Hello.Today size milyonlarca mısır mezofil hücresini protoplastlayan ve onları yüksek verimlilikte dönüştüren bir protokol göstereceğiz. Protokolün ana adımları ilk önce bitki hücre duvarını sindirmek ve çıkarmak, protoplastları serbest bırakmak ve daha sonra PEG kullanarak protoplastı dönüştürmektir. Bu protokol ile diğerleri arasındaki en büyük fark, dönüşümün ölçeğidir.
Çoğu protokol 1.000 ila 10.000 arasında dönüştürülmüş protoplast ile sonuçlanır. Bununla birlikte, protokolümüz milyonlarca dönüştürülmüş mısır protoplastı verir. Burada çimlenmeden sonra dokuz ila 11 gün boyunca karanlıkta yetişen mısır fidelerimiz var.
Fideleri toprak seviyesinin hemen üzerinde kesin ve suya koyun. Kullanılmadığında bitkileri karanlıkta tutun. Her fidenin ikinci ve üçüncü yapraklarını seçin, kahverengi veya hasarlı alanlara sahip yaprakları dışlamaya özen gösterin.
12 ila 16 yaprak seçin ve uçlardan bir santimetre kesin. Sonra her yapraktan 10 santimetrelik bir bölüm kesin. Yaprak bölümlerini bazal uçları birlikte olacak şekilde üst üste istifleyin.
Bir bağlayıcı klips kullanarak demeti bazal uçta birbirine kenetleyin. Yaprak demetini bir parça beyaz kağıda yerleştirin. 0,5 ila bir milimetre genişliğinde yaprak dilimleri kesin.
İnce, tutarlı dilimleri kesmek önemlidir. Yaprak demetinin bir kısmını kestikten sonra, dilimleri enzim çözeltisine aktarın. Malzemenin kurumasına izin vermeyin.
Malzemeyi ıslatmak için enzim çözeltisini yavaşça döndürün. Işığı engellemek için folyoyu kabın üzerine yerleştirin. Tüm demet bağlayıcı klipse yakın kesilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
Kesimden sonra, çözelti böyle görünmelidir. Enzim çözeltisinin kabını bir çan kavanozuna aktarın. Vakum, oda sıcaklığında üç dakika boyunca sızar.
İki buçuk saat boyunca oda sıcaklığında 40 RPM'de bir masa üstü çalkalayıcıda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, çözeltiye bir girdap verin. Başarılı bir sindirimi gösteren sütlü görünmelidir.
Masa üstü çalkalayıcıda oda sıcaklığında 80 RPM'de 10 dakika daha inkübe edin. Beheri enzim çözeltisi ile buzun üzerine yerleştirin. Bir hacim buz gibi soğuk MMG ekleyerek sindirimi durdurun.
40 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne süzün. Çözeltiyi, her biri 10 mililitreden fazla olmayan alikotlara bölün. Soğutulmuş yuvarlak tabanlı cam tüplere dökün.
Tüpleri dört dakika boyunca 100 G'de santrifüj edin. Peletin rahatsız edilmediğinden emin olarak süpernatanı çıkarın. Numuneleri yeniden askıya alın, ardından sonraki yıkamalar için havuzlayın.
Protoplastları beş mililitre MMG ile iki kez yıkayın. Her seferinde üç dakika boyunca 100 G'de döndürün. Pelet güzel, parlak sarı yeşil bir renk olmalıdır.
Tüpü yavaşça döndürerek pelet süspansiyonunu yeniden askıya alabilirsiniz. Bir mililitre MMG'de tekrar askıya alın ve sayım için küçük bir aliquot 10 ila 20x seyreltin. Protoplastlar hızlı bir şekilde yerleşeceğinden, aliqouting'den önce iyi bir şekilde askıya almak önemlidir.
Seyreltilmiş protoplastları hemositometreye yükleyin. Protoplastları ışık mikroskobu altında sayın. İyi bir hazırlık, yıkandıktan sonra etrafta yüzen fazla döküntüye sahip olmayacaktır.
İyi protoplastlar görünür plastitlerle daireseldir. Toplam sayıyı hesaplamak için hücre sayısını kullanın. Bu hazırlık, 10 milyondan fazla protoplastla sonuçlandı.
Floresein diasetat boyası kullanarak canlılığı kontrol etmenizi öneririz. Başarılı protoplast izolasyonları% 70 ila% 90 arasında canlılık sağlarProtoplastları ilgilendiğiniz plazmidle karıştırın. Bu örnekte 1 milyon protoplast ve 15 mikrogram DNA kullanılmaktadır.
30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Tüpün yan tarafına dokunarak yeniden askıya alın. % 12 PEG nihai konsantrasyonuna ulaşmak için PEG çözeltisi ekleyin.
Birkaç kez ters çevirerek yavaşça karıştırın. Protoplastlar ve PEG çözeltisi kırılgandır, bu nedenle tüpü sallamayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
Beş hacim inkübasyon çözeltisi ile seyreltin ve ters çevirerek yavaşça karıştırın. Tüpleri dört dakika boyunca 100 G'de santrifüj edin. Bir mililitre inkübasyon tamponu ile bir kez yıkayın.
Pelet rahatsız etmemeye dikkat edin. Üç dakika boyunca 100 G'de aşağı doğru çevirin. İnkübasyon tamponunda mikrolitre başına 500 ila 1000 hücrelik bir konsantrasyona tekrar askıya alın.
Karanlıkta gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ertesi gün, dört dakika boyunca 100 G'de aşağı doğru döndürün. Soğutulmuş inkübasyon çözeltisi ile iki kez yıkayın.
Her seferinde oda sıcaklığında 100 G'de üç dakika boyunca döndürün. Yeniden askıya alın, ardından son kontrol için hemositometreye küçük bir aliquot yükleyin. İlk olarak, brightfield altındaki toplam protoplast sayısını sayın.
Şimdi, transfeksiyonu doğrulamak için UV altında floresan protoplastların fraksiyonunu gözlemleyin. Protoplastlar GFP muhabirimizi ifade ediyor. Şimdi, transfeksiyon verimliliği hakkında bazı metrikler alalım.
Bu hazırlıkta, 1 milyonunu transfekte ettiğimiz toplam 10 milyon protoplast elde ettik. Ertesi gün 335.000 kişiyi kurtardık. Bunlardan %30.3'lük bir dönüşüm oranına sahiptik, bu da bizi GFP'yi ifade eden toplam yaklaşık 100.000 protoplastımızla baş başa bırakıyor.
Transfeksiyon etkinliği değişebilir. Grafikte görebileceğiniz gibi, tekrarlanan hazırlıklar arasında rutin olarak% 20 ila% 50 arasında verimlilik görüyoruz. Bu protokol, milyonlarca mısır mezofil protoplastının toplanmasına ve dönüştürülmesine izin verir.
Protokolün en iyi parçalarından biri, ölçeklendirme yeteneğidir. Hacim miktarını ve dönüşümde kullanılan protoplastların sayısını ölçeklendirerek, dönüşümünüzü bugün gösterdiğimizden büyüklük sırasına göre daha fazla artırabilirsiniz. Bugüne kadarki en büyük tek tüp deneyimiz 20 milyon protoplast ve 200 mikrogram DNA ile başladı ve ertesi gün 3.1 milyon dönüştürülmüş protoplastla sona erdi.
Bu yüksek verimli protokol, birçok farklı plazmid yapısını test etmeniz gerektiğinde özellikle yararlıdır, ancak ortak çalışanlar bu protokolü, sentetik gen devreleri ve mısır tasarlamak gibi ölçeklendirme yeteneği gerektirmeyen amaçlar için kullanmışlardır. Videomuzu izlediğiniz için teşekkür ederiz. Umarız yardımcı olmuştur.
