</a> ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).</li><li>Hauser, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+III+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa:+infection+by+injection.">The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).</li><li>Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+pH+insensitive,+two+color+fluorescence+viability+(cytotoxicity)+assay.">A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay.</a> Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).</li><li>Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+calcein+acetoxy+methyl+ester+and+ethidium+homodimer+or+propidium+iodide+for+viability+assessment+of+microbes.">Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes.</a> Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).</li><li>Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+attachment+induces+Pseudomonas+aeruginosa+virulence.">Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).</li><li>Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+staining+assessment+of+Schwann+cell+viability+within+whole+peripheral+nerves+using+calcein-AM+and+ethidium+homodimer.">Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer.</a> Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).</li><li>Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-isotopic,+highly+sensitive,+fluorimetric,+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes.">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).</li><li>Grieshaber, P., Lagr&#232;ze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+fluorogold-prelabeled+retinal+ganglion+cells+with+calcein-AM:+A+new+method+for+assessing+cell+vitality.">Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality.</a> Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).</li><li>Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+Differences+in+Sensitivity+to+Radiation+in+Escherichia+Coli.">Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+Dictyostelium+discoideum+to+nucleic+acid+analogues.">Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues.</a> Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).</li><li>Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+virulence+factors+for+bacterial+pathogenicity+in+plants+and+animals.">Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals.</a> Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).</li><li>O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quorum-sensing+inhibitor+blocks+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+biofilm+formation.">A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı virülans P. aeruginosaiçinde tahlil hızlı ve nicel yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı ile diğer bakteri test edilebilir. Ancak, büyüme orta amip büyüme koşulları ile uyumlu olması gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Özellikle, PS:DB bakteriyel büyüme aracı olarak kullanan Protokolü optimize. Diğer medya kullanılması halinde, hiçbir bakteri hücreleri orta amip ile uyumlu olduğunu doğrulamak için mevcut olan bir büyüme sadece medya denetimi gerçekleştirmek gerekli olabilir.
Bu yöntem-ebilmek var olmak genişlemek virülans büyüme aşaması bağımlılığının tahlil için. Özellikle bakteriyel kültürlerde kez bir sabit zaman noktası yerine geniş bir aralığı için yetiştirilen olabilir. Deneyim, P. aeruginosa virülans büyüme aşaması üzerinde bağımlı olmak göründüğü zaman belirli noktalarda bakteriyel kültürlerde hasat önemlidir. Biz virülans P. aeruginosa içinde 6-8 h Petri yemeklerinde büyüme arasında akımıdır gözlenen.
Fazla değişken büyüme ortamı ile ilişkili ana bilgisayar sağlığı ve bakteriyel virülans etkiler. Böylece, her deneme için uygun pozitif ve negatif denetimleri kullanmak önemlidir. Bir pozitif kontrol ve ΔlasR bir negatif kontrol olarak olarak vahşi tipi yüzey bağlı P. aeruginosa kullandık. Biz bu denetimlerin her sefer virülans tahlil gerçekleştirilen performans öneririz. Bu denetimler amip, sıcaklık vb. değişimler yaşın Ayrıca, öneririz tüm deneylerin biyolojik çoğaltma kurmak için gerçekleştirme gibi konak hücre ölüm nedeniyle herhangi bir dış etken olmadığını doğrulamak için önemlidir virülans fenotipleri tekrarlanabilirlik.
Biz amip 0,2-0,5 optik bir yoğunluk kullanma seyreltme sonra en az 1:10 bizim deneyler gerçekleştirdik ve amip kültür tam ile 22 ° c sıcaklık düzenlenmiş Bu büyüme durumlar dışında bulduk amip Virülan bakteriler için duyarlılık ve virülans tahlil tekrarlanabilirlik değişmiş. Amip hücreleri nispeten hızlı bir şekilde cips. Kültürler tarafından pipetting optik yoğunluk ölçüm yapılmadan hemen önce yukarı ve aşağı resuspended emin olun. Deneme tekrarlanabilirlik yüksek yoğunlukları için büyümeyi etkiler gibi 1 daha bir OD600 yoğunluğu yüksek amip kültürler büyümek değil. Axenic kültürler artık 1 hafta daha yaymak. Buna ek olarak, amip axenically yetiştirilen doğrulamak önemlidir (2,7 adımda başlayan) 20 X veya yüksek büyütme mikroskobu böyle aracılığıyla diğer mikroplar kültüründe mevcut değildir. Kültürler ilk aşı takip büyüme 2 gün sonra adım 2.10 bulanık iseniz, bu büyük olasılıkla bir mikrobiyal kirletici varlığı gösterir. Bakteriyel kontaminasyon şüphesi varsa, amip kültür için 4-8 h 37 ° C'de 1 mL büyüyor öneririz. Bu koşullar altında bulanık bir kültürün gözlem bakteriyel kontaminasyon öneririz. Bakteriyel kirlenme görülmektedir tekrarlanan, antibiyotik antimycotic çözüm değiştirilmelidir.
Ana bilgisayar öldürme Dizin bakteriyel bir nüfus öldürücü olmayan olup, güvenilir bir göstergedir. Bu tahlil virülans (orta-düşük virülans için karşılaştırıldığındaYani, düşük virülans) farklı ara düzeyleri arasında karşılaştırmalar için optimize edilmiş değil ve aşırı sonuçların yorumlanması kaçınılmalıdır. Bu sorunu gidermek için potansiyel virülans tahlil ek Çoğalt deneyler yapmak ve uygun performans sonuçlarında güven kurmak için ana hücrelerinin farklı toplu işlemleri kullanma birden fazla gün içinde tekrarı metodlar istatistiksel analizler.
Enfeksiyon (MOI) planktonik hücre çokluğu bakteriyel kültürünün optik yoğunluk normalleştirme tarafından kontrol edilebilir. Ancak, bu tahlil yüzey bağlı bakteri hücreleri MOI denetlemez. Bakteriyel yüzey yoğunluğu zamanla arttığını gözlemledik. Böylece, Petri kabına zamanında büyüme ayarlamak karşılık gelen bir değişiklik yüzey yoğunluğu neden olabilir. Ayrıca, yüzey yoğunluğu yüzey malzeme üzerinde bağlıdır. Burada açıklanan tahlil polistren yüzeyler P. aeruginosa hücreleri iliştirin. Ancak, cam, agar ve polyacrylamide de dahil olmak üzere diğer yüzeyler de bölümü13kullanabilirsiniz. Bakteriyel nüfus tek katmanlı yüzey yoğunluğu 100 X büyütme faz mikroskobu kullanılarak ölçülebilir. Yüzey yoğunluğu çok katmanlı, confocal mikroskobu uygun olabilir.
Burada, hızlı ve sağlam bir yöntem bakteriyel virülans ölçmek için anlatmıştık. Kuluçka kez, floresan boya, bakteriyel zorlanma, konak hücre tipi veya büyüme medya gibi bağımsız parametreleri değiştirerek, bu yöntem virülans organizmalar ve büyüme koşulları geniş aralığında ölçmek için uzatılabilir.

Bakteriyel enfeksiyon, insan ve hayvan1,2' deki ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Sağlık ve araştırma ayarlarında önemli virülans bakteri kültürleri veya biyofilmler ölçmek için yeteneğidir. Burada, bakteriyel virülans ölçmek için çok yönlü, hızlı ve nispeten basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ökaryotik organizma Dictyostelium discoideum (amip) modeli ana bilgisayar organizma olarak kullanılır. D. discoideum virülans faktörleri Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 ve diğer bakteriler6,7 tanımlamak için ana bilgisayar olarak kullanılmıştır ,8 ve tip III salgı9,10da dahil olmak üzere memeli hücreleri öldürmek büyük ölçüde aynı virülans faktörleri için açıktır. D. discoideum kullanarak önceki virülans deneyleri bakteri D. discoideum hücreleri ile uzun süre maruz saat3,4,5boyunca işe. İletişim kuralı, burada, bu amip kullanarak virülans belirleme hızlı bir yöntem sunuyor. Bu iletişim kuralı (Şekil 1) açıklar nasıl yapılır: (1) axenically (içinde bakteri yokluğu) amip büyümek, (2) bakteri tahlil için büyümek, (3) bakteri hazırlamak ve konak hücreleri mikroskobu, (4) için epifluorescence mikroskobu gerçekleştirmek ve analiz (5) amip Floresan.
Amip başlangıçta donmuş stokları çizgili ve nerede amip Sporlar üretmek Escherichia coli (e.coli), çim üzerinde büyüdü. Bu sporlar aldı ve axenic büyüme için zenginleştirilmiş bir orta içine aşılandı. Bakteriyel virülans değerlendirilmesi için bakteri ile karışık olması hazır olana amip besin açısından zengin koşullarında axenic büyüme ile korunur. Hayatta kalma ya da amip ölümü, calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), hücre içi esterazlar tarafından i ciddi ve, böylece, floresans11,12için aktif floresans ölçerek sayılabilir. Canlı amip vurguladı ise az veya hiç floresans sergi ve yoğun bir şekilde ölen hücreleri bulabilsem. Calcein-AM sağlıklı amip ve birleşme içine çok az veya hiç birleşme ve stresli amip13' te substrat bölünme nedeniyle sonucudur. Bu davranış özellikle calcein-AM floresans memeli hücreleri11,14,15,16ayrıdır.
Virülans için değerlendirilecektir bakteri ayrı olarak yetiştirilmektedir. Burada, P. aeruginosa fırsatçı patojen virülans ölçmek ve ayrıntılı nasıl virülans planktonik (yüzme) ve yüzey bağlı alt nüfus ölçmek için nasıl açıklar. Bu iletişim kuralı diğer bakteri virülans sınamak için adapte olabilir. Temsilcisi sonuçları bölümünde gösterdiğimiz virülans yüzey bağlı hücrelerde aktif ve planktonik hücrelerde, düşük olduğu daha önce13bildirdi. Öldürücü olmayan planktonik hücreleri amip tarafından tüketilen iken yüzey bağlı P. aeruginosa virülans-harekete geçirmek amipler öldürür. Planktonik bakteri virülans yalnızca denetlesinler, bakteri Petri yemekler iletişim kuralında açıklandığı gibi kullanarak yerine sıradan Kültür tüpleri kültürlü olabilir.
Öyle ki kararlı duruma besin açısından zengin koşullarında, amip büyümeye ederken P. aeruginosa kültürler ve hedeflenen büyüme aşamasında ulaşmak, amip ve P. aeruginosa kültürler koordine edilmelidir. Bu durum genellikle amip kültürler bakterilerle karışınca en az 1 gün önce seyreltilmiş gerekir. Amip ve bakteri agar pedleri kullanarak immobilize, Co için 1 saat inkübe ve düşük çözünürlüklü (10 X, sayısal diyafram 0,3) objektif, yeşil floresans protein (GFP) filtre uygular ve görüntüleme bir kamera kullanarak yansıma. Analizi serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir veya görüntü analiz yazılımı özelleştirilebilir. Bizim analiz bilimsel analiz paketi13kullanılarak yazılmış kendi yazılımını kullanarak gerçekleştirildi. Yazılım faz kontrast görüntü kullanarak maske oluşturmak ve floresan görüntünün maskelenmiş alanlar floresans değerleri ayıklamak gerekir. Floresans değerler bir sayısal ana bilgisayar öldürme dizininde kaynaklanan en az 100 hücreleri üzerinde ortalama.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, dehydrated</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot &amp;lt; 1 mL and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Special peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hyroxide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain AX3&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain B/r&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 strain&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &amp;Delta;lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14-derived strain&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>For filter sterilization</td></tr><tr><td>Conical tube, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Glass storage bottles</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Petri dish, 6 cm diameter</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Petri dish, 10 cm diameter</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Plastic containers with lid</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Square 3-cup containers</td></tr><tr><td>Glass plates</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td></tr><tr><td>Wooden sticks</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 objective&amp;nbsp; 0.3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence excitation source</td><td>Lumencor</td><td>Sola light engine</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>For growth of bacteria at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Platform shaker</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Undercounter refrigerated incubator</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Isotemp waterbath&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>For cooling media to 55 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

Geleneksel bakteriyel virülans deneyleri konak hücreleri için birkaç saat boyunca uzun süre maruz bakteri içerir. Bu süre içinde bakteri fizyolojisi ana büyüme ortamı maruz ve konak hücreleri varlığı nedeniyle değişiklikleri uygulayabilir. Biz hızla hangi bakteri varlığında konak hücreleri büyümek ölçüde en aza indirmek bakteri virülans durumunu ölçmek için bir tahlil geliştirilmiştir. Bakteri ve amip birlikte karışık ve agar panelini kullanma tek bir görüntüleme uçağı üzerinde immobilize. Yordam tek hücreli floresans görüntüleme (calcein-AM) calcein-acetoxymethyl ester ile konak hücre sağlık bir göstergesi olarak kullanır. Konak hücreleri floresan 1s epifluorescence mikroskobu kullanılarak bakteri konak hücre maruz sonra analiz edilir. Görüntü analiz yazılımı bir ana bilgisayar öldürme Dizin hesaplamak için kullanılır. Bu yöntem virülans planktonik ve yüzey bağlı Pseudomonas aeruginosa içinde ölçmek için kullanılan ilk aşamasında alt nüfus biyofilm oluşumu ve diğer bakteri ve diğer aşamaları biyofilm büyüme için adapte edilebilir. Bu iletişim kuralı virülans ölçmenin hızlı ve sağlam bir yöntem sağlar ve büyüme ve bakım memeli hücre hatları ile ilgili karmaşıklığı çoğunu önler. Burada amip kullanarak ölçülen virülans fenotipleri da fare makrofajlar kullanarak doğrulanmış. Özellikle, bu tahlil bu yüzey ek upregulates virülans P. aeruginosaiçinde kurmak için kullanıldı.

Vahşi-türü büyüdük ya da P. aeruginosa süzün PA1419 ΔlasR 20 6 cm çapında Petri yemeklerinde aynı PA14 planda strain ve virülans planktonik ve yüzey bağlı hücre denetlesinler. Kültürler tek-kolonileri PS:DB kültürleri, gecede bir rulo davul 37 ° C'de tüplerde kültür ile doygunluğu yetiştirilen içine aşılanmış, 1: 100 PS:DB, 6 cm çapında Petri yemeklerinde 100 devir / dakikada sallayarak 8 h için yetiştirilen ve planktonik ve yüzey bağlı seyreltilmiş P. aeruginosa alt nüfus 3 bölümde açıklandığı gibi izole edildi.
Yüzey bağlı vahşi tipi P. aeruginosa amip, bir yuvarlak amip hücre şekil ve calcein Floresan (Şekil 4A, sol üst paneli) gözlem tarafından gösterilen öldürdü. Bu bir yüksek ana öldürme dizininde (Şekil 4B) yol açmıştır. Planktonik hücreleri amorf amip hücre şekil ve az ya da hiç calcein floresan arka plan (Şekil 4A, sağ üst paneli) yukarıda gözlenmesi ile gösterilen amip tarafından tüketilen edildi. Bu nispeten düşük ana bilgisayar öldürme dizinde (Şekil 4B) yol açmıştır. Hem yüzey bağlı ve ΔlasR baskı planktonik hücreleri dizinler (Şekil 4B, alt paneli) öldürme düşük ana bilgisayar tarafından belirtilen olduğunu amip tarafından tüketilen edildi. Virülans upregulated yüzey bağlı nüfus ve LasR yüzey aktif virülans için gereklidir böylece sonuçlar gösterir hangi oldu daha önce açıklanan13. Bu deneyler böylece sunan güçlü pozitif ve negatif denetimleri gelecekteki deneyler için kurmak.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig1.jpg"> Resim 1 : Virülans tahlil bakış açıklayan şematik. (1) amip konak hücreleri yetiştirilen, (2) bakteri kültürleri yetiştirilen ve (3) planktonik veya yüzey bağlı bakteriyel hücre amip ile karışık ve agar panelini kullanma aynı görüntüleme uçak immobilize. Konak hücreleri calcein-AM, floresans mikroskobu ve görüntü analizi kullanarak sağlık için sayılabilir. Ölçek çubukları temsil 50 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57844/57844fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig2.jpg"> Resim 2 : Amip sporlar bir DOLANDIRMAK 10 cm-çap üzerinde Petri kabına plaka 5 gün sonra büyüme. Sporlar formu Petri kabına yüzey yukarıda. İlave çanak yüzeyi tek bir bölümünü büyütülmüş bir görünümünü gösterir. Yüzey bu çözünürlükte ayırt bakteriler içerebilir. Ana ve böcek görüntüleri barlarda ölçek 1 cm 2 mm, sırasıyla temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57844/57844fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig3.jpg"> Şekil 3 : Resim ImageJ kullanarak mikroskobu veri analizi. (A) eşik aracını kullanarak en yüksek yoğunluk seçimi. (B) Şekil 1 faz kontrast kaynak görüntüden ikili bir resme dönüştürüldükten sonra Resulting görüntü. (C) görüntü daha sonra bir maske için dönüştürüldükten sonra Resulting görüntü. Seçim bölgelerinin ROI Yöneticisi'ni kullanarak ilgi (D) ekran. Ölçek çubukları temsil 50 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57844/57844fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig4.jpg"> Şekil 4 : P. aeruginosa hücreleri tarafından öldürmek amip temsilcisi sonuçları. (A) Calcein-AM floresans faz mikroskobu görüntüleri ve dizinler veya yüzey bağlı planktonik vahşi-türü veya ΔlasR P. aeruginosa, öldürme (B) ana bilgisayar üzerinde overlaid. Vahşi tipi yüzey bağlı P. aeruginosa öldürür önemli calcein floresan sergi amip ve bu nedenle önemli bir ana dizin öldürüyor. Planktonik hücreleri küçük calcein floresan sergi ve düşük ana bilgisayar öldürme dizin üretmek amip tarafından tüketilir. Hem yüzey bağlı ve planktonik ΔlasR amip ve sonuç bir düşük ana bilgisayar öldürme dizin tarafından tüketilir. Ölçek çubukları temsil 50 µm. çubuklar üç bağımsız deneyler ortalamasını gösterir ve hataları çubuklar standart sapma gösterir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57844/57844fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba at JoVE.com

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil

Burada, D. discoideum (amip) ana bilgisayar olarak kullanarak planktonik veya yüzey bağlı bakterilerin virülans ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Virülans bir 1 saat boyunca ölçülür ve öldürme ana bilgisayar floresans mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Biz bakteri P. aeruginosabu iletişim kuralı'nı göstermek.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

a-rapid-image-based-bacterial-virulence-assay-using-amoeba

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K Görüntüleme.  University of California. Burada, D. discoideum (amip) ana bilgisayar olarak kullanarak planktonik veya yüzey bağlı bakterilerin virülans ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Virülans bir 1 saat boyunca ölçülür ve öldürme ana bilgisayar floresans mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Biz bakteri P. aeruginosabu iletişim kuralı'nı göstermek.

Video: A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Acanthamoeba Türlerinin Hareketliliğinin Uzun Süreli İzlenmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential contamination of contact lenses after water exposure, the natural behavior of this pathogen remains elusive. Understanding Acanthamoeba's movement patterns can inform us about how it colonizes contact lenses and contaminates the patient's cornea. It is fortunate that Acanthamoeba spp. are visible via brightfield microscopy starting at 4x magnification. Previous techniques have been developed to quantify Acanthamoeba motility in regard to cytopathic effects or under-exposure to the electric field. Here, we describe a method to track and quantify Acanthamoeba spp. motility long-term (hours to days), which is a protocol applicable to multiple amoeba strains, surfaces, and nutritional status of amoeba. This procedure is germane to determining many core motility quantifications, such as distance, speed, confinement, and directionality, which are necessary to monitor different stages of infection, proliferation, or behavioral change.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Acanthamoeba Keratitini Önlemek İçin Hedefe Yönelik Stratejiler Geliştirmek için Acanthamoeba'nın Davranışını İncelemek

This procedure describes how to visualize, track, and quantify Acanthamoeba spp. motility.

Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

Acanthamoeba spp.'nin miktar tayini Motilite

Acanthamoeba spp.'nin miktar tayini Motilite

Acanthamoeba spp.'nin miktar tayini Motilite