Bu eser Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) dan gelen hibe için H-JZ tarafından desteklenmiştir. TMBW Avustralya hükümeti bir Avustralya yüksek lisans Ödülü ve Ann Henderson kontör Burs Avustralya Rotary sağlık bir alıcı Templestowe Rotary ve Dine tedavi için ortak olduğunu.

Tüm hayvan deneyleri Melbourne hayvan Etik Komitesi üniversite tarafından kabul edildi.
Not: PReklam-CMV-Td-Tomadenoviral için sıra, inşaat ve üretimi iletişim kuralı vektörler, pReklam-CMV-GFP ve pReklam-SIÇ12- Luc/Td-Tom yukarıda açıklanan11,12olmuştur, 13. Piyasada bulunan tüm vektörleridir.
1. virüs titresi belirlenmesi % 50 doku kültürü bulaşıcı doz (TCID50) kullanma
<ol><li>1 x 106 DMEM + % 10 FBS medya 10 mL HEK293A hücreleri hazırlayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon, 100 µL 96-şey düz-alt hücre kültür plaka her kuyuya tohum.</li>
	<li>1 mL 1: 100 seyreltme tam orta virüs stokunun hazırlayın. 11 µL seyreltilmiş şunun sütun 1 her şey için ekleyin.</li>
	<li>Seri 10 kat dilutions doğrudan 96 iyi tabak içinde seyreltilmiş şunun 11 µL hücre süspansiyon 100 µL ile 1 son bir seyreltme kadar karıştırılarak gerçekleştirmek12 ulaşıldığında x10. Yapışık olmayan hücreleri olmasına rağmen bu aşamada kuyular arasında transfer hücre sayısı sabit kalır.</li>
	<li>10 en yüksek seyreltme ile başlayan her sütuna her seyreltme 11 µL pipet4. Pipet ipuçları dörtlü viral parçacıkların sınırlamak için her seyreltme ile değiştirin.</li>
	<li>Virüs tam ortam 11 µL sütununu 12 negatif bir denetim ekleyin.</li>
	<li>7-10 gün 37 ° c % 10 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Bir mikroskop kullanarak, her sütunda cytopathic ya da sitotoksik efekt belirtileri wells sayısı puanı. Herhangi bir enfeksiyon belirtisi varsa iyi bir pozitif düşünün.</li>
	<li>Reed ve Muench (1938) istatistiksel yöntem14kullanarak her seyreltme için olumlu wells kısmını hesaplayın.</li>
	<li>Orantılı uzaklığı (PD) kullanarak hesaplama: (A-50)/(A-B), nereye A yüzde yanıt yukarıdaki veya % 50 eşit ve B % 50'in altında yüzde yanıttır.</li>
	<li>50 TCID kullanarak hesaplama: 10X-PDX seyreltme nerede, % 50'den büyük bir yanıt veriyor.</li>
	<li>Aşağıdakileri kullanarak viral titresi hesaplamak: 0,69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. adenovirus MOI belirlenmesi
<ol><li>Tohum 1.0-1.5 x 500 μL 105 MDA-MB-231 hücrelerle DMEM kültür %5 FBS her iyi bir 12 de plaka içeren medya (% 35 hücre confluency, toplamda 6 kuyu).</li>
	<li>Birimler gerekli 0, 250, 500, 2500 için Reklam-CMV-Td-Tom stok ve 5000 MOI formülü kullanarak hesaplar: MOI = (birim [μL] PFU/μL x) / hücre sayısı. 1 x 1010 (PFU/mL), virüs enfeksiyonu hacimleri titresi ile Reklam-CMV-Td-Tom için gerekli MOIs 0, 3,75, 7.5, 37.5 ve 75 μL sırasıyla vardır.</li>
	<li>Bölüm 2,2 Reklam-CMV-Td-Tom hesaplanan miktarda hücrelerle doğrudan viral stok ayrıntılı karıştırma ile kuyu içine pipetting tarafından bulaştırmak.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Kuyulardan medyayı çıkarın ve hücrelerin % 10 formalin 5 min için 500 μL ile sorunu hemen.</li>
	<li>Formalin kuyulardan Aspire edin ve PBS 500 μL Wells'le bir kez yıkayın.</li>
	<li>Hücre çekirdeği Höchst çözüm 5 min için 500 μL ile leke.</li>
	<li>Höchst çözümü kaldırmak ve wells PBS 3 kez 500 μL ile yıkayın.</li>
	<li>Görüntü 200 X büyütme bir floresan mikroskop kullanarak Td-domates protein ve hücre çekirdeği sinyal. TD-domates protein 554, heyecanlandırmak nm ve Höchst boya 352, nm.</li>
	<li>MOI Td-domates%15100 enfeksiyon için gerekli çalışma belirlemek için ImageJ kullanarak görüntüleri analiz.</li>
</ol>3. çift-adenovirus iletim canlı tek kişilik hücrelerde
<ol><li>Tohum 1.0-1.5 x 500 μL 105 MDA-MB-231 hücrelerle DMEM kültür %5 FBS her iyi bir 12 de plaka içeren medya (% 35 hücre confluency, toplam 2 kuyu).</li>
	<li>Reklam-CMV-GFP 75 μL içeren hücreleri enfekte (titresi = 5 x 109 PFU/mL) ve Ad-SIÇ12-Td-Tom 7.5 μL (titresi = 5 x 1010 PFU/mL) % 100 enfeksiyon pozitif elde edebilirsiniz bir 2500 MOI elde etmek için.</li>
	<li>Hücreleri veya TGF-β 0,25 μL iyi (10 mg/mL hisse senedi, son konsantrasyonu olarak 5 ng/μL) ücret olmadan hemen sonra adenovirus enfeksiyonu tedavi.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Görüntü faz kontrast floresans mikroskobu ile canlı hücreler. 470 nm ve Td-domates protein 554, GFP heyecanlandırmak nm.</li>
	<li>Hücreleri tamir ve adımları 1,6 - 1,9 açıklandığı gibi hücre çekirdeği leke.</li>
	<li>Görüntü Td-domates protein ve Höchst floresan mikroskop kullanarak leke. Höchst boya 352, heyecanlandırmak nm.</li>
	<li>ImageJ kullanarak, GFP ve Td-domates pozitif yüzdesi15hücreleri hesaplama.</li>
</ol>4. canlı tek hücre sinyallemesi olarak tahlil yaranın
<ol><li>Tohum 4-5 x 1 mL 105 MDA-MB-231 hücrelerle DMEM kültür %5 FBS her iyi bir 6 de plaka içeren medya (% 50 cep confluency, toplam 2 kuyu).</li>
	<li>Reklam-SIÇ12-Td-Tom 22.5 μL hücrelerle bulaştırmak (titresi 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500 =).</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>İki çapraz çizgiler P200 pipet ucu kullanarak her şey hücre tabakası kaşı.</li>
	<li>Eski medya kuyulardan kaldırın ve FBS medya ile ya da ezelî TGF-β 0.5 μL iyi (10 mg/mL hisse senedi, son konsantrasyonu olarak 5 ng/μL) başına 2 mL taze %5 ile değiştirin.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 5 min için plaka yerleştirin ve 100 X büyütme bir faz kontrast mikroskop kullanarak seçili yara alanlarda görüntüleri al.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Daha önce aynı alanları olarak yara kapatma görüntülerini atın.</li>
	<li>Hücreleri tamir, hücre çekirdeği adımları 1,6 - 1,9 açıklandığı gibi leke ve Td-domates sinyal yara alan ve sigara-yara alan 200 X büyütme bir floresan mikroskop kullanarak görselleştirmek.</li>
	<li>Td-domates pozitif hücrelerinin yüzdesi, yara ve sigara-yara alan ImageJ yazılım15kullanarak ölçmek.</li>
</ol>5. Vitro Luciferase tahlil
<ol><li>3-5 x 1 mL % 5 içeren DMEM medya 104 MDA-MB-231 hücrelerde hücre süspansiyon hazırlamak FBS.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 2.5 μL ile enfekte Ad-SIÇ12- Luc (titresi 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500 =).</li>
	<li>Tohum 96 içine enfekte hücreleri de 3.000 hücreler/100 µL/kuyuda plaka.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Eski medya kuyulardan kaldırmak ve taze %5 FBS medya ile ya da ezelî TGF-β 0.1 μL iyi (1 mg/mL hisse senedi, son konsantrasyonu olarak 1 ng/μL) başına 100 µL yerine ve iyi (hisse senedi 7 mg/mL başına inhibitörü TGF-β, 0,17 μL olup Son konsantrasyonu olarak 12 ng/μL) (yayımlanmamış bir roman TGF-β ligand tuzak protein, Chen ve ark., iş).</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Luciferase tahlil sistem yüzey çözülme ve 1 x hücre kültür lizis reaktif Çift Kişilik distile su (DDW) hazırlayın.</li>
	<li>96 kuyulardan medyayı çıkarın ve 1 x hücre kültür lizis arabelleği için 30 dk nazik ajitasyon ile bir orbital çalkalayıcı kullanarak buz üzerinde 50 μL Wells'le parçalayıcı.</li>
	<li>Lysate, 30 μL her kuyudan bir opak luciferase plaka aktarmak ve oda sıcaklığında sıcak plaka izin.</li>
	<li>Luminometer yazılım, yeni bir iletişim kuralı oluşturun. Ölçümleri ile 1 enjektör için önce ve sonra enjeksiyon seçin. Ayarla ölçümleri enjeksiyon önce 1 için ölçüm gecikme ve Entegrasyon zamans. Enjeksiyon ölçüm sonra ayarlamak Enjeksiyon birim için bir ölçüm gecikme 1 40 µL enjeksiyon ve 5 sonra s s Entegrasyon zaman. Tamamseçerek ayarları onaylayın.</li>
	<li>Enjektör tüp DDW yerleştirin ve enjektör tüp kullanmadan önce temizlemek için Prime ayarları altında enjektör 1 düğmesini tıklatın. Sonraki enjektör boru DDW ve iki daha fazla asal tüm çözüm tüm tüpünden temizlemek için 1 enjektör, ardından hava yerde kaldırın. Enjektör tüp Firefly substrat ve yine iki kere belgili tanımlık substrate hazırlamak için Prime içine yerleştirin.</li>
	<li>Opak luciferase plaka örnekleri ile luminometer yerleştirin ve yazılım seçenekleri belirleyin. Faiz kuyu vurgulayın ve Uygula' yı tıklatın. Luciferase sinyal ölçmek için Başlat tuşuna basın.</li>
	<li>Ölçümler tamamlandıktan sonra kaldırma ve plaka su ile durulayın. Kalan herhangi bir yüzey enjektör tüpün içine hava ve Prime enjektör 1 firefly substrat tüp içine geri içine tüp yerleştirerek yeniden elde etmek. Enjektör tüp DDW yerleştirin ve kalan herhangi bir yüzey enjektör tüp temizlemek için iki daha fazla asal gerçekleştirmek.</li>
</ol>6. hücre hazırlık için canlı sinyal görüntüleme Vivo içinde
<ol><li>48 tümör İmplantasyondan önce s 175 cm2 şişeler (Toplam 10 şişe) içine 2-3 x 106 MDA-MB-231 hücre tohum. Kültür DMEM medya % 5 içeren 20 mL hücrelerde FBS 37 ° c, % 10 CO2.</li>
	<li>24 saat sonra 300 μL eklemek Ad-SIÇ12- Luc (titresi 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500 =) her şişeyi içine. Hücre kültürü için başka bir 24 saat tutun.</li>
	<li>İmplantasyon günü, eski medyayı çıkarın ve adenovirus enfekte hücreleri kez PBS, pH 7.4 20 mL ile yıkayın. 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA balonun ekleyin ve biraz tripsin tüm şişeyi yüzey kapsayacak şekilde izin vermek için şişeyi sallayın. 37 ° C, % 10 CO2 3 dk için kuluçka için şişeye koyun.</li>
	<li>Tripsin FBS içeren DMEM medya 8 mL şişe ekleyerek gidermek. Tüm hücre süspansiyonlar cam reaktif şişe aktarın.</li>
	<li>Bir hemasitometre kullanarak hücre saymak ve 4.8 x 107 hücrelerde iki 50 ml santrifüj tüpleri aktarın.</li>
	<li>Senaryo Özeti 400 x g tripsin kaldırmak ve 720 mL taze FBS-DMEM medya hücrelerde resuspend RT, 5 min için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlar steril 5 mL tüp içine nakletmek ve 160 μL eklemek Matrigel (% 10 toplam matrigel süspansiyon).</li>
	<li>Hücreler buz implantasyon kadar tutmak.</li>
</ol>7. Orthotopic implantasyon
<ol><li>12 SCID fareler tartmak ve rastgele fare kontrol ve tedavi gruplara (6 fare/grup) ayırır.</li>
	<li>İmplantasyon bir steril biyo-steril bir ortam sağlamak için kabine içinde gerçekleştirin. 1 L/dak yeri bir ısı yastık üzerinde fareyi bir oksijen akış hızı % 2.5-4.5 isoflurane kullanarak fare uyuşturan ve kornea zarar görmemesi için her iki gözde üzerine göz merhem yağlama bir damla dağıtmak. Burun burun konisi yerleştirerek anestezi korumak için isoflurane bağlıyken ısı pad fare sırtüstü pozisyonda düzeltmek.</li>
	<li>Anestezi başarısı çimdik tırnağa tepki eksikliği onaylayın. İdame dozu implantasyon hatırlatılması için 1 L/dak oksijen ile % 1.5-2.5 için İsoflurane azaltın.</li>
	<li>Dördüncü meme iki cilde orta hat % 80 etanol batırılmış pamuk bez kullanarak temizleyin.</li>
	<li>4th meme yağ yastığı palpasyonla aracılığıyla bulmak ve daha fazla doku ortaya çıkarmak için yağ yastığı sıkmak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın. Yavaşça hücre karışımdan 50 µL 27 G insülin enjektör Aspire edin ve her iki fare meme yağ yastığı içine enjekte.</li>
	<li>Başarılı bir enjeksiyon yağ yastığı şişlik için duygu tarafından onaylayın. Yağ yastığı hafifçe yayın ve fare kafesin içine yerleştirin.</li>
	<li>Kafesleri ısı panelindeki fareler bilinç kazanmak ve sonra 3 gün boyunca holding odanın kafesleri yerleştirmek izin vermek en az 30 dk için bırakın.</li>
</ol>8. IVIS görüntüleme
<ol><li>Görüntü yaşayan yazılımını açın.</li>
	<li>IVIS Sistem Denetim Masası IVIS sistem başlatma butonuna basarak başlatın. Sıcaklık işareti yeşile kadar bekleyin.</li>
	<li>Luminescent görüntüleme modunu kontrol panelinde seçin.</li>
	<li>İsoflurane anestezi odası ve IVIS sistemi açın.</li>
	<li>Fareler 1 L/dak oksijen ile % 2.5-4.5 isoflurane kullanarak uyuşturan. Bir kez anaesthetized, isoflurane 1,5-%2,5 bakım için ayarlamak. 150 mg/kg vücut ağırlığı ile D-biyoluminesans mayi (IP) enjeksiyonu ile fareler enjekte.</li>
	<li>Hemen fareler IVIS sisteme aktarmak, ısı kontrollü görüntüleme platformu koyup ve onların burun burun konisi içine yerleştirin.</li>
	<li>Denetim Masası Sıra Kur düğmesini tıklatın ve Orta Binningseçin.</li>
	<li>Görüntüleme çekim hızı kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s ve 120 başlangıç yaklaşık 3 dakika sonra biyoluminesans enjeksiyon görüntüleme s. ve sinyal düşmeye başlayıncaya kadar görüntü devam (normalde bu yaklaşık 20 dakika sürer).</li>
	<li>Fareler isoflurane anestezi burun konisi ile korunarak IVIS kaldırın ve fare ile 50 µL PBS ya da 50 µL TGF-β sinyal inhibitörü (50 μg/tümör) içi tümör enjeksiyon yolu ile tedavi.</li>
	<li>Fareler geri koyarlar ve ısı yastık en az 30 dk için açık bırakırım. Sonra kafes geri tutarak Odaya yerleştirin.</li>
	<li>IVIS tedavi ertesi günü açıklanan yordamı Imaging yineleyin.</li>
</ol>9. veri analizi
<ol><li>Açık dosyaları içinde Yaşayan görüntü yazılım kaydedilir.</li>
	<li>Görünümü ' nü kullanarak görüntü bilgileri bulmak | Görüntü bilgileri.</li>
	<li>Aynı çekim hızı ile benzer bir zaman noktasında çekilen fotoğrafları seçin. Fotoğrafları bir grup olarak yükleyin.</li>
	<li>Yoğunluğu normalleştirmek için Görüntü ayarı içinde bireysel kutunun işaretini kaldırın.</li>
	<li>Yoğunluk analiz için foton modu seçeneğini belirleyin. Yatırım getirisi araçları' nda Faiz bölge (ROI) düğmesini seçerek sinyalin yoğunluğunu ölçmek.</li>
	<li>Yatırım getirisi daire kollarındaki sinyal içeren bölgesine sürükleyin ve sinyal yoğunluğu elde etmek için ölçü birimi düğmesini tıklatın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines.">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li><li>Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+import+function+of+Smad2+is+masked+by+SARA+and+unmasked+by+TGFbeta-dependent+phosphorylation.">The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+signaling+in+context.">TGFbeta signaling in context.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).</li><li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad+transcription+factors.">Smad transcription factors.</a> Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).</li><li>Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+human+disease.">Role of transforming growth factor beta in human disease.</a> The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).</li><li>Zhu, H. J., Burgess, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transforming+growth+factor-beta+signaling.">Regulation of transforming growth factor-beta signaling.</a> Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).</li><li>Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;+in+Cancer.">TGF&#946; in Cancer.</a> Cell. 134, 215-230 (2008).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+live+cell+TGF-beta+signaling+imaging:+breast+cancer+cell+motility+and+migration+is+driven+by+sub-populations+of+cells+with+dynamic+TGF-beta-Smad3+activity.">Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity.</a> Molecular cancer. 14, 50 (2015).</li><li>Clarke, D. C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li><li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+reagents+for+improved+in+vitro+and+in+vivo+examination+of+TGF-beta+signalling.">New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling.</a> Growth factors. 29, 211-218 (2011).</li><li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene.">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Stat3+and+Smad7+to+restore+TGF-beta+cytostatic+regulation+of+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo.</a> Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Method+of+Estimating+Fifty+Per+Cent+Endpoints.">A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+inhibits+transforming+growth+factor+beta-mediated+transcription+by+repressing+Smad3+transcriptional+activity.">c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).</li><li>Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-induced+nuclear+localization+of+Smad2+and+Smad3+in+Smad4+null+cancer+cell+lines.">TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines.</a> Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4, 43-63 (2017).</li><li>Wang, I. I., Huang, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+technology+for+gene+manipulation+and+functional+studies.">Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies.</a> Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).</li><li>Kochanek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+adenoviral+vector:+Replacement+of+all+viral+coding+sequences+with+28+kb+of+DNA+independently+expressing+both+full-length+dystrophin+and+beta-galactosidase.">A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).</li><li>Wang, Q., Finer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-generation+adenovirus+vectors.">Second-generation adenovirus vectors.</a> Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).</li><li>Durham, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+replication-defective+adenoviral+recombinants+in+dissociated+cultures+of+nervous+tissue.">Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue.</a> Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).</li><li>MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells:+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture.">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li><li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+wild-type+contamination+in+a+recombinant+adenoviral+preparation+by+PCR.">Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR.</a> Biotechniques. 18, 444-447 (1995).</li><li>Choi, Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+vaccine+applications.">Viral vectors for vaccine applications.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).</li><li>de Cassan, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus.">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li><li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+with+modified+fibers+for+altering+viral+tropism.">Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism.</a> Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).</li><li>Wickham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer+by+adenovirus+vectors+containing+chimeric+fiber+proteins.">Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins.</a> Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).</li><li>Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling.">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388 (2014).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları rapor.

Biz tek canlı hücreler TGF-β/Smad3 sinyal, gerçek zamanlı görüntüleme için izin vermek için bir teknik geliştirdi. Roman bu yöntemi kullanarak, biz daha önce hücre alt nüfus gelişmiş işgali ve geçiş8ile ilişkili dinamik TGF-β/Smad3 transkripsiyon aktivite ile belirledik. Bu yöntem TGF-β, Smad3 fosforilasyon Batı lekesi gibi sinyal için geleneksel deneyleri geliştirir ve TGF-β heterojenite yakalayarak gen ekspresyonu, hedef, TGF-β/Smad3 tümör nüfus içinde sinyal ve ...

Transforming büyüme faktörü β (TGF-β) olduğunu bir heterodimeric tip II oluşan karmaşık sinyaller insan gelişiminde karıştığı bir temel sitokin ve reseptörleri1yazın. Bağlama II reseptör yazın sonuçları işe alım ve fosforilasyon türü ben sırayla aşağı akım Smad2/3 proteinler2,3phosphorylates reseptör. Bunlar Smad4, Smad2/3 proteinler bağlama çekirdeği translocates ve Gen transkripsiyonu4düzenleyen bir kompleksi oluşturan aktif. Homeostatik koşullarda TGF-β/Smad sinyal sıkı bir şekilde düzenlenmiştir; Ancak, birçok hastalığın, sinyal yolu kuralsız ve genellikle ilerleme hastalık5,6,7' nin önde gelen overexpressed. Son yıllarda yapılan çalışmalarda altgrupları TGF-β/Smad etkin hücre bir saat-bağımlı bir şekilde8,9biyolojik işlev sorumludur ve TGF-β hücresel yanıt hànzú gösterdi. TGF-β/Smad sinyal yaygın hücresel Analizi hücresel hareketlilik sadece bir görüntüsünü sağlayan ve ortalama TGF-β/Smad etkisi10kez quantitate sabit bitiş noktası deneyleri kullanımını gerektirir. Bu yöntemler, ancak, doğru bir şekilde TGF-β/Smad fizyolojik durumda hastalık ilerlemesi sırasında sinyal moleküler davranışları temsil etmeyebilir. Yansıma tabanlı canlı hücreleri yakalama bir kayma ve zamansal anlayış ile hücresel ve biyolojik süreçlerin dinamiği analizi.
Amacımız TGF-β/Smad adenovirus tabanlı reaktifler kullanarak sinyal canlı hücre görüntüleme için hassas bir yüksek-den geçerek yöntemi geliştirmekti. Burada, bir adenovirus Smad3 SIÇ motifi bağlama sırası ve bir luciferase (Luc) veya Td-domates (Td-Tom) muhabir gen ifade insan meme kanseri hücre satırında MDA-MB-231 bulaşmış. Adenoviral muhabir sistemleri % 100 enfeksiyon oranını kanser hücre hatlarında sonuçlanabilir plazmid giriş için hızlı ve ucuz bir yöntem sağlar. Adenoviral muhabir sistemleri de başarıyla geleneksel plazmid11ile transfect zor olan hücre hatları için uygulanmış. Bu protokol için tekrarlanabilir ve noninvaziv bir süreç canlı hücre görüntüleme TGFβ/Smad sinyal yolu elde etmek için anlatacağız içinde in vitrove in vivo .

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>Heat inactivated before use</td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-&amp;beta;1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>Dilute in to PBS to make final concentration at 1 &amp;mu;L/mL</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter Assay Kit</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>Dilute 5x in PBS before use</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Phase contrast fluorescence microscopy</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Diltue to 0.05% (1x) in PBS</td></tr><tr><td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Dilute to 1x in DDW</td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Animal Resources Centre</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Night Time</td><td>Allergan</td><td>1750D</td><td>Lubricating Eye Ointment</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Composition&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (4 mM); NaHPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;(16 mM); NaCl (0.12M)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>5% heat inactivated FBS; 10 &amp;mu;g/mL penicillin; 100 &amp;mu;g/mL streptomycin</td></tr></tbody></table>

live cell imaging of the tgf-	&beta;/smad3 signaling pathway in vitro and in vivo using an adenovirus reporter system

Büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal dönüştüren hücresel homeostazı için gerekli birçok önemli işlevleri düzenleyen ve yaygın kanser de dahil olmak üzere birçok hastalıklarda overexpressed bulunur. TGF-β şiddetle geç sahne kanseri ilerleme sırasında metastaz göçmen ve invaziv tümör hücre alt grubunu aktive karıştığı. Sinyal yolu analiz için geçerli yöntemleri kez sinyal post-hoc biyolojik olay ölçmek girişimi ve hastalık ilerici doğası yansıtmamaktadır bitiş noktası modellerde odaklanmak. Burada, canlı hücrelerde transkripsiyon harekete geçirmek algılayabilir TGF-β/Smad3 sinyal yolu için belirli bir roman adenovirus muhabir sistemi göstermektedir. Bir Reklam-SIÇ12-Td-Tom muhabir kullanmak, MDA-MB-231 hücre içinde 24 saat içinde in vitrobir % 100 enfeksiyon hızı elde edebilirsiniz. Floresan muhabir canlı tek hücre içinde görüntüleme için kullanılmasına doğrudan kimlik transcriptionally etkin hücre ile gerçek zamanlı. TGF-β ile enfekte hücreleri uyarılması yalnızca bir alt kümesini transcriptionally aktif ve belirli Biyolojik işlevleri dahil olan hücreleri görüntüler. TGF-β sinyal vitroiçin ilgili biyolojik fonksiyonlar anlayışı geliştirmek için yüksek özgüllük ve bir tek hücre düzeyinde duyarlılık için bu yaklaşım sağlar. Transkripsiyon etkinliği de olabilir Smad3 bildirilen in vivo olarak uygulanması yoluyla gerçek zamanlı bir Ad-SIÇ12- Luc muhabir. Reklam-SIÇ12- Luc ve geleneksel stabil transfected luciferase hücre hatları ile aynı şekilde ölçülebilir. İmplante hücreleri içinde vivo Smad3 transkripsiyon faaliyet geleneksel IVIS görüntüleme ile analiz ve canlı tümör ilerleme, TGF-β sinyal yolu dinamikleri içine benzersiz fikir veren sırasında izlenen. Canlı hücre sinyal yolları hızlı yüksek üretilen iş görüntüleme için izin veren bir avantajlı gazeteci dağıtım sistemi bizim protokolünü açıklar vitro ve içinde vivo. Bu yöntem bir dizi görüntü dayalı deneyleri ve temel biyoloji ve terapötik geliştirme için hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak hediye için genişletilebilir.

Vitro Imaging tek hücreli canlı
TGF-β/Smad dayalı adenovirus reaktifler kullanarak tek kişilik hücrelerde sinyal aktif doğru değerlendirmek için ilk en iyi çokluğu, enfeksiyon (MOI) her hücre satırı için belirlemek önemlidir. %100 hücre mevcut hiçbir cytopathic veya sitotoksik etkisi ile adenoviral enfeksiyon için pozitif olduğunda en iyi MOI belirlenir. Bunu belirlemek için biz pozitif enfeksiyon bir ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of the TGF-	Î²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System at JoVE.com

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.3K Görüntüleme.  University of Melbourne. Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.

Video: Live Cell Imaging of the TGF-	β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Tıp

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of TGF-&#946; signaling can lead to breast cancer. TGF-&#946; elicits its effects on proliferation and differentiation via specific cell surface TGF-&#946; type I and type II receptors (i.e., T&#946;RI and T&#946;RII) that contain an intrinsic serine/threonine kinase domain. Upon TGF-&#946;-induced heteromeric complex formation, activated T&#946;RI elicits intracellular signaling by phosphorylating SMAD2 and SMAD3. These activated SMADs form heteromeric complexes with SMAD4 to regulate specific target genes, including plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-1, encoded by the SERPINE1 gene). The induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) allows epithelial cancer cells at the primary site or during colonization at distant sites to gain an invasive phenotype and drive tumor progression. TGF-&#946; acts as a potent inducer of breast cancer invasion by driving EMT. Here, we describe systematic methods to investigate TGF-&#946; signaling and EMT responses using premalignant human MCF10A-RAS (M2) cells and mouse NMuMG epithelial cells as examples. We describe methods to determine TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation by Western blotting, SMAD3/SMAD4-dependent transcriptional activity using luciferase reporter activity and SERPINE1 target gene expression by quantitative real-time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). In addition, methods are described to examine TGF-&#946;-induced EMT by measuring changes in morphology, epithelial and mesenchymal marker expression, filamentous actin staining and immunofluorescence staining of E-cadherin. Two selective small molecule TGF-&#946; receptor kinase inhibitors, GW788388 and SB431542, were used to block TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation, target genes and changes in EMT marker expression. Moreover, we describe the transdifferentiation of mesenchymal breast Py2T murine epithelial tumor cells into adipocytes. Methods to examine TGF-&#946;-induced signaling and EMT in breast cancer may contribute to new therapeutic approaches for breast cancer.

We describe a systematic workflow to investigate TGF-&#946; signaling and TGF-&#946;-induced EMT by studying the protein and gene expression involved in this signaling pathway. The methods include Western blotting, a luciferase reporter assay, qPCR, and immunofluorescence staining.

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

Kanser Araştırmaları

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and homeostasis of the vasculature system Therefore, deregulation in this signaling pathway results in severe vascular pathologies, such as pulmonary artery hypertension, hereditary hemorrhagic telangiectasia, and atherosclerosis. Endothelial cells (ECs), as the innermost layer of blood vessels, are constantly exposed to fluid shear stress (SS). Abnormal patterns of fluid SS have been shown to enhance TGF&#946;/BMP signaling, which, together with other stimuli, induce atherogenesis. In relation to this, atheroprone, low laminar SS was found to enhance TGF&#946;/BMP signaling while atheroprotective, high laminar SS, diminishes this signaling. To efficiently analyze the activation of these pathways, we designed a workflow to investigate the formation of transcription factor complexes under low laminar SS and high laminar SS conditions using a commercially available pneumatic pump system and proximity ligation assay (PLA).
Active TGF&#946;/BMP-signaling requires the formation of trimeric SMAD complexes consisting of two regulatory SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 and SMAD1/5/8 for TGF&#946; and BMP signaling, respectively) with a common mediator SMAD (co-SMAD; SMAD4). Using PLA targeting different subunits of the trimeric SMAD-complex, i.e., either R-SMAD/co-SMAD or R-SMAD/R-SMAD, the formation of active SMAD transcription factor complexes can be measured quantitatively and spatially using fluorescence microscopy.
The usage of flow slides with 6 small parallel channels, that can be connected in series, allows for the investigation of the transcription factor complex formation and inclusion of necessary controls. 
The workflow explained here can be easily adapted for studies targeting the proximity of SMADs to other transcription factors or to transcription factor complexes other than SMADs, in different fluid SS conditions. The workflow presented here shows a quick and effective way to study the fluid SS induced TGF&#946;/BMP signaling in ECs, both quantitatively and spatially.

Here, we establish a protocol to simultaneously visualize and analyze multiple SMAD complexes using proximity ligation assay (PLA) in endothelial cells exposed to pathological and physiological fluid shear stress conditions.

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Biyokimya

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Biyoloji

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Biyomühendislik

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

Adenovirüs Üretimi İçin Verimli Bir Yöntem

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell cytoskeletal structures. This involves the assembly-disassembly of higher-order macromolecular structures at a given time and location, a process that is particularly sensitive to perturbations caused by overexpression of proteins. Methods that can preserve protein homeostasis and maintain near-to-normal cellular morphology are highly desirable to determine the functional contribution of a protein of interest in a wide range of cellular processes. Transient depletion-rescue experiments based on RNA interference are powerful approaches to analyze protein functions and structural requirements. However, reintroduction of the target protein with minimum deviation from its physiological level is a real challenge. Here we describe a method termed adenofection that was developed to study the role of molecular chaperones and partners in the normal operation of dividing cells and the relationship with actin remodeling. HeLa cells were depleted of BAG3 with siRNA duplexes targeting the 3&#39;UTR region. GFP-tagged BAG3 proteins were reintroduced simultaneously into &#62;75% of the cells using recombinant adenoviruses coupled to transfection reagents. Adenofection enabled to express BAG3-GFP proteins at near physiological levels in HeLa cells depleted of BAG3, in the absence of a stress response. No effect was observed on the levels of endogenous Heat Shock Protein chaperones, the main stress-inducible regulators of protein homeostasis. Furthermore, by adding baculoviruses driving the expression of fluorescent markers at the time of cell transduction-transfection, we could dissect mitotic cell dynamics by time-lapse microscopic analyses with minimum perturbation of normal mitotic progression. Adenofection is applicable also to hard-to-infect mouse cells, and suitable for functional analyses of myoblast differentiation into myotubes. Thus adenofection provides a versatile method to perform structure-function analyses of proteins involved in sensitive biological processes that rely on higher-order cytoskeletal dynamics.

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. In vivo cardiac-specific gene delivery is commonly achieved by either systemic or local delivery. Systemic injection via tail vein is easy and efficient in manipulating cardiac gene expression by using recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). However, this method requires a relatively high amount of vector for efficient transduction, and may result in nontarget organ gene transduction. Here, we describe a simple, efficient, and time-saving method of intramyocardial injection for in vivo cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia (without ventilation), the pectoral major and minor muscles were bluntly dissected, and the mouse heart was quickly exposed by manual externalization through a small incision at the fourth intercostal space. Subsequently, adenovirus encoding luciferase (Luc) and vitamin D receptor (VDR), or short hairpin RNA (shRNA) targeting VDR, was injected with a Hamilton syringe into the myocardium. Subsequent in vivo imaging demonstrated that luciferase was successfully overexpressed specifically in the heart. Moreover, Western blot analysis confirmed the successful overexpression or silencing of VDR in the mouse heart. Once mastered, this technique can be used for gene manipulation, as well as injection of cells or other materials such as nanogels in the mouse heart.

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Here we present a protocol for cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia, the mouse hearts were externalized through the fourth intercostal space. Subsequently, adenoviruses encoding specific genes were injected with a syringe into the myocardium, followed by protein expression measurement via in vivo imaging and Western blot analysis.

Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...