Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Süspansiyon Hücre Kültürleri 1. kurulması <ol><li> BY-2 ortamı PO4 4.43 g Linsmaier ve Skoog bazal ortamı, sukroz, 30 gr, 200 mg KH 2 ekleyerek sıvı hazırlayın ve damıtılmış 200 ug ila 900 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) mi su ve 0.1 M KOH ile pH değeri 5.8&#39;e. pH ayarlandıktan sonra damıtılmış su ve otoklav ile 1000 ml nihai hacim ayarlayın. Ortam, 4 ° C&#39;de 2 hafta kadar saklanabilir. </li><li> % 1 ilave By-2 ortamı, 250 ml&#39;lik bir Erlenmeyer bir katı İLE-2 ortamı üzerinde yetiştirilen 100 ile-2 ortamı sıvı ml x 2 yara dokusunun tek bir parça (&gt; 1 cm çaplı) ile balonun (sıvı inoküle ağar) ve alüminyum folyo ile kapatın. 5 gün çalkalanarak 28-30 ° C &#39;de kültür inkübe edin. NOT: Sıvı kültürler hızla büyümek gibi BY-2 kallus, uzun süreli depolama için katı ortam üzerinde muhafaza edilir. Kültür hacmi, tipik olarak, 100 ml kültür üç otuz 6-w yükleme kapasitesine sahip olacaktır, gerektiğinde ayarlanabilirarşın plakalar. </li><li> Transferi 2 x 2 Kültür Fresh-2 ortamı 98 ml log fazı ml çalkalanarak 28-30 ° C&#39;de 5-7 gün süreyle inkübe edilir. Not: kallus 100, 5-7 günlük kültür dilüsyonları yerine aşı: kurulan sıvı kültürlerin Alt kültür düzenli 1 kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li><li> Hücreler hızla yerleşmek gibi, iyice karıştırın kültür, ve transfer hücre kültürü 6 ml 15 ml konik alt santrifüj tüpüne ve hücreler en az 10 dakika süreyle razı olsun. Süpernatan uzaklaştırılmış, toplam hacminin% 50&#39;si için paketlenmiş hücre hacmi ayarlayın. </li><li> sindirim için, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, 500 ul çevrilerek ve bir pipet ile tüp çalkalayın. Onlar yoğun olarak, bu aşamada hücreler aktarmak için geniş çaplı pipetleri kullanın ve standart pipet ipuçları yapışmasına neden olacaktır. </li></ol> 2. Protoplast İzolasyonu <ol><li> Robot sistemi (Şekil 1A) tüm bileşenleri açın ve yumuşak zamanlama plaka taşıyıcı görevi açmakware. görev zamanlama programı her ekipman parçasının arasına plakaların transferini sağlamak için diğer ekipman ile mikroplağı değişenlerden bütünleştirir. </li><li> Aşağıdaki gibi önceki deney için, plaka taşıyıcı yazılım laboratuvar her bir parça, teknik protokolde kullanılan laboratuvar özelliklerini (örneğin, tabak, kapaklar), hem de başlangıç ve bitiş pozisyonları tanımlamak: <ol><li> Plaka taşıyıcı yazılımı ana araç çubuğundan Kur&#39;u tıklatın ve Yönet Konteyner Çeşitleri komutunu seçin. </li><li> konteyner tipi mevcut konteyner tipi kitaplığında listede varsa, o zaman uygun bir kap seçin. </li><li> Konteyner tipi mevcut konteyner tipi kitaplığında yer almıyorsa o zaman yeni bir konteyner türünü belirtmek için Ekle &#39;yi tıklatın. </li><li> Yeni bir konteyner tipi ekledikten sonra, uygun sekmeler halinde (ofset yükseklik, genişlik, istifleme boyutları ve kavrayıcı) yeni konteyner boyutları eklemek ve Kaydet&#39;i tıklatın.<ol><li> Doğru boyutlar üreticinin mevcut değilse, o zaman doğru kumpas kullanılarak en yakın milimetreye kadar tüm boyutlarını belirlemek. konteyner boyutları ölçmek hatalar plaka taşıyıcı başarısızlıkla sonuçlanacaktır. </li></ol></li><li> Tekrarlayın plaka taşıyıcı karşılaşacak tüm konteyner tipleri için 2.2.4.1 ile 2.2.2 adımları. Tüm laboratuvar Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, her bir kabın (aşama 2.2.6) için başlangıç ​​ve bitiş konumunu tanımlamak için gereklidir. NOT: Bu protokol için laboratuvar 6-plaka derin oyuklu plaka ve 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plaka içerir. </li><li> Her kabın başlangıç ve bitiş konumunu tanımlamak için, belirli bir protokol Başlangıç / Bitiş sekmesini tıklatın. İlk olarak, her kabın başlangıç ​​konumu seçin. Sonraki, başlangıç ve bitiş pozisyonunda hem de Kapaklı / Unlidded kutusunu işaretleyin. tüm konteynerler için tekrarlayın. NOT: Konteyner equ başka bir parça sol edilecek iseipment (yerine levha taşıyıcı içinde) son konumu boş bırakılabilir. </li></ol></li><li> Bu aşamada el ile tüm iş akışı için başlangıç ​​pozisyonuna tüm plakaları yükleyin. , Otel 3&#39;e BY-2 hücreleri ile otel haline levha ısıtıcı / soğutucu yuva 2 üzerine transformasyonu için kullanılacak bir 96 kuyulu plaka ve 50 ml konik 2, 6 oyuklu plakalar 96 oyuklu flüoresan görüntüleme levhaları yük çok modlu dağıtıcı üzerine enzim solüsyonu (Company Dosya, Bölüm 1.2.2 bakınız) içeren tüp. <ol><li> Transformasyon protokolü içinde gerçekleştirilebilir olacaksa, oyuk başına plasmid DNA, 10 ul 96 kuyulu plaka ön yük (1 ug / ml, A 260/280&gt; 1.8) OFP raportör konstruktunu ihtiva eden ve levha üzerinde inkübe 4 ° C&#39;de ısıtma / soğutma. Her iyi, tek bir dönüşüm için deney düzeneği bağlıdır dolu kuyuların böylece sayıda kullanılacaktır. </li></ol></li><li> otomatikleştirmek tüm malzemeleri ve tabak yükleyinbelirlenmiş yerlerde d sıvı taşıma platformu ve otomasyon kontrol yazılımı (Şekil 1B) her öğenin konumunu tanımlar. <ol><li> Sütun 1 mmg içinde% 40 PEG 200 ul (0.4 M manitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5.7), propidyum iyodür 200 ul ile önceden yüklenmiş, 96 oyuklu bir plaka yükleme (p, ve 1 ng / ml) 2. sütun ve sütun 3 (yuva 2) etanol 200 ul ve yuva 8 pipet uçları bir kutu içinde. </li><li> Menüden otomatik sıvı taşıma platformunun yazılımında laboratuvar konumunu Araçlar tanımlamak ve Laboratuvar Editör tıklayın. </li><li> Açılan menüden laboratuvar türünü seçin veya Yeni Laboratuvar düğmesini kullanarak yeni bir laboratuvar türü tanımlar. </li><li> Ana Protokol sekmesini seçip yapılandırma laboratuvar tıklayarak seçilen laboratuvar her parçasının konumunu tanımlayın. Otomatik sıvı taşıma platformu üzerine yerleştirilen laboratuvar her parça olduğundan emin olunprotokol çalıştırmadan önce tanımlanmış. </li><li> Otomatik protokolleri tetiklemek için, Profil Explorer penceresini tıklayın ve çalıştırmak için protokolü (Protoplast İzolasyonu, Hücre Sayımı ve PEG-aracılı Dönüşüm) adını seçin. </li><li> Protokolünde kullanılacak olan tüm cihazların başlatmak için Çalıştır&#39;ı tıklatın. </li><li> Son olarak, Çalışma Explorer penceresinde, sistemdeki tüm konteynerler / laboratuar aletlerinin doğrulamak ve otomatikleştirilmiş protokol başlamak için Çalışma Birimi Ekleme tıklayın. NOT: Otomatik protokollerin tam açıklamaları Company Dosya yer almaktadır. </li></ol></li></ol> 3. Hücre Sayımı için Standart Eğrisi oluşturulması <ol><li> El ile 1 ml&#39;lik bir hacim içinde, 1 x 10 6 protoplastlar / ml&#39;lik bir konsantrasyonda protoplast konsantre. Santrifüj 10 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de protoplastlannda ve süpernatant kaldırmak. </li><li> El ile protoplast pelet (4 ° C&#39;de),% 70 etanol içinde 900 ulve pelet yeniden askıya. hücrelerin tespit edilmeleri için, buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> çekirdekleri etiket ve plaka okuyucu tarafından fark edilmesine olanak vermek için protoplast için PI, 100 ul (1 ug / ml) eklenir. </li><li> Yük sütununda 2 başlayarak 96-iyi floresan tarama plakasının her sütun ve satır içine BY-2 medya sıvının 80 ul. </li><li> 96 oyuklu bir flüoresan görüntüleme plaka sütun 1 de, her bir kuyucuğa İLE-2 ortamı protoplast 70 ul ve 50 ul ekle. </li><li> otomatik sıvı taşıma platformunun yuva 6 plaka koyun ve 2-kat seri seyreltme çalıştırın. <ol><li> Otomatik sıvı taşıma platformu üzerinde bir seri seyreltme yapmak için, Seri Sulandırma Sihirbazı başlatın tıklayın ve transfer hacmi (60 ul), karışımları ve hacim (2, 70 ul), ilk kuyu sayısı (sütun 1, Satırlar AF), seyreltme ayarlamak kuyular (Sütunlar 2-11, Satırlar AF) ve aspire ve dağıtmak özellikleri (kuyu alt 0,5 mm). </li><li> parametreleri ayarladıktan sonra, bir kaydetmeprotokolü çalıştırmak d. NOT: Tüm protoplastlar (nedeniyle hücrelerin fiksasyon) PI ile etiketlenmiş beri, floresan protoplast konsantrasyonu ile orantılıdır. </li><li> seri seyreltme işlemi tamamlandıktan sonra, yuva 9&#39;dan plaka kaldırmak ve plaka okuyucu içine yerleştirin ve plaka okuyucu yazılımı standart eğri protokolünü çalıştırın. Not: bir standart eğri daha sonra bilinen protoplast konsantrasyonu her bir PI den (eksitasyon 536 nm / emisyon 620 nm) floresan karşılaştırılarak oluşturulur. </li></ol></li><li> plaka okuyucu protokolünün tamamlanmasının ardından, plaka kaldırmak ve otoklav veya &quot;biyo-güvenlik protokolleri de tanımlandığı gibi de-canlandırma prosedürlerinin herhangi bir transgenik hücreleri toplamak. </li></ol> Dönüşüm 4. Mikroskobik Analizi <ol><li> Dönüştürülmüş protoplastların robot sisteminin Otel 1 (Otomatik Protokolünün 3, Ek Dosya ürünü) ile plakasını sökün. </li><li> dönüşinverted mikroskop, kamera ve floresan lamba. </li><li> , Protoplastlar odaklanan ilk için 10X objektif seçmek halojen lamba açmak ve floresan lamba için deklanşöre kapatın. </li><li> aydınlık kullanarak protoplastlar mikroskobik sistemi ve odak üzerine yük plakası. </li><li> protoplastlar odaklanarak sonra, halojen ampul kapatın ve floresan lamba için deklanşöre açın. </li><li> Transgenik protoplastlar tarafından ifade pporRFP proteinin görselleştirme için belirlenen CY3 / TRITC filtresini seçin. </li><li> pporRFP floresan işaretleyici ifade protoplastlar sayısını belirlemek için de her tarayın. </li><li> floresan işaretleyici protoplast sayısı ifade protoplast toplam sayısı olarak transformasyon etkinliğini hesaplayın. </li><li> otoklav ya da &#39;biyogüvenlik protokollerde tanımlanan diğer de-yaşatma işlemleri için onaylanmış biyogüvenlik torbalarda transgenik hücre içeren herhangi bir levha toplayın. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi var olduğunu beyan ederiz.

Yukarıda açıklanan protokol başarıyla protoplast izolasyon, numaralandırma ve dönüşüm BY-2 tütün süspansiyon hücre kültürü kullanarak valide edilmiştir; Ancak, protokol kolayca herhangi bir bitki süspansiyon kültürü için uzun olabilir. Şu anda, protoplast izolasyon ve dönüşüm mısır (Zea mays), 10, havuç (Daucus carota) 32, kavak (Populus euphratica) 33, üzüm (Vitis vinifera) 34, palmiye yağı (Elaeis gui...

Son yıllarda, bitkisel beslenme 6 bilmek biyokütle verimi 7 geliştirmek, ve hücre duvarı rekalsitrantların azaltmak kuraklık 3,4 ve tuz tolerans 5 iletmektedir, herbisite karşı direnç 2 kavuşturulması, çeşitli hastalıkların 1 üstesinden gelmek için transgenik bitkileri tasarım yerleştirilen önemli ivme olmuştur 8. Bu eğilim dsRNA 10, miRNA 11 ve siRNA 12 üzerinden susturma CRISPR ve Talens 9 kullanarak genom düzenleme ve gen dahil olmak üzere transgenik bitkiler, üretmek için yeni moleküler araçlar geliştirilmesi ile yardım görmüştür. Bu teknolojilerin transgenik bitkilerin üretimini basitleştirilmiş olsa da, onlar da transgenik bitkilerin çokluğu bitki rejenerasyonu güveniyor geleneksel sistemler kullanılarak taranabilir olamaz oluşturulan bir darboğaz oluşturduk. Birçoğu susturma ve genom düzenleme konstruktları hızlı bitkilere sokulabilir ise, bu dar ilişkinhedeflenen özellikleri bitkiler serada analiz kadar sık ​​tespit edilmez arzu edilen etkiyi üretmek için başarısız olur. Bu çalışmada, özellikle hedef susturulması genom düzenleme ve genin çok sayıda erken tarama mevcut darboğaz gidermek için, bitki protoplast hızlı, otomatik, yüksek verimli tarama için bir yöntem geliştirdik. sağlam bitki hücrelerine karşı protoplast kullanımı, otomatik bir platformun geliştirilmesi için pek çok avantajı vardır. İlk olarak, protoplastlar, bitki hücre duvarının sindirilmesinden sonra izole edilir, ve bundan sonra, bu, bu bariyer, dönüşüm etkinliği 13 arttırılır. Sağlam bitki hücrelerinde 14 ve Agrobacterium aracılı transformasyon 15 Biolistics transformasyonu için sadece iki yaygın olarak kullanılan yöntemler vardır. biyolistik TRANSFO için özel ekipman gerektirir olarak bu yöntemlerin hiçbiri kolayca sıvı taşıma platformları tercüme edilebilirım, Agrobacterium ise aracılı transformasyon ko-kültür ve bakterilerin sonraki çıkarılmasını gerektirir. Ne yüksek verimli yöntemleri için uygundurlar. Protoplast durumda, dönüşüm rutin ancak birkaç çözeltisi değişimini gerektiren ve ideal olarak sıvı kullanım platformlar için uygundur, polietilen glikol (PEG) aracılı transfeksiyon 16 kullanılarak yapılır. İkinci olarak, protoplastlar, tanımı gereği, tek hücre kültürleri, ve böylece bitki hücresi kültürlerinde topaklanma ve zincir oluşumu ile bağlantılı problemler, protoplastlarda gözlenmez. Bir plaka bazlı spektrofotometre hücre topaklanma kullanılarak süratle taranması açısından ya da birden çok sayıda düzlemde hücre tutarlı ölçümler elde zorluk yol açacaktır. protoplastlar kendi kültür ortamı daha da yoğun oldukları için, plaka tabanlı spektrofotometresi için elverişli bir tek tabaka oluşturan, kuyu dibine tortu. Son olarak, bitki hücre süspansiyon kültürleri Primar ikenily kallustan 17 türetilmiş, protoplastlar dokuya özgü ifade tespit etmek potensitesi, bitki dokularının bir dizi hasat edilebilir. Örneğin, özelliği fenotipi tahmin için çok önemli olabilir kök veya bir genin yaprağa özel ifadesini analiz etmek. Bu nedenlerle, bu işin geliştirilen protokol yaygın olarak kullanılan tütün (Nicotiana tabacum L.) parlak sarı bir &#39;2 (x 2) süspansiyon kültüründen izole edilen protoplastlardan kullanılarak doğrulanmıştır. X 2 süspansiyon kültürü, bitki hücrelerinin 18 moleküler analizlerde her yerde kullanımı sayesinde, daha yüksek bir bitki &quot;, HeLa&quot; hücre olarak tanımlanmıştır. Son zamanlarda, BY-2 hücreleri bitkinin etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur hücre içi protein lokalizasyonu 23,24 ve bitki biyolojisinde bu kültürlerin geniş bir kullanım gösteren temel hücre biyolojisi 25-27, 19-22 Stresörler. X 2 kültürlerin ilave bir avantajı, birGen ifadesi için geliştirilmiş tekrarlanabilirlik yol açabilir, aphidicolin ile kültürleri senkronize yeteneği 28 inceler. Ayrıca, araştırılan yöntemler, geleneksel protoplastlar üretilmesi için kullanılan enzimler, maliyeti yüksek olan sistemlerin için engelleyici olarak, düşük maliyetli enzimler 29,30 kullanarak-2 protoplast çıkarılması için geliştirilmiştir. Bu nedenle, aşağıda açıklanan protokol BY-2 süspansiyon kültürü kullanılarak valide edilmiş, ancak herhangi bir bitki hücre süspansiyonu kültürüne amendable olmalıdır. Korumalı kavram deneyleri sabit Poritesin turuncu bir flüoresan proteini (OFP) raportör geni (pporRFP) CaMV 35S promoterinin kontrolü altında 31 Porites kullanılarak gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td>7000190</td><td></td></tr><tr><td>Vworks Automation Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td></tr><tr><td>IX81 Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap microscope camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost cellulase</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase/arabinase</td></tr><tr><td>Linsmaier &amp;amp; Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Formerly Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96-well 1.2 ml deep well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 well optical bottom plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

Son on yıl içinde, sinyal transdüksiyon yollarının, transkripsiyonel düzenleyici ağlar, gen ekspresyonu, genom düzenleme ve gen sessizleştirme analizi için, tür kırpmak için örnek türlerin arasında değişen bitki protoplastlarına kullanımında bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Ayrıca, önemli bir ilerleme bitki genomik için bu sistemlerin kullanımında bile daha fazla ilgi üretti protoplast bitkilerin rejenerasyonu, ilerleme kaydedilmiştir. Bu çalışmada, bir protokol bir robot platformu kullanılarak bir &quot;açık san &#39;2 (x 2), tütün süspansiyon kültüründen protoplast izolasyon ve dönüşüm otomasyonu için geliştirilmiştir. dönüşüm yöntemleri Karnabahar mozaik virüsü 35S promoteri (35S) kontrolü altında portakal renkli bir floresan protein (OFP) raportör geni (pporRFP) kullanılarak doğrulanmıştır. protoplastlarda OFP sentezleme epifloresans mikroskopisi ile teyit edilmiştir. Analizler aynı zamanda propidiu kullanarak protoplast üretim verimliliği yöntemleri dahilm iyodür. Son olarak, düşük maliyetli bir yiyecek cinsi enzimler maliyet açısından çok pahalı protoplast izolasyon ve analizi otomatik yüksek verimli olan laboratuvar dereceli enzimler gerektiren gereksinimin ortadan kaldırılmasının, protoplast izolasyon prosedürü kullanılmıştır. Bu çalışmada geliştirilen protokolüne göre, dönüşüm, protoplast izolasyon bütün yöntemi operatörün herhangi bir giriş olmadan 4 saat altında yapılabilir. Bu çalışmada geliştirilen protokol BY-2 hücre kültürü ile doğrulandı iken, prosedürler ve yöntemler ekin genomik araştırma ivmesini etkinleştirmeniz gerekir herhangi bir bitki süspansiyon kültürü / protoplast sistemine çevrilebilir olmalıdır.

Bu çalışmada, x 2 iki katına çıkma oranı 15 saat bir ortalama hücre döngüsü uzunluğu bir önceki raporlar ile uyumludur kültürleri inkübe edildi sıcaklığa bağımlıdır 14-18 saat arasında değişmiştir. Bu katlama oranı ile, 1: 100 Başlangıç ​​aşı 5-7 günde% 50 bir paketlenmiş hücre hacmi (PCV) kültürlerin neden kültürlerini başlatmak için kullanılmıştır. Kültürler ortam 200 ml içinde büyütülmüştür içinde mevcut protokolde dokunun b?...

Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

a-robotic-platform-for-high-throughput-protoplast-isolation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

14.2K Görüntüleme.  University of Tennessee, Knoxville.  Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar. 

Video: A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Genetik

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Tıp

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Biyokimya

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biyoloji

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Biyomühendislik

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

Moss Verimli Polietilen Glikol (PEG) aracılığı ile Dönüşüm Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation or polyethylene glycol (PEG). Previous methods were developed to produce tens of thousands of transfected protoplasts at once. Here,&#160;we describe a straightforward method to isolate and transfect millions of leaf mesophyll protoplasts in maize (Zea mays L.). This streamlined process removes certain common protoplasting steps, such as washing in W5. Additionally, steps such as centrifugation, PEG-mediated transfection, and incubation have been modified to work with a greater number of protoplasts. The ability to express large libraries of plasmid constructs enables genome-scale experiments, such as massively parallel reporter assays in maize.

Here, we present a high-throughput protocol to transiently transfect millions of maize protoplasts for testing large libraries of plasmids in maize mesophyll cells.

Mısır Mezofil Protoplastlarının Ölçeklenebilir Transfeksiyonu

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde