Name: imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system
Uploaded: 2016-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System at JoVE.com

We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. Plazmid Yapı <ol><li> Daha önce 1,6 açıklandığı gibi teknoloji klonlama yoluyla yapıları oluşturmak. <ol><li> İlk BASL kodlama dizilerini amplifiye etmek için uygun olan primerler ile yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanarak, YDA ve MPK6 ve giriş vektörleri içine alt klonlanması. 7&#39;de ayrıntılı protokol bulun. </li><li> (Sırasıyla DNmpk6 8 ve DNyda 4) MPK6 ve YDA baskın negatif sürümlerini oluşturmak için şablon olarak MPK6 ve YDA giriş plazmidleri kullanmak ve bölgeye yönelik mutajenez yöntemi 9 ile nokta mutasyonlar. </li></ol></li><li> PH35CG 10 içine BASL entegre standart LR (attL x attR rekombinasyon) reaksiyonları (7 ayrıntılı prosedürü) yürütmek, tütün geçici deneyleri için yapıları inşa etmek, DNyda ve pXNGW içine DNmpk6 ve pXCGW sırasıyla 11 vektörleri. <ol><li> enzim sindirimi ve dizileme ile elde edilen plazmidler teyit edin. Bir kez successful Agrobacterium GV3101 ırkına 12 tumefaciens içine ikili yapılar dönüştürmek ve 2 28 ° C &#39;de seçme plakaları üzerinde büyümek - 3 gün. </li></ol></li></ol> Agrobacterium Sızma Çözüm 2. Hazırlık <ol><li> Inşa pH35CG, pXNGW ve pXCGW için 100 ug / ml Luria-Bertani (LB), uygun antibiyotik ile birlikte ortam 10 ml taze bir kaç transforme edilmiş Agrobacterium koloniler inoküle (gentamisin 25 ug / ml, Rifamisin 25 ug / ml, spektinomisin, aynı konsantrasyonlar P19 için Kanamisin 50 ug / ml gentamisin ve rifamisin (transgenik susturma karşı proteinleri eksprese) 13. </li><li> Yaklaşık 16 saat boyunca 200 rpm hızda 28 ° C çalkalayıcı Agrobacterium kültürleri büyür ve sonra (1.5 ulaştığı tahmin - 1.8) OD 600 ölçümü (Şekil 2A-B). 10 dakika boyunca 2.500 xg&#39;de kültürleri aşağı doğru döndürün. Yeniden askıya ve waMgCl 2 10 mM (infiltrasyon çözeltisi) ile hücre pelletleri sh. </li><li> Yine kültürleri aşağı Spin ve nihai OD 600 = 0.5 (Şekil 2C-D) ulaşmak için sızma solüsyonu uygun miktarda pelet yeniden askıya. 3 saat - bitkiler nüfuz etmeden önce, 1, oda sıcaklığında hücre karışımları bırakın. Bu aşama, hücre homeostazının muhafaza edilmesine yardımcı olur. </li></ol> 3. Tütün Fabrikası ve Yaprak Enjeksiyon <ol><li> Yaprak enjeksiyon için (16 saat ışık / 8 saat-karanlık döngüleri ile 23 ° C) standart bitki büyüme odasında 5 haftalık 14-4 yetiştirilen tütün bitkileri (Nicotiana benthamiana), kullanın. Not: Bu aşamada, tütün bitkileri genellikle 6 yaprakları (2 büyük, 2 orta, ve 2 küçük) var. İki orta ölçekli yaprakları yaprak enjeksiyonu (iki küçük olanlar genellikle çok genç iken iki büyük olanlar, çok eski) için en uygun bulunmaktadır. </li><li> sızma gün önce, tobac suco bitkiler toprak doyurmak için. </li><li> 3 saat - infiltrasyon günde 1 karanlıkta bitkiler önceden inkübe edin. Bu adım yaprak epidermal hücreler nüfuz zaman büyük ölçüde Agrobacterium kolaylaştıran, epidermis stoma yaygın açmanızı sağlar. </li><li> Yaprakları tarihleri ​​ile etiketlenmiş renk bantları bayrağını kullanarak sızmış olması. Mark alanlar siyah kalın sharpie ile infiltre olması (isteğe bağlı; sızmış alanlar enfekte edildikten sonra görebilir.). </li><li> Agrobacterium yeniden süspansiyon eşit hacimlerde alın ve Hafifçe girdapladıktan (Şekil 2E) ile, 100 x 15 mm Petri kabı içinde karıştırın. NOT: durumda, CFP-BASL 1 ml, 1 DNyda-nYFP ml ve DNmpk-cYFP 1 ml P19 1 ml karışık. </li><li> Infiltrasyonu işlemde, infiltrasyon karışımı ile 3 mi iğnesiz şırınga dolgu (1-2 mi) ve tütün yaprak (Şekil 2F) alt tarafına (eksen dışı) itin. infiltre iken, yararlıitmek için tek bir elinizi kullanın ve diğer yandan hafifçe (itme kuvvetine karşı, adaxial) üst tarafını destekleyecek. Not: infiltrasyon karışımı başarıyla enjekte edildikten sonra, enfekte alanlar epidermis kolayca tanınabilir hale gelecektir. Ancak, sızma nedeniyle sert enjeksiyon (doku hasarı) ya da yetersiz itme (herhangi bir sıvı penetrasyon) başarısız olabilir. Her bir test için, (çeşitli bitkilerden) iki bağımsız yapraklarda en az iki enjeksiyon göstermektedir. </li><li> geri büyüme odasına enfekte bitkiler yerleştirin. Genellikle, protein ekspresyonları 48 saat aşağıdaki sızma sonra saptanabilir. </li></ol> 4. Konfokal Görüntüleme <ol><li> (- 4 disk / alan üretilebilir normalde 3) (Şekil 2G) 48 saat sonrası infiltrasyonu at, enjekte edilen bölgede bir yaprak diski çıkarılması için bir delgeç kullanın. yavaşça su damlaları ile bir slayt (yukarı abaxial tarafı) yaprak diskleri aktarmak ve monte etmek için cımbız kullanın. Çok har basılmasını önlemekkapak kayma d sıkılmış / hasarlı hücreler konfokal mikroskop (Şekil 2H) altında iyi göstermez çünkü. </li><li> konfokal görüntüleme önce ifade seviyelerini kontrol etmek için bir epi-floresan bileşik mikroskop üzerine monte örnekleri tarayın. Not: Bizim deneyime dayalı, orta ifade seviyelerini göstermek hücreler en konfokal mikroskop altında temsil edilmektedir. </li><li> konfokal mikroskop 40X (NA 1.3) lens ile başlayın. floresan protein ve orta seviyelerde ifade eden hücreler merkezinde kaldığı şekilde istenen konuma slaydı ayarlayın. OBP ve YFP için uyarma / emisyon spektrumları 458 nm / olan 480-500 nm ve 514 nm / 520 - sırasıyla 540 nm. </li><li> Görüntüler daha sonra en dengeli floresan yoğunluğu / gürültü oranı için lazer yoğunluğu ve akıllı kazancı ayarlamak önizleme &quot;Canlı&quot; düğmesini etkinleştirin. Görüntüleme kalitesini artırmak tarama piksel ve / veya çerçeve / hat ortalamasını artırmak için. Son olarak, rea için odaklama topuzunu ayarlamakch medyan odak düzlemi ve görüntü almak için &quot;Capture&quot; butonuna tıklayınız. Not: OBP ve YFP görüntüleri veya sırasıyla &quot;sıralı&quot; tarama modu, seçeneği işaretleyerek sırayla veya aynı anda yakalanabilir. </li><li> Z-projeksiyon hücrelerinin derinlemesine görünüm için istendiğinde, tarama aralığı derinliğini tanımlamak, &quot;xyz&quot; görüntüleme modunu seçin (10-15 mikron) ve hedef hücrenin alt üst görüntüleri toplamak . seçmek .tiff dosyaları olarak &quot;yeniden adlandırmak&quot; ve ihracat görüntüleri resim dosyası üzerinde sağ tıklayarak Leica yazılımı ile elde edilen görüntüleri derleyin. </li><li> Resim 30 - ölçümü analizi için 40 hücreleri. </li></ol> 5. Görüntü İşleme ve miktarının belirlenmesi Analizi <ol><li> görüntüleri işlemek ve kantifikasyonunu yapmak Fiji yazılımı (http://fiji.sc/Fiji) kullanın. <ol><li> Floresan yoğunluğu grafikleri çizilir. <ol><li> daha CFP / YFP sentezleme olup görselleştirmek içineşit dağıtılmış, hücre çevresi boyunca CFP ve YFP sinyal gücünü göstermek için Fiji kullanın. Bunu başarmak için, öncelikle Fiji ardından resmi başlatmak için &quot;Dosya&quot; ve &quot;Aç&quot; seçeneğini başlatın. aracı menüsünden &quot;çizgi&quot; tıklayın ve sağ tıklayarak &quot;Segment çizgi&quot; seçeneğini seçin. Ilgi bölgeyi karar verin ve CFP veya YFP sinyali (Şekil 3A-C) iz hücre çevresi boyunca bir çizgi çizin. Not: Fiji dilimli çizgisinde mutlak floresan yoğunluğu değerini ölçer. </li><li> Parçalara hattı boyunca CFP / YFP seviyelerini temsil eden pozisyon ve yoğunluk değerleri ile bir grafik oluşturmak için açılır menüyü &quot;Analiz&quot; ve &quot;Plot profili&quot; seçeneğini seçin. İstenirse, karşılaştırılabilir yoğunluk grafikler oluşturmak için EXCEL veya diğer grafik yazılımı içine (menü &quot;Kopyala&quot; seçerek) yoğunluk değerlerini çoğaltmak. </li></ol></li><li> polarite derecesini ölçmek. <ol><li> yaklaşık 20 Represen toplamak3 tekrarlı deneyler niteliksel hücreler tütün hücrelerinde CFP ve YFP polarite derecesini değerlendirmek için. (L olarak tanımlanan) düşük floresan yoğunluğu üzerinde (H olarak tanımlanır) yüksek floresan yoğunluğu oranına göre polarite derecesine hesaplayın. Not: ölçme yöntemi Şekil 3&#39;te açıklanmıştır. <ol><li> H ve L değerlerini ölçmek için, &quot;Tedbir&quot; açılır menüden &quot;Analiz&quot; ve sonra seçim tıklayın (yukarıda anlatılan) hücre çevresinde ilgi bölge boyunca bir parçalı bir çizgi çizin. Bir &quot;Sonuçlar&quot; penceresi açıldığında, kullanmak miktarının gerçekleştirmek için değerler &quot;ortalama&quot;. </li><li> Örneğin CFP ve YFP, nispeten homojen bir ifade gösteren hücrelerden, CFP-BASL (Şekil 3A) ve YFP ölçülmesiyle, H ve L değerlerini elde, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP (Şekil 3B) birlikte ekspresyonundan tamamlanmaktadır iki rastgele eşit uzunlukta olan periferik segmentleri seçildi. </li> &lt;li&gt; Bu durumda, floresan proteinleri belirgin polar birikimini gösteren hücrelerden, CFP-BASL, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP (Şekil 3C), ko-ekspresyonu zenginleştirilmiş floresans sinyalleri ile çevre bölgelerinden H değerleri toplamak ve düşük / hayır floresan birikimi ile bölgelerden Ls. </li><li> normal dağılım 20 birlikte hücre ve testi, H / L Elde edilen oranları havuz. (Normal dağılım için) Student t testi p değerleri veya (non-normal dağılım için) Kolmogorov-Smirnov (KS) testi hesaplayın. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis.">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li><li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis.">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase.">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304, 1494-1497 (2004).</li><li>Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+and+expanded+roles+for+MAPK+signaling+in+Arabidopsis+stomatal+cell+fate+revealed+by+cell+type-specific+manipulations.">Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations.</a> Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).</li><li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis.">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19, 63-73 (2007).</li><li>Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BASL+Polarity+Protein+Controls+a+MAPK+Signaling+Feedback+Loop+in+Asymmetric+Cell+Division.">The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division.</a> Dev Cell. 33, 136-149 (2015).</li><li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+Streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway(R)+TOPO+vector+system.">Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system.</a> Plant methods. 4, 4 (2008).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+evidence+that+the+Arabidopsis+MAP+kinase+MPK6+is+involved+in+anther,+inflorescence,+and+embryo+development.">Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.</a> J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).</li><li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+site-directed+mutagenesis.">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).</li><li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+transport+activity+by+heterotrimerization+of+Arabidopsis+ammonium+transporter+complexes+in+vivo.">Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo.</a> Plant Cell. 25, 974-984 (2013).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method.">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH protocols. 2006 (7), (2006).</li><li>Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus.">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> Plant J. 33, 949-956 (2003).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in molecular biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+signaling+in+Arabidopsis.">Cell polarity signaling in Arabidopsis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).</li><li>Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIN+phosphorylation+is+sufficient+to+mediate+PIN+polarity+and+direct+auxin+transport.">PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).</li><li>Furutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar-localized+NPH3-like+proteins+regulate+polarity+and+endocytosis+of+PIN-FORMED+auxin+efflux+carriers.">Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers.</a> Development. 138, 2069-2078 (2011).</li><li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+localization+and+degradation+of+Arabidopsis+boron+transporters+through+distinct+trafficking+pathways.">Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).</li><li>Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCTOPUS,+a+polarly+localised+membrane-associated+protein,+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana.">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Genel Kullanım ve sinyal iletimi için Tütün geçiş sentezleme sisteminin olası değişiklikler: floresan proteinin aşırı ekspresyonunu (FP) başarılı bir şekilde, bitki hücrelerinde protein hücre içi lokalizasyonu hızlı inceleme için kullanılmıştır Tütün epidermis proteinleri etiketli. Bununla birlikte, in planta protein kompleksi dinamik sinyal dağılımını incelemek komplike hücre içi ortamlarda, geçici protein-protein etkileşimi ve sinyal transdüksiyon etkinlikleri için zor bir konudur. Bu zorluğu gidermek için, biz MAPK sinyal olayları incelemek için BiFC sisteminin yararlandı. birlikte ifade YDA-nYFP ve MPK6-cYFP, geri kazanılır YFP sinyal MAPK sinyalleme rölesi aktivasyon plazma membranında oluşabilir göstermiştir. Bu ideal olacaktır co-express floresan YDA ve MPK6 Arabidopsis ve in vivo dinamik MAPK sinyalini incelemek için etiketledi. Bununla birlikte, GETransgenik bitkilerin nerating birden fazla yapıları arzulandığında, zaman alıcıdır. Tütün hücrelerde protein geçici ifade Arabidopsis ve diğer bitkilerde, in vivo ifadesi için hızlı bir ön test olabilir. Tütün geçiş sentezleme sistemi sunar, ancak kolay bir transgenik bitkilerin üretilmesiyle elde edilemez, diğer bir avantajı, en fazla 4 veya 5 füzyon proteinleri, aynı anda, birlikte ifade edilen ve kombine elde olduğunda konfokal mikroskopla incelenmiş olmasıdır. Bitki hücrelerinde, MAPK sinyal araştırmak için, tütün epidermal hücreleri kullanılarak daha fazla diğer sinyal yollarının ve farklı çevre koşulları altında gerçekleştirilebilir. Eksprese eden hücre yerel H 2 O 2 uygulama (a MAPK sinyal uyaran) ile tedavi edilir Örneğin, YDA-MAPK etkileşimi yoğunluğunu veya konumunu değiştirmek istiyorsunuz? Bu gibi deneyler, hızlı bir şekilde tasarlanmış ve spec gidermek için gerçekleştirilebilirIFIC sorular. Birden fazla üye MAPK kasetlerinin her katman var (3 - Genel olarak 4 katlı), ama nasıl sinyal özgüllük tesisleri veya diğer sistemlerde elde edilir ölçüde bilinmemektedir. MAPK ile MAPKKs veya MAPKKs ile MAPKKKs farklı kombinasyonlarını yaparak, Tütün geçiş sentezleme sistemi, sadece protein-protein etkileşimi, nispeten büyük çaplı bir analizi, aynı zamanda, bitki hücrelerindeki sinyal akışı mekansal organizasyon sağlar. Protein Polarizasyon Soruşturma Eş ifade ve BiFC Testi Özelleştirilmiş: hücre biyolojisinde bir uzun süredir temel soru evrensel sinyal yolları, örneğin, MAPK&#39;lar, belli bir gelişim aşamasında ya da belirli çevre koşulları altında kendi özgüllüğü elde nasıl. Eş-sentezleyen tütün hücre YDA ve MPK6 bölgesinin BiFC bileşenleri ile kutup proteini BASL US YDA-MAPK etkileşimi ve sinyal uzaysal olarak re-d göstermek için sağladıBASL varlığında stoma ACD boyunca belirli bir polarite proteinleri tarafından istributed. Bu nedenle, YDA-MAPK sinyal özgüllük hücre polarite ve asimetrik bölünmesini teşvik etmek BASL ile etkileşim sağlanabilir. Evrensel bir olay değildir, ancak, oldukça az protein eşit bitki hücrelerinde, dağıtılmak üzere tespit edilmiştir, örneğin, küçük bir GTPaz ROP 15, oksin effluxer PIN proteinleri 16 ve regülatör 17, boron taşıyıcıları 18 ve bilinmeyen bir protein (ahtapot 19 POLAR 20 ve BRX 21). Bu protokol belirli bir protein polarizasyon yolunun genetik ve fiziksel ortak arama amaçlanmamıştır, fakat büyük olasılıkla ROP, PIN ya da başkaları ile etkileşime giren proteinlerin bitki hücrelerinde bir polarite kompleks oluşturabilmektedir olup olmadığını test için yararlı olacaktır. tütün hücrelerini kullanarak bir polarizasyon olayı simüle etmek için çalışırken Ancak bir o komplikasyonlar tutmalıtahlillerde ortaya çıkabilir. Daha fazla bileşen deneyde yerleştirilebilir olandan gerekmektedir, örneğin Arabidopsis polarizasyon olayı, özellikle de tütün hücrelerine değinmeyecek olabilir. Tütün arka, ille de inceleme altındaki proteinlerden türetilen bazı bilinmeyen moleküller, bir polarizasyon etkinliği indüklenmesinde dahil olabilirler. Nedenle, tütün sıkı kontrol deneyleri kurmak ve Arabidopsis ya da diğer bitkilerde verileri doğrulamak için gereklidir. Öncelikle, yeşilimsi ve sağlıklı tütün bitkileri kullanılmalıdır: Temel Unsurları Deneyler başarılı olmak. miktar, çeşitli hücrelerden veri havuzuna ihtiyaç analizleri yana, sürekli olarak sağlıklı hücreler ile tütün bitkileri gelişen kullanmak çok önemlidir. İkinci olarak, ortalama protein seviyelerini ifade eden hücrelerin konfokal görüntüleme için kullanılmalıdır. Düşük ifade seviyeleri tahlil için yeterli protein ve doymuş sentezleme l sağlamayabilirevels polarizasyon / translokasyon etkisini maskeleyebilir olacaktır.

Proteinler öngörülemeyen hücresel ortamda meydana gelen neredeyse tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır karmaşık bir hiyerarşik ağ ve form kompleksleri içinde etkileşimde. Ancak, büyüme yanıtları bitki gelişiminden, sadece hızlı değil, aynı zamanda etkin bir şekilde hücre içi düzeyde bu dinamik sinyal olaylarını tespit etmek ve izlemek edemez uygun araçlardan bir eksikliği vardır. Tütün yaprağı epidermis geçici protein sentezleme sistemi canlı hücrelerin floresan proteinleri görselleştirmek için avantajlar cazip gelmiştir. Bu sistem post-translasyonel protein modifikasyonu ve protein lokalizasyonu hızlı incelenmesine olanak yarı in vivo koşulları sağlar. tamamlanmaktadır YFP sinyal inceleyerek, bimoleküler flüoresan tamamlama (BiFC) deneyi, bitki hücrelerinde protein-protein etkileşimi olasılığı bildirir. Diğer yöntemler, örneğin, maya-iki hibrid (Y2H) ve CO ile karşılaştırıldığında-immunoprecipitation (Co-IP) BiFC, protein-protein etkileşimleri hücre içi seviyede oluşabilir bölmeleri görselleştirme güçlü bir yol temin etmektedir. Asimetrik hücre bölünmesi (ACD) doku / organ oluşumu için yeni bir hücre tipleri oluştururken hücre popülasyonu kök tutar için, ökaryotik multicellularity teşvik etmek için vazgeçilmez bir mekanizmadır. Arabidopsis stoma gelişimi bitkilerde ACD çalışmak için bir model sistem olarak kullanılmıştır. öncü hücre, Meristemoid anne hücresi, asimetrik bölmek ve içine ayırt edebilir (ve bir stoma soy zemin hücre (SLGC) (bekçi hücreleri bir çift içine sonlandırmadan önce hücre benzeri bölünmeleri kök uğrar), bir Meristemoid iki farklı kızı hücreler üretmek için bölen bir kaldırım hücresi), sırasıyla (Şekil 1). stoma ACD olarak, Stoma Lineage içinde Asimetrisinin yeni protein Kırma (BASL) inc hangi bölünme asimetrilerini sürücü premitotically polarizelude fiziksel asimetri ve hücre kaderi asimetri 1. MAPKKK YODA ve MAPK, MPK3 ve 6 oluşan bir MAPK kaskad stoma bölümü desen ve kader kabulü 2,3, 4,5 için merkezi. Son zamanlarda, Zhang ve diğ. ACD 6 stoma Arabidopsis YDA-MAPK sinyal yoluna polarite protein BASL bağlı. kanonik YODA-MAPK yolağı, MPK3 / 6&#39;ya kadar, BASL fosforile ve kutuplaşma aktive eder. Fosforile BASL bir iskele olarak fonksiyonları ve YODA (YDA) ve MPK3 / 6 acemi bir protein kompleksi oluşturmak ve hücre korteks 6 da sinyalini konsantre. MAPK bileşenleri ve BASL ve YDA-MAPK yolağı arasındaki pozitif geri besleme döngüsü Polarizasyon bitki hücrelerinde protein kutuplaşma için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Yerel olarak zenginleştirilmiş MAPK sinyal yakından stoma ACD 6 hücre kaderi farklılaşma (Şekil 1) bağlantılı olduğu varsayılmaktadır. k birBu model desteklenen ey deneysel veriler BASL 6 ekspresyonu ile sebep olunan MAPK mekansal yeniden dağıtım gösterdi tütün tahlilleri geldi. MAPK molekülleri genellikle hücrenin içine her bulunduğu için, MAPK sinyal meydana geldiği, genel olarak, takip etmek kolay değildir. Bu çalışmada, biz sinyal rölesi oluştuğu önermek yukarı kinaz ve aşağı olanlar arasındaki etkileşimi görselleştirmek için bölünmüş YFP sistemi kullanılmaktadır. Bu, ek olarak BiFC sisteminin kullanımı uzatılmış birlikte ifade (protein-protein etkileşimi göstermektedir) bölünmüş YFP çift üçüncü bir proteini (CFP-etiketli) tamamlanmaktadır YFP uzamsal CO- ile modüle edilebilir ve bunun nasıl görselleştirmek CFP proteini ifade etmiştir. Bu şekilde, Tütün Epiderm hücre kortekste polarize dokusuna da dağıtım YDA ve MPK6 arasındaki etkileşimlerin uzaysal yeniden düzenlenmesi neden CFP-BASL bu ko-ifadesini gösterdial hücreleri. Bu sistem, bu nedenle hücre dahili veya harici stimuli ile meydan zaman koşulları altında, bitki hücrelerinde, dinamik sinyal olaylarını izlenmesi için geliştirilecek bir potansiyele sahip (örneğin, başka proteinler, kimyasal uygulama, patojen saldırısı ya da çevresel değişiklikler, vb birlikte ifadesi. ).

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D/TOPO</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td><td>Agilent Technology</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>AMRESCO</td><td>J106-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J673-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm Slide</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm Cover glass</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>TCS SP5 II</td><td>LAS AF Lite software</td></tr><tr><td>40X objective lens</td><td>Leica</td><td>HCX&amp;nbsp;Plan APO&amp;nbsp;</td><td>HCX&amp;nbsp;Plan APO, NA 1.30</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>SORVALL 6+</td><td></td></tr><tr><td>Hole puncher</td><td>Staples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Forceps</td><td>Canemco &amp;amp; Marivac</td><td>205EQA-Spec</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

canlı hücrelerde dinamik sinyal olaylarının Görselleştirme bir meydan okuma olmuştur. Bu, bitki hücrelerinde sinyal transdüksiyonu uzaysal dağılımının izlenmesi için test protein-protein etkileşimi kurulu bir geçici ifade sisteminin tütün epidermal hücrelerinde biyomoleküler floresan tamamlama (BiFC) deneyi genişletilmiştir. Bu protokol, etkileşimi ve Arabidopsis MAPKKK Yoda ve MAPK6 arasındaki sinyal plazma membranında meydana göstermek için BiFC tahlili kullanılmıştır. çatgı proteini BASL birlikte ifade edildiğinde Yoda-MAPK etkileşimi dağıtılabilir ve mekansal CFP-BASL ile birlikte polarize. Bu modifiye tütün sentezleme sistemi lokalizasyonu ve dinamik değişiklikleri (az 4 gün) ve floresan protein renk (en az üç) çarpanı ağırlayacak sinyalizasyon hızlı inceleme için izin verir. Biz de protein dağılımı (asimetrik mekansal lokalizasyonu, ya da &quot;kutuplaşma&quot; ölçmek için ayrıntılı yöntemler sundu;), Tütün hücrelerinde. Bu gelişmiş tütün ifade sistemi, canlı bitki hücrelerinde dinamik sinyal olaylarının hızlı test için yaygın olarak kullanılan bir potansiyele sahiptir.

hiperaktif MAPK sinyallemesinin başlatılan hücre ölümünü engellemek için, YDA (DNyda) ve MPK6 (DNmpk6) kinaz aktif olmayan ve tütün hücrelerine eş-sentezleme tahlilinde kullanılmıştır. Ne BiFC de CFP-BASL kendisinde oluşturulan düzensiz dağılım deseni (Şekil 3A-B) ortaya DNyda ve DNmpk6 arasındaki etkileşim. CFP-BASL DNyda-DNmpk6 etkileşim çifti girmiştir Ancak, OBP ve YFP sinyalleri hem son derece kutuplaşmış bir şekilde (Şekil 3C) yeniden dağıtılır bulundu. Bu yeniden dağıtım BASL mekansal bitki hücrelerinde MAPK sinyal yolunu yeniden organize etmek YDA ve MPK6 ile etkileşim olduğunu göstermektedir. Bir fosfor eksikliği versiyonu zayıf aktivite 6 gösterdi iken, çok güçlü polarite oluşturulan BASL bir fosfo-taklit versiyonu: BASL fosforilasyon durumu MAPK sinyallerinin polarite derecesine üzerinde farklı etkileri vardır. Bu veriler bir bizim çalışma modeli desteklenen<html> BASL ve hücre polarite 6 üreten YDA-MAPK yolağı arasındaki olumlu geribildirim düzenleme. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53790/53790fig1.jpg" /> Stoma Asimetrik Hücre Bölünmesi Arabidopsis&#39;te (ACD) sırasında BASL-YDA-MPK6 Polarizasyon Kompleksi Şekil 1. diyagramı. Yaprak epidermis ise, stoma nesilli, Meristemoid Anne Hücreleri ACD öncü hücreler haline genişletmek protodermal hücrelerinden başlatır (MMK). Bir MMC bölmek ve sonunda sırasıyla stoma bekçi hücreleri ve kaldırım hücrelerine ayırt edebilir bir Meristemoid ve bir SLGC (stoma soy zemin hücresi) oluşturmak için bir ACD uğrar. ACD öncü hücrelerin (MMK) hücre kortekste, BASL bir MAPK yolunun iki bileşeni acemi, MAPKKK YDA ve MAPK MPK6, bir polarite kompleksi oluşturmak ve stoma ACD düzenler.om / files / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53790/53790fig2.jpg" /> Tütün yaprak epidermis sokma prosedürü Şekil 2. diyagramı. (A) CFP-BASL barındıran plasmidleri dönüşümü, Agrobacterium DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP ve P19 GV3101 Agrobacterium tumefaciens ve yukarıdan aşağıya doğru (ilgili seçme plakaları üzerinde büyümek A). (B) gece boyunca büyümeleri için sıvı kültürü aşılamak için (A) dan koloniler Pick up. Eğirme ve süpernatant süzün (C) Hasat hücreleri. kısaca pipetle ve pelet yıkandıktan sonra, yine hücreleri aşağı doğru döndürün. (D) yeniden askıya ve sızma çözeltisi ile hücre pelletleri sulandırmak (bkz protokolü) son OD = 0.5 600 elde etmek. (E) yavaşça th mixE, bir Petri tabağına hücreler yeniden süspansiyon haline. (F) tütün yapraklarının eksen dışı tarafına sızma karışımı itmek için iğnesiz şırınga kullanın. (G) sızma sonra yaklaşık 48 saat, yapraklar konfokal görüntüleme için hazırız. Tüketim yaprak diskleri sızma bölgenin etrafında bir delik zımba hücreleri enfekte içeren. Kesik çevreler izin diskleri eksize göstermektedir. (H) konfokal görüntüleme için bir standart slayt üzerine yaprak diskleri monte su kullanın. gölgeli alanda kutu diyagramları tütün enjekte proteinler polarizasyon tahlili için bırakır açıklar. Protein boyutları ölçek değildir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53790/53790fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53790/53790fig3.jpg" /> Şekil 3. Ekran ve Polarite Oluşumunun miktarının belirlenmesi. </strong&gt; (AC) Konfokal görüntüleri tütün epidermal hücrelerinde CFP ve YFP floresans gösterir. Mavi CFP ekspresyonunu gösterir. Sarı YFP ekspresyonunu gösterir. Yalnız CFP-BASL (A) aşırı ekspresyonu. (B) DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP birlikte ifadesi. İki protein etkileşim zaman YFP ifadesi tamamlanır. (C) CFP-BASL, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP birlikte ifadesi. Dengesiz dağılım (kutupluluk) OBP ve YFP hem de bellidir. Ölçek çubuğu (AC) &#39;de = 50 um. (DF) Grafiksel kesikli çizgiler (Eflatun) (AC) boyunca CFP / YFP floresan yoğunluğu komplo. Eflatun üçgenler yoğunluk komplo için kullanılan bölgelerin başlangıç ​​ve bitiş noktasını işaretlemek. tütün hücrelerinde polarite derece sayımsal altında sunulmuştur. çiçeklenme yoğunluğu değerleri (düşük yüksek ve L H) kırmızı dekar ile takip bölgelerden Fiji ile ölçülür ve toplanan(AC) satırları döken. Her numune için, 20 hücrelerinden değerler önem testi için ortalaması alınır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53790/53790fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System at JoVE.com

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Görüntüleme.  Rutgers, The State University of New Jersey. At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells. 

Video: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetik

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Çevre

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found overexpressed in many diseases, including cancer. TGF-&#946; is strongly implicated in metastasis during late stage cancer progression, activating a subset of migratory and invasive tumor cells. Current methods for signaling pathway analysis focus on endpoint models, which often attempt to measure signaling post-hoc of the biological event and do not reflect the progressive nature of the disease. Here, we demonstrate a novel adenovirus reporter system specific for the TGF-&#946;/Smad3 signaling pathway that can detect transcriptional activation in live cells. Utilizing an Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, we can achieve a 100% infection rate of MDA-MB-231 cells within 24 h in vitro. The use of a fluorescent reporter allows for imaging of live single cells in real-time with direct identification of transcriptionally active cells. Stimulation of infected cells with TGF-&#946; displays only a subset of cells that are transcriptionally active and involved in specific biological functions. This approach allows for high specificity and sensitivity at a single cell level to enhance understanding of biological functions related to TGF-&#946; signaling in vitro. Smad3 transcriptional activity can also be reported in vivo in real-time through the application of an Ad-CAGA12-Luc reporter. Ad-CAGA12-Luc can be measured in the same manner as traditional stably transfected luciferase cell lines. Smad3 transcriptional activity of cells implanted in vivo can be analyzed through conventional IVIS imaging and monitored live during tumor progression, providing unique insight into the dynamics of the TGF-&#946; signaling pathway. Our protocol describes an advantageous reporter delivery system allowing for quick high-throughput imaging of live cell signaling pathways both in vitro and in vivo. This method can be expanded to a range of image based assays and presents as a sensitive and reproducible approach for both basic biology and therapeutic development.

Here, we present a protocol for live cell imaging of TGF-&#946;/Smad3 signaling activity using an adenovirus reporter system. This system tracks transcriptional activity in real-time and can be applied to both single cells in vitro and in live animalmodels.

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Kanser Araştırmaları

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Biyokimya

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Gelişim Biyolojisi

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Kimya

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Biyoloji

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Nörobilim

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...