Name: light-driven enzymatic decarboxylation
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. ve bu sentezlerde kullanılan kimyasalların çeşitli akut olarak toksik ve kanserojen. zararlı organik çözücüler, özellikle reaksiyon ürünlerinin çıkarma ve yağ asitlerinin türetme içeren tüm basamaklar kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon, kapalı-toe ayakkabıları kullanarak davlumbaz altında yapılmalıdır ). Bu çalışmada genetiği değiştirilmiş organizmalar içeren tüm işlemler emniyet seviyesi S1 genetiği değiştirilmiş organizmaların işlenmesi için onaylanan tesisler gerektirir. E. Rekombinant Dekarboksilaz olet JE 1. Ekspresyon E. coli <ol><li> Üretim suşunun hazırlanması <ol><li> Jeotgalicoccus gelen Olet JE bir sentetik gen hazırlamak ve sentezleme vektörü pASK-IBA37plus tarif edildiği gibi klonlanmıştır. 8 </sup&gt; NOT: bakteriyel metabolizma, E. enzimlerle yağlı asitlerin bozulmasını önlemek için, yağ asidi bozulması için işlevsiz yolun ile Keio koleksiyonundan coli suşu JW5020 kullanıldı. </li></ol></li><li> Yetiştirme ve enzim ekspresyonunun indüklenmesi <ol><li> E. aşılayarak bir ön kültür hazırlayın Test tüpleri iki 3 mi LB-ortamı içinde (100 ug ml -1 ampisilin ihtiva eden) LB-plaka coli JW5020 olet mutantı. Seçim aracı madde içine bir stok çözeltiden Pipet ampisilin (100 ug ml-1) ve 180 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatöründe 15 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 L&#39;lik çalkalama şişelerinde, iki adet 200 ml&#39;lik LB-ortamı içeren, ampisilin (100 | ig mi-1) ön kültürler 2 ml ilave edilir. Kuluçka 37 ° C&#39;de ve 180 rpm&#39;de devam eder. </li><li> OD 600Nm değişikliği Monitör aşılamadan sonra. OD 600 0.6 Bir arasında bir değere ulaştığındad 0.8 (0.2 ug ml -1) tetrasiklin ekleyerek ifadesini teşvik eder. 20 ° C&#39;de 15 saat ve 180 rpm&#39;de kültürlerin inkübe edin. Not: Olet JE bir hem kofaktör içerdiği, δ-amino levülinik asit (0.5 mM) uyarmadan önce eklenmesi kofaktör sentezi için bir prekürsör ile kültür sağlamak için gereklidir. </li></ol></li><li> Hücre liziz <ol><li> buz üzerinde aşağıdaki adımları uygulayın. santrifüj tüplerine içine şişeden veya pipetleme kültürleri aktarın ve eşit dağılımını sağlamak için bir ölçek kullanın. 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca kültürler santrifüj. </li><li> Dikkatle süpernatan atılır ve pipetleme 50 ml kadar tampon (50 mM Tris, 200 mM NaCI, pH 7.5) içinde tekrar süspansiyon pelet ve bir konik santrifüj tüpüne süspansiyon aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 4,000 x g&#39;de 15 dakika santrifüje tabi tutulduktan sonra, süpernatant atın pipetleme 3 mi tampon maddesi içinde, her pelletini. </li><li> böylece hücre lizis gerçekleştirinçevrimleri arasında 1 dakika bekleme süresi ayrılan buz üzerinde çözümler (x 30 saniye üç döngü) kurmanın. Santrifüj, 4 ° C&#39;de 15,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca çözeltiler hücre debrisini uzaklaştırmak ve pipetleme pelet bozmadan konik santrifüj tüpü içine süpernatant aktarmak için kullanılır. pelet atın. Not: küçük moleküller çıkarıldıktan sonra bir çözücü madde fraksiyon biyokataliz için doğrudan kullanılır. İkinci fraksiyon His ile etiketlenmiş olet JE saflaştırılması için kullanılacaktır. </li></ol></li><li> Hücre ekstrelerinin küçük moleküllerin uzaklaştırılması <ol><li> biyokataliz ham ekstre, 4 ° C&#39;de 4,000 x g&#39;de 10 kDa&#39;lık bir membran ve santrifüj ile santrifüj filtre ünitesine hücresi serbest özütü 3 ml pipetleme hidrojen peroksit oluşumu ya da elektron transfer etkileşebilir küçük molekülleri kaldırma kullanmadan önce. 3 ml Tris-HCl-tamponu içinde geri kalan protein süspanse edin. </li></ol></li><li> Olet saflaştırılması </strong&gt; <ol><li> dengeleme tamponu (Tris, 20 mM NaCl, 300 mM imidazol, 10 mM) ile daha önce dengelenmiş olan His Pur Ni-NTA döner gruplarından ikinci hücre ekstresi 3 ml uygulanır. </li><li> alt fişler ve üst vida kapaklarla sütunlar Seal ve reçine hücre içermeyen ekstresi ile eşit olarak dağıtılır kadar hafifçe sallayın. 4 ° C de bir üst çalkalayıcıda 30 dakika için yerleştirilmiştir sütun inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüj yıkama tamponu 1 ml (Tris, 20 mM NaCl, 300 mM imidazol, 20 mM, pH 7.4) ile sütun yıkayın. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Taze konik santrifüj tüpü içine sütun yerleştirin ve elüsyon tamponu 1 ml (Tris, 20 mM NaCl, 300 mM imidazol, 250 mM, pH 7.4) olet JE ekleyin. 2 dakika süreyle 700 xg&#39;de Santrifüj ve bu adımı iki kez tekrarlayın. NOT: imidazol nikel bağlanır ve böylece sütundan olet JE kaldıracaktır. </li><li> Bir santrifüj filtre ünitesine elüsyon aktarın (10 kDa memmembran) ve 4 ° C&#39;de 4000 x g&#39;de santrifüj tuzdan arındırılır. </li><li> Bir SDS-PAGE (% 15). 9 karışımı SDS-tamponu (nihai konsantrasyon 1 x) ile elüsyon için 3 ul enzimin saflığı kontrol ve denatürasyon için 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;da, çözelti inkübe edin. Daha sonra bir SDS-Page toplam miktarda uygulayın. ticari bir protein standardı kullanılarak 35 mA jel çalıştırın. 50 kDa protein algılar. </li><li> Protein konsantrasyonu ticari mevcut BSA-kit kullanmak belirlemek. Pipet seyreltildi protein örneklerinin 50 ul (1: 100, 1: 200, 1: 500) ve BSA standardına (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg mi-1), 96 oyuklu bir plaka içerisinde . Bradford reaktifi 200 ul ekleyin bir florimetrede ile 15 dakika sonra 595 nm&#39;de absorbansı ölçmek ve standart eğri kullanılarak konsantrasyonları hesaplayın. </li></ol></li></ol> 2. Işık katalize Biyotransformasyon <ol><li> Hidrojen peroksit ilave edilmeden Biyokatalitik reaksiyonlar<ol><li> Damıtılmış su% 10 (h / h) Tergitol ve 0,0284 g stearik asit eklenerek 10 mM stearik asit (M R 284.5 g mol-1) &#39;in bir 10 ml stok çözelti hazırlayın. yağlı asit tamamen eriyene kadar 60 ° C&#39;ye kadar bir ısıtma odası içinde çözelti ısıtılır. </li><li> Biyokataliz ve örnekleme <ol><li> 50 mM EDTA, 0.01 mM FMN, Tris-HCI tampon içinde 0.5 mM stearik asit ihtiva eden iki adet 2 ml reaksiyon karışımları hazırlayın. oksijen beslemesi için bir manyetik karıştırma çubuğu ilave edin ve 25 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı, bir su banyosu içinde, cam tüpler, yerleştirin. </li><li> Reaksiyon karışımlarının her birine saflaştınlmış enzim, 200 ug ml-1 veya% 10 (h / h) hücresi serbest özütü ilave edin ve reaksiyonu tüpler 15 cm uzakta bir açık cam ampul (120 W) ile aydınlatır. </li><li> 20 ul% 37 HCI ile reaksiyon durdurularak belirli zaman noktalarında (0, 10, 30, 60 ve 120 dakika ve gece boyunca) 200 ul numune alın. 5 ul miristik asit ekleyin (10 mM stok yaniİç standart olarak dökülmesinden). </li></ol></li></ol></li><li> Reaksiyon ürünlerinin analizi <ol><li> Çıkarma için, iki numune, 500 ul etil asetat ilave 13,000 x g&#39;de 1 dakika için tüpler ve santrifüj ters. </li><li> süpernatant 400 ul çıkarın ve solvent tamamen buharlaşması izin verin. </li><li> (Trimetilsilil) trifloro asetamid (MSTFA) - 200 ul K-metil-N eklenerek trimethylsilylcarboxylic asit içine karboksilik asitler türetmek. eterler, trimetilsilile hidroksil grupları dönüştürmek için 30 dakika boyunca 60 ° C&#39;da, çözelti inkübe edin. </li><li> GC / FID ile dönüşüm tayini NOT: / FID GC: substrat: (12.05 ve 12.1 dk RT) ve azalma, α- ve β-hidroksi stearik asit (11.15 dk RT): 1-heptadekenin (8.34 dk RT) oluşumunu belirler. <ol><li> 340 ° C&#39;ye kadar Set altında enjeksiyon sıcaklığı açıklanan sıcaklık profilini ayarlayın. AmbarBaşlangıç ​​fırın sıcaklığı 3.5 dakika boyunca 90 ° C&#39;de ve daha sonra 45 ° C dk-1 ile birlikte artar. 220 ° C &#39;de, 2 dakika süreyle sıcaklık tutun. 45 ° C min -1 bir tekrarlanan artıştan sonra, 2 dakika süreyle 280 ° C sıcaklık tutun ve sonra min -1 60 ° C artar. NOT: 330 ° C maksimum sıcaklık 1.44 dakika tutulur. </li><li> Taşıyıcı gaz: Helyum hızlı bir buharlaşmasını ve homojen bir karışım elde etmek için bir 5 bölme oranı ile, örnek 4 ul enjekte edilir. NOT: artan sıcaklığa bağımlılığı ise substrat ve ürünler gaz aşamasına girecektir. maddeler belirli bir bekleme süreleri de sütun geçtikten sonra GC / FID detektörü ile tespit edilir ve ekranda tepe değerleri halinde gösterildi. monitörde zirve oluşumunu gözlemlemek. </li><li> aşağıdaki formül ile oluşan ürün konsantrasyonu hesaplanır: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; Not: kalibrasyon faktörü türetilmiş maddeler ve bunlara karşılık gelen pik alanı, bilinen miktarlarda standart eğri hesaplama her bir alt-tabaka ve ürün bu sütun için özel olarak tespit edilmiştir. </li></ol></li><li> GC / MS ile olefin ve β-hidroksi asit doruklarına belirleyin. <ol><li> GC / MS ile olefin ve β-hidroksi asit doruklarına belirleyin. sıcaklık profilini ayarlayın. 250 ° C&#39;ye enjeksiyon sıcaklığını ayarlamak. 5 dakika boyunca 100 ° C de fırın sıcaklığı tutun ve daha sonra, 20 ° C dk-1 ile birlikte artar. NOT: Maksimum sıcaklık 7.5 dakika tutulur. </li><li> 250 ° C&#39;ye kadar kütle spektrometresi dedektör sıcaklığını ayarlamak ve elektron darbe modunda 50 500 m / z tarama. Not: Elektron darbeli iyonizasyon kütle analizi ileri geçilecek bir kök katyonu oluşumu ile sonuçlanan tek bir elektron kaldırır. Nedeniyle içindeki yüksek intramolar enerji kovalent bağ ileAlt m / z fragmanları oluşturarak molekül mola. Bu fragmanlar, bir madde için belirli bir parmak izi oluşturmaktadır. </li><li> örnek 1 ul enjekte edilir. Karşılık gelen parmak izi (Şekil 2) ile 11.4 dakika tutma süresinden sonra 1-heptadekenin algılar. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hidrojen peroksit ışık güdümlü nesil peroxygenases 3 de dahil olmak üzere, bir dizi redoks dönüşümleri için uygulanan 10 kloroperoksidazlar ve P450 5 monooksijenazlar edilebilir. Bu kolay ve uygulanabilir bir yaklaşımdır. Uzun vadede, görünür ışığın kullanımı, enerji zengini reaksiyonlar için sürdürülebilir bir alternatif kimyasal dönüşümler için güneş ışığına, kullanmaya perspektif açıyor. saflaştınlmış enzim veya hücre içermeyen özü ile uygulanabilir. ikincisi daha az maliyet ve çalışma gerektirir ise, ham ekstredeki küçük moleküller hafif katalize dönüşüm müdahale edebilir unutulmamalıdır. Bir pratik bir yaklaşım (a santrifüj filtre ünitesinde veya diyaliz santrifüj ile, örneğin) bir mikromembran bu küçük parçaların kaldırmaktır. ışık hasat molekülü FMN konsantrasyonu hidrojen peroksit konsantrasyonu belirlenir. affini bağlı olarakoksidoredüktazın Ty, bu konsantrasyon, enzimatik aktivitesi için belirleyicidir. Bir diğer önemli faktör gözden çıkarılabilir elektron verici EDTA konsantrasyonudur. En önemli parametre, Bununla birlikte, enzimin işlevsel stabilitesi ve aktivitedir. yağlı asitlerin olefinization kimya endüstrisi için önemli bir mal ait olefinler halinde biyo bazlı yağ asitlerinin dönüştürülmesi için zarif bir reaksiyondur. Işık odaklı biyokatalitik dekarboksilasyon, oda sıcaklığında ve sürdürülebilirlik açısından net avantajlar sunmaktadır, nötr pH değerinde gerçekleştirilebilir. Sonuçlarımız, hidrojen peroksit in situ üretimi yüksek bir dönüşüme yol enzim kararlılığını bozmadan kofaktör temini için bir strateji olduğunu göstermektedir. kofaktör rejenerasyonu için mevcut yöntemler tarım ürünleri veya benzin bazlı kimyasal maddeler kullanmayın. Işık odaklı reaksiyonlar yenilenebilir alternatif olarak ortaya çıkmaktadır. gelecekAraştırma ucuz moleküller tarafından kurban reaktif EDTA ikamesi için yöntemler adanmış olacaktır ve hafif hasat molekülü FMN miktarını azaltmak için.

iklim değişikliği ve yenilenebilir kaynakların öngörülebilir tükenmesi bizim toplum için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Bu bağlamda, enzim kataliz sürdürülebilir gelişimi ve &#39;yeşil&#39; kimya 1 için hala tam olarak istismar değil potansiyelini temsil eder. Oksiredüktazlar, hafif tepkiler koşullar altında bir giriş ve fonksiyonel grupların modifikasyonu katalize ve en önemli biyokatalizör 2&#39;ye ait kapasitesine sahiptir. Çoğu redoks dönüşümler gibi NAD (P) H olarak kofaktör dış temini gerektirir. kofaktör rejenerasyonu için yöntemler endüstriyel ölçekte uygulanmıştır. Ancak, yine de değeri yüksek ürünlere çoğunlukla uygulama sınırlar yüksek işlem maliyetleri, yol açar. İlginçtir ki, birkaç peroksidazlar 3,4 ve P450 monooksijenazlar 5 sözde peroksit şant yoluyla hidrojen peroksit elektron kabul eder. H2O 2 ucuz bir ko-reajan iken, bildirildi harmf olduğubirçok enzim için ul. In situ formasyonu istikrarlı hidrojen peroksit, düşük konsantrasyonlarda, enzimin işlevsel stabilitesini bozmadan reaksiyonu için uygun bir yaklaşımdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Şekil Olet JE tarafından yağ asitlerinin photobiocatalytic dekarboksilasyonundan 1. Deneysel kurulum. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Kimyasal ve biyolojik süreçler için enerji kaynağı olarak ışık kullanımı son yıllarda 6 artan ilgi görüyordu. Hidrojen peroksit Işık tahrik üretimi redoks dönüşümleri (Şekil 1) hidrojen peroksit kaynağı için kolay ve sağlam bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu adenin mon flavin edilen bir fotokatalizöronucleotide (FMN), sonra enzimatik reaksiyon için oxyfunctionalization kofaktör olarak kullanılan hidrojen peroksit, moleküler oksijenin azaltılması sağlar. Olası elektron vericiler etilendiamintetraasetik asit (EDTA), askorbat ya da ucuz formiat bulunmaktadır. Yöntem peroksidazlar 3,4 ve P450 monooksijenazların 5 olmak üzere 2 O 2 bağımlı enzimler, H genellikle uygulanabilir. Son zamanlarda, olefinlerin 8&#39;e doğal yağların dönüşümü için yeni bir bakteriyel dekarboksilaz 7 uygulanmasını araştırdık. Bu biyo-tabanlı bir kaynaktan gelen yaygın olarak kullanılan bir platform kimyasal sentezi için sürdürülebilir yolu olacaktır. Gram pozitif bir bakteridir Jeotgalicoccus sp dekarboksilaz olet JE. yağ asitlerinin oksidatif dekarboksilasyonunu katalize ve ürün 1-alkenler oluşturur. Olet JE yakından bakteriyel P450 monoksigenazlara ilgili ve f elektronları ihtiyacı varReaksiyon için ROM hidrojen peroksittir. Ne yazık ki, alt tabaka ve enzimin bir çözeltisine, H2O 2 eklenmesi aktivasyonu nedeniyle olet JE stabilitesi üzerinde bir hidrojen peroksit, zararlı etkisi, düşük dönüşüm ve sonuçları bir zayıf bir yeniden üretilebilirlik ile sonuçlanmıştır. NADPH-redüktaz RhFred ile bir füzyon proteini üretilmesi NADPH yüksek fiyat ve düşük maliyetli bir rejenerasyonu için geçerli sınırlı olanakları daha ucuz elektron vericilerini bize araştırmak için istenir, Yine bir NADPH-bağımlı dekarboksilasyonu mümkün. 9 yaptı. P450 monooksijenazların ile olet JE benzerliği esinlenerek, biz H 2 O 2 ışık-katalize nesil kullanılır. Biz hücre içermeyen özleri veya saflaştırılmış enzim çözümlerini kullanarak (&gt;% 95 kadar) yüksek dönüşüm elde etmek için memnun. yağ asidi dekarboksilasyon örnek ile, ışık odaklı enzim için genel bir protokol mevcutkofaktör olarak fotokatalizör ve hidrojen peroksit gibi FMN kullanılarak problemlerle redoks dönüşümler. Sunulan yöntemler E. rekombinant hücrede enzim üretimini içerir E. coli, enzimin saflaştırılması, 1-alkenler sentezi ve reaksiyon ürünlerinin analizi için uygulanması.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochlorid acid 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;delta;-Amino levulinic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Myristic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stearic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation rotors</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-FID&amp;nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0.25&amp;nbsp;mm x 0.25 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-MS</td><td>FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>Spectral photometer</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity chromatography column</td><td>His Pur Ni-NTA spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>96 Well Multiply&amp;reg;PCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Oksidoredüktazlar en çok uygulanan sanayi enzimlerin aittir. Yine de, onlar kimin arz genellikle masraflı ve zorlu dış elektronları gerekir. Elektron vericiler NADH veya NADPH geri dönüşümü ilave enzimler ve geçici alt tabakaların kullanımını gerektirir. İlginç bir şekilde, çok sayıda oksidoredüktazlar elektron vericisi olarak hidrojen peroksit kabul eder. ucuz olurken, bu reaktif, genellikle enzim stabilitesini azaltır. Bu soruna bir çözüm kofaktör in situ kuşaktır. Düşük konsantrasyonda kofaktör sürekli besleme enzim kararlılığını bozmadan reaksiyonu tahrik etmektedir. Bu çalışma için bir yöntem gösterir ışık katalize hema &#39;ya bağımlı yağlı asit dekarboksilaz olet JE, örneğin hidrojen peroksit in situ üretimi. Yağlı asit dekarboksilaz olet JE yağlı asitler, şimdiye kadar bilinmeyen bir enzimatik uzun zincirli 1-alkenler üretmek için benzersiz yeteneği nedeniyle keşfedilmiştirReaksiyon. 1-alkenler yaygın yumuşatıcı ve yağlar için katkı kullanılır. Olet JE oksidatif dekarboksilasyon hidrojen peroksit elektronları kabul gösterilmiştir. Hidrojen peroksit zarar kofaktör in situ olarak üretilmeleri, enzim ve düşük verim ile sonuçlanır eklenmesi, bu problemi aşılmaktadır bulunuyor. photobiocatalytic sistemi yağlı asit dekarboksilasyon için basit ve etkili bir sistem ile sonuçlanır enzim aktivitesi ve verimi ile ilgili açık avantajları gösterir.

Reaksiyon karışımına, hidrojen peroksitin ilave dönüşümleri (&lt;% 10) düşük-orta yol açtı, hidrojen peroksit in situ üretimi% 80 dönüşüme kadar dönüşüm yükselmiştir. GC / MS ile analiz yağ asitlerinden olefinler (Şekil 2) göstermektedir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> GC / MS ölçümleri için Şekil 2. (A), sıcaklık profili. 11.4 dakika sonra 1-heptadekeni elüsyon (B) Parmak izi. (C) 1-heptadekenin için gösterilen uç olefinler de örnek karakteristik ikincil CnH2n-1 fragman iyonları. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> reaksiyon, E. hücre içermeyen özütler, yüksek dönüşüm elde E. coli. Saflaştırılmış bir enzim çözeltisi enzim konsantrasyonu ve dönüşüm arasında net bir ilişki olduğunu göstermiştir. yüksek dönüşümlere ışık hasat molekülü FMN kurşun konsantrasyonunun artırılması. Ancak, daha fazla hidrojen peroksit miktarı yeterli mevcuttur ve bundan sınırlayıcı bir faktör olduğunu göstermektedir reaksiyonları etmeyi hızlandırmamıştır 10 mM Yukarıdaki konsantrasyonu arttırılmaktadır. Yağlı asitlerin dekarboksilasyonu ek olarak, olet JE da β-konumunda bir hidroksilasyonu katalize eder. stearik asit çevrilmesinde, dekarboksilasyon hidroksilasyon üç kat daha hızlıdır. 0.5 mm&#39;lik bir stearik asit çözeltisi ve 10 uM FMN kullanan tipik bir deneyde, alt-tabakanın% 99 oranında 1-heptadekenin ve 2-hidroksistearik asit karışımına dönüştürüldü3.3: 1 (Şekil 3) 8. Işık tahrik biyokataliz substrat spektrumunun bir araştırma ürün karışımı içindeki hidroksil-yağlı asitlerin nispi miktarı daha kısa zincir uzunluğuna sahip artarken daha asil zincirleri olan yağlı asitler, olet JE, tercihen, dekarboksilasyonu katalize gösterdi. miristik asit (C14) daha kısa yağ asitleri dekarboksilasyonu uygulanmadı. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Olet JE Şekil 3. Gaz kromatografik analizi 1-heptadekenin (8.4 dakika), α-hidroksi stearik asit (12.04 dk) β-hidroksi stearik asit (12.1 dk) içine stearik asit (11.15 dk) dekarboksilasyonunu aracılı. 2 saatlik bir zaman boyunca alınan numunelerden pik alanlarının değişimi gösterilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Vie için tıklayınız</a>Bu rakamın wa daha büyük bir versiyonu. Şaşırtıcı bir şekilde, doymamış asitlerin (C18: 1d9 sis) oleik asit ve linoleik asit (C18: 2d9d12) cis çift bağlarının bükümlü konfigürasyon enzim verimli bir yapışma modu konaklayamayacağını belirten, alt-tabakalar olarak kabul edilmedi. Oleik asit (% 10) eklenmesi, aynı zamanda stearik asit dönüşümü engellemektedir. İlginçtir, stearik asit (C18: 1d9 trans) olet JE tarafından dönüştürülmüş, ancak daha sonra biraz daha düşük aktivite stearik asit ile oldu.

Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

oksidatif dönüşümler için bir kofaktör - Biz hidrojen peroksidin ışık katalize nesil için bir protokol açıklar.

Işık odaklı enzimatik dekarboksilasyonu

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Carboxylic Acids

SCIENTISTS IN ACTION

10.6K Görüntüleme.  Ruhr Universität Bochum.  oksidatif dönüşümler için bir kofaktör - Biz hidrojen peroksidin ışık katalize nesil için bir protokol açıklar. 

Video: Light-driven Enzymatic Decarboxylation

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Sulu Ortamlarda Hidrokarbon Dönüşüm Enable A Toolkit

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Biyomühendislik

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Biyokimya

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Enzimatik Cascade reaksiyonlardan L-lizin Amino kiral alkoller sentezi için

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Kimya

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biyoloji

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

Metabolik eşleme: Nicel enzim Cytochemistry ve Histochemistry Dehydrogenases hücre ve dokulara etkinliğini belirlemek için

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &beta;-Ketoacids

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation easily. However, a silver salt of carboxylic acid&#160;reacts with bromine or iodine under high temperature to release carbon dioxide gas and forms halide&#160;with one less carbon. This reaction is called the Hunsdiecker reaction.
<img alt="Figure1" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 55px;" />
Unlike monocarboxylic acids, &#42933;-keto acids bearing a keto group at the &#946; position to the carboxyl group, readily undergo decarboxylation under an acid medium to form a ketone and releases carbon dioxide gas.
<img alt="Figure2" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 60px;" />
Decarboxylation reaction is biologically relevant while oxidizing food materials in the tricarboxylic acid (TCA) cycle. In this cycle, oxalosuccinic acid is formed as an intermediate that bears three carboxyl groups and one carbonyl group. However, as the carbonyl group is at the &#42933;-position to only one carboxyl group, only one of the three carboxyl groups undergoes decarboxylation to produce &#945;-ketoglutaric acid by losing CO2.
<img alt="Figure3" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_3.svg" style="text-align: center; height: 128px;" />

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &amp;#946;-Ketoacids

CO2 Olarak Karboksi Grubu Kaybı: β-Ketoasitlerin Dekarboksilasyonu

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation ...