Name: co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in an efficient way in plants
Uploaded: 2018-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants at JoVE.com

Biz yararlı tartışmalar ve yorumlar için Wang laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (NSFC, grant no. 31570001) ve doğal Bilim Vakfı Guangdong Eyaleti ve Guangzhou City (no. 2016A030313401 ve 201707010024 vermek) H.W. için desteklenir

1. primer tasarım stratejisi ve DNA amplifikasyon
<ol><li>Moleküler klonlama, DNA parçaları için astar tasarım. Astar 20 bp gen özel bağlayıcı sıraları ve (örneğin bkz. Tablo 1 ) tamamlayıcı örtüşen sıra bitişik DNA moleküllerinin olan 20-25 bp 5' uç çıkıntı dizileri, oluştururlar. Not: Sonraki derleme her DNA parçaları, farklı protein ifade kaset, bağlantı ve tüm son ifade vektör ile entegrasyon bağlıdır üzerinde bitişik örtüşen sıralarının tanıma.</li>
	<li>DNA parçalarının yarı bağımsız protein ifade kaset standart PCR reaksiyonları ile ilgili onların astar tarafından inşası için gerekli ve yüksek olan organizatörü, floresan muhabir, hedef gen ve Sonlandırıcı, dahil olmak üzere, yükseltmek sadakat polimeraz. Not: Bu çalışmada DNA amplifikasyon için kullanılan şablonları önceki çalışmalar15,22,23türetilmiştir. Tavlama sıcaklığı ve PCR reaksiyonları süreyi uzatma astar ve gen bağımlı vardır.</li>
</ol>2. DNA parçası montaj ve inşaat Protein ifade kaset
<ol><li>DNA Elektroforez tarafından ilk turda PCR ürünlerinin kalitesini incelemek ve spektrofotometre tarafından ölçmek. % 1'özel jel elektroforez tarafından DNA bozulma ve diğer yabancı maddelerden oluşmuş olup olmadığını kontrol edin. OD260/OD280 PCR ürünlerinin 1.6 ve 1.8 arasında olmalıdır.</li>
	<li>Farklı DNA parçalarının mix (0.05 - 0.1 pmol her parça için) bir yeni son hacmi 5 µL PCR tüp içine. Not: Mix DNA molekülleri birlikte bir PCR tüpte aynı protein ifade kaset için tasarlanmış. DNA derleme bağlanması için gereken DNA molekülleri artan sayıda nedeniyle verimliliği azaltır bu yana DNA'lar farklı ifade kaset üzerinden birlikte, karıştırma önlemek. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
	<li>5 x ISO hisse senedi arabellek hazırlamak: 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 mM deoxynucleotide (dNTP); 50 mM dithiothreitol; % 25 Polietilen glikol (PEG) 8000; ve 5 mM Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD).</li>
	<li>ISO stok tampon, T5 eksonükleaz aktivitesi, yüksek-sadakat DNA polimeraz 62.5 birimleri, Taq polimeraz 5.000 adet 7,5 adet x 1 mL 2 x 400 µL 5 ana karışım yapmak (bkz. Tablo reçetesi) ve sterilize edilmiş çift distile H2O. Not: Bu önceki çalışmalar24,25,26uyarlanmıştır; Bu birimler optimize edilmelidir.</li>
	<li>2 ana karışım tüp ve mağaza-20 ° C'de başına x aliquot 100 µL Dikkat: Sık dondurma ve çözme 2 x ana karışımı düşük DNA montaj verimliliği neden olabilir.</li>
	<li>2 x ana karışımı 15 µL 5 µL DNA karışıma ekleyin ve 50 ° c 60 dk için kuluçkaya.</li>
</ol>3. bitkilerde birden çok Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade vektör inşaatı
<ol><li>Tüm yarı bağımsız protein ifade kaset tarafından ikinci tur PCR ürünü kullanarak yükseltmek (0.5 - 1.0 µL) ilk turda izotermal derleme tepki olarak şablon ve en dıştaki astar (Örneğin, 1 FP35S ve 1-RNOS ifade için gelen Kaset 1).<ol>
<li>Yüksek sadakat polimeraz 50 µL tepki birimindeki birimini kullan 1 30 döngüsü tarafından takip (94 ° C 30 s, 30 55 ° C s ve 68 ° C için 2 dk), ardından 68 ° c 5 min için son bir uzantısı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein geçici ifade ve genetik dönüşüm için sırasıyla, 4 adet Sma ekleyerek tasarlanmıştır son protein ifade omurga vektörel çizimler pUC18 ve pCAMBIA1300, linearize ben bir son 10 µL tepki hacim içine kuluçka 1 için- 25 ° C'de 2 hr Restriksiyon enzimi 20 dk 65 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>Protein ifade kaset ve Doğrusallaştırılmış son vektör ekimolar DNA moleküllerinin 5 µL son tepki hacim içine karıştırın. Sonra ikinci tur DNA rekombinasyon 15 µL 2 x ana arabellek ve 50 ° c 60 dk için kuluçka ile karıştırılarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Yetkili E. coli dönüştürmek için ikinci tur izotermal Rekombinasyon tepkimesi son ürünleri kullanmak standart prosedürler27göre hücreleri (Örneğin, DH5α). Olumlu kolonilerin koloni PCR ile DNA sıralama tarafından iki kez kontrol edin. Bir mini plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak E. coli olumlu plazmid ayıklamak ve-80 ° C'de depolayın Uyarı: Uzun süreli depolama için plazmid TE arabellekte çözünmüş veya çift distile H2O onları E. coli suşları içinde tutmaktan daha istikrarlı.</li>
</ol>4. Biolistic-bombardıman geçici eş ifade birden çok Chimeric floresan füzyon protein tesislerinde aracılı
<ol><li>Tütün BY-2 süspansiyon hücreleri ve Arabidopsis Juvenil bitkiler bombardıman için hazır olun.<ol>
<li>Kültür BY-2 hücreleri tarafından iki kez her hafta bir shaker 25 ° C'de subculturing Murashige ve Skoog (MS) ortamda 130 rpm'de ayarlayın. Ödemeli 30 mL 3 d kültürlü BY-2 hücreleri üzerine 70 mm autoclaved filtre kağıdı ile vakum pompası bir parçası için 40 mbar vakum basıncı ayarlayarak filtre uygulamak.</li>
		<li>Hücreleri aşağıdaki adımları boyunca kurumasını önlemek için birkaç damla BY-2 hücre sıvı kültürel orta bir kabında filtre kağıdı yerleştirmeden önce ekleyin (bir sonraki adım).</li>
		<li>BY-2 hücreleri ile filtre kağıdı üzerine yeni bir Petri kabına (85 mm x 15 mm) aktarın.</li>
		<li>Yüzey sterilize Arabidopsis thaliana (Col-0) tohumları vortexing bir karışım % 0.05 içeren % 70 (v/v) etanol ile ara 20 10 dk için.</li>
		<li>Spin aşağı bir tezgah üst santrifüj 2 için maksimum hızda kullanarak tohum s, süpernatant kaldırmak ve % 100 etanol ile tohum bir kez 30 s. pipet steril başlıklı yeni bir steril filtre kağıdı üzerine tohumlar dışarı için yıkayın. Sonra tohum kurumasına ve onları ½ MS agar levha yayıldı.</li>
		<li>Aşağıdaki ayarlarla bir bitki büyüme odasına aktarmadan önce 48 saat için 4 ° C'de plakaları saklamak: 16 h 120-150 µm m-2 s-1 yoğunluğu ile 22 ° C. 8 h karanlık ışık
</li>
		<li>7 - gün eski örnek bitkiler bombardımanı verimliliğini artırmak için yeni ½ MS orta plaka merkezinde 30 mm çapında çember içine aktarın. Dikkat: ne zaman transfer ve yeni ½ MS tabağa yerleştirerek bitkiler örtüşen önlemek.</li>
		<li>Bitki veya nem korumak ve bitkileri dışarı sırasında aşağıdaki adımları kurutma önlemek için doku yüzeyi ½ MS sıvı orta birkaç damla ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plazmid DNA ile ceket altın parçacıkları.<ol>
<li>Girdap altın microcarrier çözüm iyice, 3 dk. için hazırlamak yeni 1,5 mL tüp.</li>
		<li>Sırayla aşağıdaki çözümleri tüp ve girdap ekleyin: 25 µL (1.5 mg) altın parçacıkları, girdap 10 s; 25.46 mg/L spermidine, girdap 10 s 10 µL; 5 1µg/µL plazmid DNA µL, girdap 3 dk; 25 277.5 mg/L CaCl2 çözüm µL, girdap 1dk. Dikkat: Bu adımı sırasında vortexing devam et.</li>
		<li>Spin aşağı bir tezgah üst santrifüj maksimum hızda 5 s ve dikkatle dışarı süpernatant pipet Pelet bozmadan kullanarak altın microcarriers. Mutlak etanol 200 µL ile yıkama ve Pelet girdap tarafından 5-10 s. Spin için aşağı 5 s ve Kaldır etanol için maksimum hızda yeniden askıya alma.</li>
		<li>Altın parçacıkları 18 µL mutlak etanol ve aliquot 6 µL parçacıklar süspansiyon üzerine üç macrocarriers ortasına yeniden askıya. Kuru hava alsınlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA partikül bombardımanı ile bitkiler aktarın.<ol>
<li>Partikül dağıtım sistemi aşağıdaki gibi ayarlayın: 1100 PSI, 28 mm Hg vakum, 1 cm boşluk mesafe ve 9-cm parçacık uçuş mesafesi.</li>
		<li>Hücre/bitkiler agar orta plaka üzerinde için üç kez üç farklı konumlarda ile bombardıman ve hücre/bitkiler karanlıkta bombardımanı hemen sonra bırakın. Dikkat: işletim parçacık teslim sistemi yüksek basınçlı gaz ve yüksek hızlı parçacıklar sistemi ile ilişkisi nedeniyle koruyucu gözlük giymek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6 ila 72 saat önce floresan sinyallerini gözlenmesi için bitki büyüme odası karanlıkta alı hücreler/bitkiler bulundurun. Bitki büyüme odası 24 h karanlık ve 22 ° c için ayarla Dikkat: Organizatörü, gen ve bitki/doku-bağımlı ifade verimliliği ve floresan sinyal şiddeti vardır.</li>
</ol>5. birden fazla Chimeric floresan proteinler Agrobacteriumtarafından ortak ifade istikrarlı transgenik Arabidopsis nesil-dönüşüm aracılı.
<ol><li>Agrobacterium yetkili hücre (PMP90) buz çözme ve için 30 dakika bekleyin, sonra (yukarıda hazırlanan yetkili hücrelere) 2 µL ikili vektör (100-200 ng) ekleyin. Karışımı 10 dakika buz üzerinde durur.</li>
	<li>Karışım önceden soğutulmuş 0.1 cm Elektroporasyon küvet aktarın. Küvet Elektroporasyon sistemi yerleştirin ve aşağıdaki ayarlarla Elektroporasyon gerçekleştirmek: 1.6 kV, 600 ohm, 25 µF.</li>
	<li>SOC sıvı orta 1 mL küvet Elektroporasyon hemen sonra ekleyin, hücreleri yeni bir 1,5 mL tüp içine pipette ve 28 ° c 200 devirde bir yatay orbital Shaker 120 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri 2,348 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi, süpernatant çoğunluğu atmak, yavaşça bir pipet ucu pelleted hücrelerle yeniden askıya alma, 50 mg/L Hygromycin B içeren LB tabağa bacaklarını ve 28 ° C'de 2-3 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Çiçek DIP28 yöntemi için daha önce açıklandığı gibi birden fazla protein ifade kasetleri ile entegre ikili vektör pCAMBIA1300 içeren Agrobacterium, Arabidopsis thaliana Col-0 bitkilerle dönüşümü istikrarlı transgenik bitkiler üretmek.</li>
	<li>Transgenik Arabidopsis tohum yüzeyinin % 0.05 içeren % 70 (v/v) etanol ile karıştırılarak sterilize ara 20. 10 dk. Spin bir tezgah üst santrifüj 2 için maksimum hızda kullanarak tohum aşağı için girdap s, süpernatant kaldırmak ve bir kez için %30 100 etanol ile tohum yıkama s.</li>
	<li>Pipet steril başlıklı steril bir filtre kağıdı üzerine tohumlar dışarı. Bundan sonra kurutma ve Hygromycin B pozitif ettiklerinizden eleme için içeren ½ MS ağar kaplamalar üzerine aç bacaklarını.</li>
	<li>Plakayı 4 ° C'de 2 gün kuluçkaya. Ardından, onları içine belgili tanımlık bitki büyüme odası ve kültür için 7 gün aktarın.</li>
	<li>7 - gün eski hayatta kalma Juvenil bitkiler floresan mikroskop altında floresan sinyallerini denetleyerek seçin, sonra bitkiler için daha fazla tarama homozigoz bitkilerin toprak içine transfer.</li>
</ol>6. ilaç tedavileri
<ol><li>İlaç tedavisi, her ilaç uygun çalışma konsantrasyonları kuluçka hücreleri veya bitkiler önce sıvı MS ortamda sulandırmak.<ol>
<li>Wortmannin tedavi: 1 mM wortmannin hisse senedi çözümler DMSO wortmannin toz çözülerek hazırlamak ve hisse senetleri-20 ° C'de depolayın Bitki hücreleri ya da çocuk bitki 16,5 µM wortmammin içeren sıvı MS orta aktarmak ve 30-45 dk önce görüntüleme için kuluçkaya.</li>
		<li>Brefeldin A (BFA) tedavi: 1 mM DMSO BFA toz çözülerek BFA hisse senedi çözümler hazırlamak ve hisse senetleri-20 ° C'de depolayın Bitki hücreleri veya Juvenil bitkiler 10 µg/mL BFA 30-45 dk önce görüntüleme için içeren sıvı MS orta içine aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. confocal mikroskop düşsel ve Protein hücre altı ortak yerelleştirme Analizi
<ol><li>Juvenil bitki veya süspansiyon hücre geleneksel cam slayt üzerine aktarın ve kapak slayt görüntüleme için üstte mikroskobu tarama standart confocal lazerle kırmadan. Kullanma ertesi gün koyma: 63 X su amaç (N.A 1.4), 0 arka plan, 700 kazanç, 0.168 mm piksel boyutunu ve photomultiplier tüp dedektörü. GFP öğesini proteinler 485, heyecanlandırmak nm ve floresan, 525 nm. 514 RFP öğesini proteinler için heyecanlandırmak nm ve 575 algılamak nm.</li>
	<li>Pearson-Spearman korelasyon (PSC) Co yerelleştirme yukarıda açıklanan8olarak eklentisi ile floresan sinyallerini kullanarak görüntü J yazılım (https://imagej.nih.gov/ij/) Co yerelleştirme oranını hesaplamak. Pearson korelasyon katsayıları veya Spearman'ın sıralama korelasyon katsayıları (Şekil 4) sonuçlarında gösterilir. Üretilen r değerleri -1 ile 1'e olur. + 1 ve -1 tam pozitif ve negatif korelasyon, sırasıyla, iki sinyalleri gösterir, ancak 0 iki sinyallerin tespit yok korelasyon gösterir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Tsien, R. Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+machinery+of+live+cells.">Seeing the machinery of live cells.</a> Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Plant+Cells+in+a+Brand+New+Way.">Visualizing Plant Cells in a Brand New Way.</a> Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Tse, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multivesicular+bodies+as+prevacuolar+compartments+in+Nicotiana+tabacum+BY-2+cells.">Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells.</a> Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).</li><li>Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+F-actin-regulated+exocytic+targeting+of+NtPPME1+is+essential+for+construction+and+rigidity+of+the+pollen+tube+cell+wall.">Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall.</a> Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Distinct+Pathway+for+Polar+Exocytosis+in+Plant+Cell+Wall+Formation.">A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation.</a> Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).</li><li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Expression+Systems+in+Plants:+Potentialities+and+Constraints.">Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints.</a> Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).</li><li>Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize.">Agrobacterium-mediated transformation of maize.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean.">Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Front Plant Sci. 8, 246 (2017).</li><li>Manavella, P. A., Chan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transformation+of+sunflower+leaf+discs+via+an+Agrobacterium-mediated+method:+applications+for+gene+expression+and+silencing+studies.">Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).</li><li>Martin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+in+Nicotiana+benthamiana+fluorescent+marker+lines+provides+enhanced+definition+of+protein+localization,+movement+and+interactions+in+planta.">Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta.</a> Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).</li><li>Miao, Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+protoplasts+of+suspension+cultured+cells.">Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).</li><li>Wang, H., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+and+analysis+of+fluorescent+reporter+proteins+in+plant+pollen+tubes.">Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes.</a> Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).</li><li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li><li>Candat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+determination+of+organelle+targeting-peptide+cleavage+sites+using+transient+expression+of+green+fluorescent+protein+translational+fusions.">Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions.</a> Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Binder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+plasmid+assembly+kit+for+multigene+expression,+gene+silencing+and+silencing+rescue+in+plants.">A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants.</a> PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+golden+gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A golden gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).</li><li>Forner, J., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+red+fluorescent+protein+eqFP611:+Application+in+subcellular+localization+studies+in+higher+plants.">The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants.</a> BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+sorting+receptors+(VSRs)+and+secretory+carrier+membrane+proteins+(SCAMPs)+are+essential+for+pollen+tube+growth.">Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth.</a> Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).</li><li>Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+sorting+receptor+(VSR)+proteins+reach+the+plasma+membrane+in+germinating+pollen+tubes.">Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes.</a> Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).</li><li>Chen, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vitro+splicing+of+coding+sequences+from+genomic+DNA+by+isothermal+recombination+reaction-based+PCR.">Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR.</a> Biotechnology &amp; Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).</li><li>Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+multi-type+plasmid+modifications+based+on+isothermal+in+vitro+recombination.">Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination.</a> Gene. 548 (1), 39-42 (2014).</li><li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+construction+of+insulated+genetic+circuits+via+synthetic+sequence-guided+isothermal+assembly.">Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly.</a> Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).</li><li>Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+plasmid+size+on+transformation+efficiency+by+electroporation+of+Escherichia+coli+DH5+alpha.">Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha.</a> Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCAMPs+highlight+the+developing+cell+plate+during+cytokinesis+in+tobacco+BY-2+cells.">SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).</li><li>Lam, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+SCAMP1+defines+clathrin-coated,+trans-golgi-located+tubular-vesicular+structures+as+an+early+endosome+in+tobacco+BY-2+cells.">Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).</li><li>Jiang, L., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+protein+sorting+to+vacuoles+in+plant+cells:+evidence+for+two+pathways.">Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways.</a> J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).</li><li>Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-adapted+green+fluorescent+protein+is+a+versatile+vital+reporter+for+gene+expression,+protein+localization+and+mitosis+in+the+filamentous+fungus,+Aspergillus+nidulans.">Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans.</a> Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).</li><li>Bruening, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+gene+silencing+regularized.">Plant gene silencing regularized.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).</li><li>Wassenegger, M., Pelissier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+RNA-mediated+gene+silencing+in+higher+plants.">A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants.</a> Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).</li><li>Dehio, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plant+genetic+loci+involved+in+a+posttranscriptional+mechanism+for+meiotically+reversible+transgene+silencing.">Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).</li><li>Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+for+all:+A+novel+robust+system+for+co-expression+of+multiple+chimeric+fluorescent+fusion+proteins+in+plants.">Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants.</a> Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).</li><li>Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+genes+and+cis-regulatory+regions+improves+qualitative+and+quantitative+traits+in+crops.">Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).</li><li>Zhu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+&amp;#34;purple+endosperm+rice''+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis+in+the+endosperm+with+a+high-efficiency+transgene+stacking+system.">Development of &amp;#34;purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system.</a> Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).</li><li>Tang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+formation,+evolution,+and+functionalization+of+new+cytoplasmic+male+sterility+genes+in+the+plant+mitochondrial+genomes.">Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes.</a> Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada sağlam chimeric floresan füzyon protein tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem göstermiştir. Geçici ifade ve genetik dönüşümü için kullanılabilir ve geçerli floresan protein bazlı biyo-görüntüleme, moleküler ve biyokimyasal uygulamaları ve teknolojileri9,10ile,13 uyumludur . Buna ek olarak, protein ortak ifade için birkaç bireysel ifade plazmid kullanan geleneksel yöntemleri zorluklar ...

Chimeric floresan füzyon proteinler hücre içi dinamikleri ve hücre altı yerelleştirme çalışma ve daha fizyolojik fonksiyonları ve çalışma mekanizmaları1,2, anlamak için yararlı araçlar kabul edilmiştir 3 , 4. eş express tanınmış organel muhabir proteinlere, kronolojik zamanmekansal mantığı, dağıtım ve function(s) hücreleri4 endomembrane sistemi içinde daha iyi göstermek için söz konusu protein ile özellikle faydalıdır , 5 , 6 , 7 , 8.
Chimeric floresan füzyon protein onların anılan sıraya göre avantajları ve sınırlamalar9,10,11olan bitkiler ile geçici ifade ve istikrarlı genetik dönüştürme, ifade edilebilir. Geçici bir protein ifadesidir biolistic bombardıman-, Polietilen glikol (PEG) içeren uygun bir yaklaşım-, veya DNA geçici ifade Elektroporasyon aracılı önceki ve Agrobacterium-yaprak infiltrasyon aracılı olduğu gibi bitki hücreleri, Şekil 1A, B12,13,14,15,16' da gösterildiği gibi. Ancak, ortak ifade tek bitki hücrede birden çok chimeric floresan füzyon proteinlerin çeşitli bağımsız ifade plazmid karışımı gerektirir. Böylece, birkaç plazmid aynı anda tek bir plazmid için karşılaştırıldığında aynı hücrelere girerek önemli ölçüde azaltılmış olasılığı nedeniyle ortak ifade düzeyi düşük tesislerinde protein ortak ifade birden çok plazmid istihdam sakıncaları vardır ve Plazmid hücre17,18aktarılan her türde kontrolsüzce rasgele miktarı nedeniyle protein ifade düzeyleri varyasyonları. Buna ek olarak, protein ortak ifade9,10,11tek Agrobacterium içine birkaç bağımsız ifade plazmid tanıtmak için teknik olarak zordur. Bu nedenle, Agrobacterium- Şekil 1Badımında gösterildiği gibi aracılı protein geçici ifade tütün infiltrasyonu tarafından bırakır sadece bir kerede bir plazmid ifade yeteneğine sahip. Buna ek olarak, floresan füzyon protein ifade Transgenik bitkilerin üretimi genellikle ikili dönüşüm vektör taşıyan Agrobacterium tarafından sağlanır. Ancak, gen transferi ve bitki genleri içine ekleme aracılık eder ikili vektör yalnızca bir tek floresan füzyon proteini (Şekil 1B)9,10,12ifade yeteneğine sahiptir. Aynı anda birkaç chimeric floresan proteinler ifade eder bir transgenik bitki üreten birden fazla mermi genetik geçiş ve ay sonra yıl genlerin sayıda bağlı olarak ortak ifade için gerçekleştirebileceğiniz tarama gerektirir.
Bir tek ifade vektör bitki birden çok proteinlerin ortak ifade için önceki birkaç tarafından bildirilmiştir istihdam19,20,21çalışmaları. Ancak, birden fazla mermi enzimatik sindirim ve DNA molekülleri ve omurga vektörel çizimler ligasyonu DNA protein Co ifadesi veya aşırı ifadesi için son plazmid nesil için genellikle gereklidir. Burada, birden çok chimeric floresan proteinler tesislerinde ortak ifade etmek için yeni ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bitkiler hem geçici ifade için birden fazla protein ortak ifade ve bir onur moda istikrarlı dönüştürme sağlar son derece verimli ve kullanışlı bir yöntemdir. Birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein ifade kaset protein ortak ifade içeren ve böylece geleneksel yöntemlerle sakıncaları üstesinden gelir bir tek vektör kullanır. Ayrıca, hangi DNA'manipülasyonlar ve derleme bir en iyi duruma getirilmiş basit tek adımlı DNA sindirim ve ligasyonu ile tepki ek adımlar olmadan elde edilir son derece çok yönlü sistemidir. Çalışma prensibi Şekil 2' de gösterilmiştir. Ayrıca, tamamen chimeric floresan füzyon protein üzerinde temel alan geçerli, moleküler, hücresel ve biyokimyasal yaklaşımlar ile uyumlu olduğunu.

<table><tbody><tr><td>KOD-FX Polymerase</td><td>TOYOBO</td><td>KFX-101</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>NEB</td><td>R0141L/S/V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BBI</td><td>A600194-0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BBI</td><td>A601336-0500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>#N0447V</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>BBI</td><td>C4H10O2S2</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>BBI</td><td>A100159-0500</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>BBI</td><td>A600641-0001</td><td></td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>B9022S</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>BBI</td><td>A500737-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BBI</td><td>A600560-0500</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BBI</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>BBI</td><td>A614270-0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold microcarrier particles</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td>1.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BBI</td><td>CD0050-500</td><td></td></tr><tr><td>Macrocarriers</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>Rupture disk</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2329</td><td></td></tr><tr><td>Stopping screen</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BBI</td><td>A610476-0001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BBI</td><td>A610440-0500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BBI</td><td>A600219-0001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Genview</td><td>AH169-1G</td><td></td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Sigma</td><td>F9128</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>SML0975-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>BBI</td><td>A600163-0500</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Panasonic</td><td>MLR-352H-PC</td><td></td></tr><tr><td>PSD-1000/He particle delivery system</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427000097</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 7 DUO (780&amp;amp;7Live)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>EPS-300 Power Supply</td><td>Tanon</td><td>EPS 300</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Mshot</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>Agrose</td><td>BBI</td><td>A600234</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>BBI</td><td>A100339</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetie Acid</td><td>BBI</td><td>B300599</td><td></td></tr></tbody></table>

co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in an efficient way in plants

Zamanmekansal hücre altı localization(s) bir protein hakkında bilgi fizyolojik fonksiyonları hücrelerdeki anlamak için önemlidir. Çılgınca floresan proteinler ve floresan füzyon proteinlerin üretimi doğrudan protein yerelleştirme ve dinamikleri hücrelerdeki görselleştirmek için etkili bir araç kullanılmıştır. Bunları ortak ilgi sözcüğünden sonra ifade protein ile tanınmış organel işaretleri ile karşılaştırmak özellikle yararlıdır. Yine de, bitkilerde protein ortak ifade için Klasik yaklaşımlar genellikle birden çok bağımsız ifade plazmid içerir ve bu nedenle düşük ortak ifade verimliliği, ifade düzey varyasyon ve yüksek saat içerir dezavantajları var genetik geçiş ve eleme harcama. Bu çalışmada, bitkiler birden çok chimeric floresan proteinlerin ortak ifade için sağlam ve Roman yöntemi açıklanmaktadır. Bu birden fazla yarı bağımsız ifade kaset oluşan bir tek ifade vektör kullanarak geleneksel yöntemlerle sınırlamalar üstesinden gelir. Her protein ifade kaset kendi fonksiyonel proteini ifade öğeleri içerir ve bu nedenle bu esnek farklı ifade talebi karşılamak için ayarlanabilir. Ayrıca, kolay ve derleme gerçekleştirmek uygun ve en iyi duruma getirilmiş tek adımlı reaksiyon ek sindirim ve ligasyonu adımları olmadan kullanarak ifade plazmid DNA manipülasyonu parçaları. Ayrıca, dolu birarada olabilir ile mevcut floresan protein elde edilen biyo-görüntüleme teknolojileri ve uygulamaları, perde ve BiFC gibi. Bir doğrulama yöntemi, bu yeni sistemin fluorescently erimiş Co express katmaninin sıralama reseptör ve salgı taşıyıcı membran proteinlerinin çalıştırmaya başladık. Sonuçlar, onların bakış açısı hücre altı yerelleştirmeler geçici ifade ve bitkilerde genetik dönüşüm tarafından önceki çalışmalarda olduğu gibi aynı olduğunu göstermektedir.

Birden çok chimeric floresan füzyon protein tesislerinde ortak bir ifade için sağlam ve yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. Bu geleneksel, engellerin üzerinden tatili yaklaşımlar kullanmak birden çok ayrılmış plazmid protein ortak ifade için Şekil 1A, B, yolu ile gösterildiği gibi geçici ifade veya istikrarlı genetik dönüşümü. Bu yeni yöntem, protein ortak ifade aynı anda (Şekil 1 c...

Watch this Scientific Journal Video about Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants at JoVE.com

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

co-expression-multiple-chimeric-fluorescent-fusion-proteins-an

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.6K Görüntüleme.  South China Agricultural University. Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Video: Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Çevre

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Genetik

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Biyoloji

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...