Bu yöntem, oksijene duyarlı metaller içeren proteinlerde enzim aktivitesinin nasıl sürdürülür hakkında, alan inorganik biyokimya önemli soruları cevaplamak için tasarlanmıştır. Bu tekniğin en büyük avantajı, bir proteinin metalini azaltılmış durumda tutmanın yollarını görselleştirmenize yardımcı olmasıdır. Genel olarak, bu teknik yeni bireyler tamamen anaerobik olmak malzeme ve reaktifler korumak zordur çünkü mücadele edecek.
Protein ekspresyonunu indükledikten 24 saat sonra, hücreleri santrifüj le toplayın ve 1,5 litre büyüme başına 20 mililitre amilose sütun tamponunda bakteri hücresi peletini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna bir miligram lysozyme ekleyin ve hücreleri 20 dakika buzüzerinde karıştırın. Kuluçka sonunda, yaklaşık 15,000 psi üç ila beş geçer ile yüksek basınçlı homojenizasyon yoluyla resuspended hücre çözeltisi lyse ve 50 mililitrelik bir santrifüj tüpü protein transferi.
Bir dakika boyunca azot ile headspace floş ve çözünmez enkaz kaldırmak için hücre lisat santrifüj. Supernatant'ı en az bir adet 50 mililitrelik tüpe aktarın ve lysat'ı kauçuk bir septumla kaplayın. 20-gauge iğne kullanarak, yavaş yavaş oksijen yerinden etmek için iki dakika boyunca çözelti ile azot gazı kabarcık.
Daha sonra, parafin film ile septum sarın, bakır tel ile Parafilm güvenli ve sütun malzemeleri ile eldiven kutusuna supernatant yerleştirin. Çözücü reçine yatağının hemen üzerinde olduğunda, önceden hazırlanmış bir amylose sütununda, 50 mililitre protein süpernatantını kolona yükleyin ve dakikada yaklaşık beş mililitre lik orta basınçlı azot altında beş mililitrelik fraksiyonlarda akışı toplayın. Tüm akış eluted olduğunda, amylose sütun arabellek başka üç sütun birimleri ile sütun yıkayın.
Beş elüsyon tamponu CV ekleyin ve sonra orta basınçlı azot altında cam test tüpleri üç mililitre fraksiyonları manuel olarak toplamak. Demir amonyum sülfat ve dithiothreitol ile oksijen varlığı için çözümler test edin. Oksijen varsa çözelti koyu mavi veya siyaha dönüşür, sağdaki tüp gibi.
Oksijen varlığı düşük katalitik aktivite ile saflaştırılmış protein neden olacaktır. Minimal oksijen mevcut çözümler lavanta veya açık mavi yarı saydam renk olacak, soldaki tüp gibi. Daha sonra, karıştırılan hücre odası basınç için harici bir azot hattı kullanın ve iki kez orta karıştırma hızında 50 mililitre protein konsantre.
Daha sonra proteini 10 mililitreye konsantre edin ve konsantre proteini 0,45 mikrometrelik gözenek şırınga filtresinden filtreleyin. Aliquot 150 mikrolitre proteini tek tek 200 mikrolitre polimeraz zincir reaksiyon tüpleri içine. Daha sonra, sıvı nitrojen ve depolama eksi 80 santigrat derece anında flaş dondurma için eldiven kutusundan kapaklı aliquots çıkarın.
DesB tuzsuzlaştırma için, ilk sephadex G-25 Kaba tuzsuz jel üç mililitre dokuz mililitre borosilikat sütun ekleyin ve gazsız tuz tampon iki sütun hacimleri ile sütun yıkayın. DesB çözüldüğünde, saflaştırılmış proteini yerçekimi kontrollü bir işlemle kolona yükleyin ve yaklaşık beş mililitre tuzsuzluk tamponu yla 12 şişenin her birine üç damla protein atmadan önce akışı atın. Oksijen elektrodu hazırlamak için, bir spacer kağıt yaklaşık 1,5 inç kare kesmek için makas kullanın ve kare her yüzüne küçük üçgenler kesmek, elektrot sarma yardımcı olmak için köşelerinde yarıklar ile.
Elektrodun gümüş anod oluğuna %50 potasyum klorür çözeltisi beş damla ekleyin ve damlaları sürekli bir çözelti halkası oluşturacak şekilde bağlayın. Platin elektrotüstüne iki damla potasyum klorür çözeltisi ekleyin ve uzay kağıdını platin elektrotun üzerine dikkatlice yerleştirin ve uzay kağıdını hava kabarcığı olmaması için düzeltin. Yaklaşık iki inç uzunluğunda bir S4 30m PTFE membran parçasını kesin ve elektrotun dış halkası ile hizalanır şekilde membranın kenarlarını çıkararak boşluk kağıdının üzerine yerleştirin.
Bir O-ring aplikatör kullanarak, elektrot üzerine spacer kağıt ve membran güvenli elektrot üzerinde küçük bir O-halka itin ve elektrot dairesel oluk üzerine daha büyük bir O-halkası yerleştirin, altında hiçbir membran olduğunu dikkat. Elektrotun üst haznesini taban üzerine kaydırın ve iki parçayı birbirine vidalayın. Monte edilen elektrotun tabanına yerleştirin ve elektrotı izleme sistemine bağlayın.
Enzimatik reaksiyon oranını belirlemek için, elektrot kontrol ünitesi aracılığıyla oksijen tüketimini ölçmek için bilgisayar entegrasyonu ile oksijene duyarlı Clark tipi elektrot kullanın. Elektrot odasına uygun substrat hacmine bir mililitre Tris tampon ekleyin ve çözeltiyi 10 saniye karıştırın. 10 saniye sonra, yavaşça piston ile oda mühür ve üst aşağı vida.
Hazneden yerinden edilen fazla sıvıyı emmek için temiz bir doku kullanın ve elektrotun çözeltideki oksijen konsantrasyonunun en az bir dakika boyunca sabit bir ölçüm üretebileceği bir yerde dengede durmasını bekleyin. Daha sonra, piston aracılığıyla elektrot odasına yaklaşık bir mikrolitre enzim eklemek ve hız verilerini toplamak için gaz geçirmez, 10 mikrolitrelik bir şırınga kullanın. Belirli bir substrat konsantrasyonu için tüm oran toplandığında, elektrot odası boşaltmak için yan kol vakum şişesine bağlı plastik bir tüp kullanın ve tekrar tekrar su ile dört ila altı döngü boyunca oda durulayın.
Daha sonra, yeni bir substrat konsantrasyonu kullanarak, sadece gösterildiği gibi elektrot çözeltisi kurmak. DesB-maltoz bağlayıcı protein füzyon yapısı saflaştırma bireysel fraksiyonları SDS-PAGE jel analizi saf protein ürün izolasyon ortaya koymaktadır, bir kenara DesB ve maltoz bağlayıcı protein etki alanı ürünleri varlığı için birbirinden ayrıldı. Tüm kinetik ölçümler yapıldıktan sonra, örneğin DesB'nin gallate ile aktivitesi, değişen gallate konsantrasyonlarında oksijen tüketimi nin oranının ölçülmesi ile elde edilebilir.
Tersine, dört-nitrocatechol ile DesB inhibisyonu oranı dört-nitrocatechol değişen konsantrasyonlarda varlığında bir milimolar gallate ile DesB oksijen tüketiminde azalma gözlemleyerek belirlenebilir, gösteren, örneğin, dört nitrocatechol oksijen tüketimini inhibe ve böyle dedeB reaksiyonu. Bu yöntem demirbağımlı dioksijenaz enzimlerinin incelenmesiiçin içgörü sağlasa da, diğer metalloenzimler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bir torpido kutusu içinde çalışmanın zor olabileceğini unutmayın, bu yüzden bu tekniği yaparken acele etmemeye dikkat edin.
