Name: mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

HAC Milton E. Cassel bilgin Rita Allen Vakfı (http://www.ritaallenfoundation.org) yapıldı. Bu eser HAC için Ulusal Enstitüsü, genel tıbbi Bilimler R01 GM081686, R01 AR070245, Ulusal Enstitüsü () genel tıbbi Bilimler R01 GM0866465, Eli ve Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi ve kök hücre araştırma hibe tarafından finanse edildi Rose Hills ve Hal Gaba Ödülleri), Iris Cantor kadın Sağlık Merkezi/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, lösemi lenfoma Derneği etkisi Jonsson kapsamlı kanser Merkezi'nden ödül WEL ve HAC için. Bu yayında bildirilen araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P50CA092131 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. HAC Eli & Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi & kök hücre araştırmaları, UCLA Moleküler Biyoloji Enstitüsü ve UCLA Biyoinformatik bölümler arası Programı üyesidir.

Açıklanan tüm deneylerin hayvan bakımı Komitesi Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles tarafından kabul edildi.
1. dondurulmuş fare deri slaytlar oluşturmak
<ol><li>Fareler kurum politikası doğrultusunda ötenazi. Not: koruyucu giysiler için kurumsal ilke uygulayın. Tüm iletişim kuralları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir.</li>
	<li>Fare ile bir hayvan kılı düzeltici tüylerden.</li>
	<li>İnsizyon deri makas kullanarak olun. Forseps kullanarak, uzak fare cilt kaldırın. Makas kullanarak, cilt Bölüm Kes gitsin.</li>
	<li>Cryomold reaktif bileşik dondurma ile doldurun ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Cilt iğne burunlu bölümlere dolu cryomolds kullanarak forseps yerleştirin. Cilt dokusu dilimlerin bir kesit derinin epidermis dermis, hypodermis ve kas (Şekil 2) oluşturur gelecek şekilde yönlendirin. Not: Eğer mümkünse, deneysel bağlayabilir ve böylece aynı slayt kesitli ve birlikte işlenen fareler birlikte aynı cryomold kontrol. Kabarcıklar oluşturmak değil için dikkat ediniz.</li>
	<li>Cryomold bir buz kovası Kuru buz kalıbı düz yüzeye yerleştirin ve dondurma izin. Cilt yönünü izlemeye devam edin. Gerekirse ayarlayın. Not: Kuru buz işlerken kriyojenik eldiven giymek.</li>
	<li>Cryomolds-80 ° C dondurucu depolama içine aktarın. Örnekleri dondurucuda yaklaşık 3 ay enzimatik aktivite, önemli kaybı olmadan sürdürülebilir. Donmuş bölümleri kurumasına izin vermeyin.</li>
	<li>-20 ° c, 7-10 µm en iyi cilt morfoloji21için kalın bölümler oluşturmak için dilim doku bir cryostat kullanarak.</li>
</ol>2. slayt boyama için hazırlanması
<ol><li>Test edilmesi için slaytlar kümesi oluşturun. Bir denetim slayt üzerinde NAD tevkif içerir ve başka bir denetime slayt üzerinde belgili tanımlık substrate, laktat, tevkif edilecektir. Daha önce soruşturma bir donmuş doku blok olumlu denetim slayttan içerir.</li>
	<li>Kısaca 5 min için % 4 formalin ile cilt bölümü içeren slaytlar ya pipetting 1 mL % 4 formalin bir slayda veya birden çok slayt, slayt %4 formalin içeren bir konteyner içine daldırma tarafından işlenmesi sırasında düzelt. Not: Cilt slaytlardan aşağıdaki yordamlar ve korunağı cilt morfoloji sırasında soyulmak değil fiksasyonun sağlayacaktır. Dikkat: Formalin kanserojen ve tehlikeli olduğunu; eldiven giymek, senin cilde temas ve kimyasal duman mahallede bu adımı gerçekleştirin izin vermeyin.</li>
	<li>En az 1 mL fosfat ile yıkama slaytlar arabelleğe alınmış serum, pH 7.4, slayt pipetting veya daldırma.</li>
</ol>3. çözüm boyama hazırlanması
<ol><li>Laktat dehidrogenaz aktivitesi boyama için girdap birlikte reaktifler (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM phenazine methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium mavi klorür ve 30 mM laktat) boyama miktarına bağlı olarak uygun ölçekli bir tüp Çözüm gerekli. Not: 1 mL tamamen bir slayt karşılamak için yeterli olur.</li>
	<li>Tüm reaktifler NAD dışında mevcut olan ikinci bir çözüm hazırlamak. Tüm reaktifler laktat dışında mevcut olan üçüncü bir çözüm hazırlamak.</li>
</ol>4. kuluçkaya slaytlar çözüm boyama
<ol><li>Yavaşça damlalıklı boyama çözüm veya bölümün tamamını kapsayan hazırlanan slaytlar üzerine kontrol çözümleri (1 mL bir slayt için yeterli). Birden çok slayt birlikte işlenen eğer boyama çözüm tüm slaytlara aynı anda daldırma (kapsayıcı tamamen doku bölümü karşılamak için yeterli bir çözüm olduğundan emin olun).</li>
	<li>Karanlıkta 37 ° C'de oksijen bir ortamda slaytlar kuluçkaya. Çözüm boyama slayt üstünde ise, slayt buharlaşma önlemek için oksijen bir ortamda yerleştirin.</li>
</ol>5. monitör slaytları
<ol><li>Boyama çözüm dönüşümden görsel denetim tarafından mavi için Sil izlemek. Örnekleri mavilik istenen seviyeye ulaşmış, reaksiyon boyama çözüm kaldırarak durdurur. Not: cilt için 10 dakika yeterlidir. Zaman organ ve enzimatik aktivite bağlı olacaktır.</li>
	<li>Pipetting tarafından slaytlar fosfat tamponlu tuz ile yıkayın (1 mL her slayt için yeterli) veya daldırma. Not: birbirine Karşılaştırılacak herhangi bir örnekleri boyama çözümde aynı süre için muhafaza edilmelidir.</li>
</ol>6. counterstain ve mount
<ol><li>Damlalıklı slayta slaytları mavilik uygun düzeyine ulaştığında counterstain. Not: çekirdeklerin açmak kırmızı veya yeşil Counterstains formazan tarafından precipitant oluşturulan mavi ile iyi kontrast sağlar.</li>
	<li>Sulu ya da sulu olmayan orta22montaj ile bağlayın. 1-3 damla (40-50 µL) montaj orta kapak notu boyutuna bağlı olarak yeterli.</li>
</ol>7. resim slayt ve ölçmek
<ol><li>Resim slaytları ışık mikroskop altında. Deneysel fotoğraflarını ve kontrol örnekleri ve 10 X, 20 X ve 40 X büyütme, tüm negatif kontrolleri al.</li>
	<li>Mavi leke görüntü analiz yazılımı ile farklı bölgelerdeki yoğunluğunu belirlemek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).</li><li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects.">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li><li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues.">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells.">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments.">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer:+A+systematic+review+with+meta-analysis.">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li><li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies.">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li><li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A:+Therapeutic+potential+in+brain+tumor.">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li><li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+gene:+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure,+function+and+regulation.">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li><li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase.">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li><li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation.">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li><li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism.">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH/NAD(+)+redox+homeostasis+in+cancer+cells.">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer.">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li><li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity.">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li><li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Burada anlatılan yöntem laktat dehidrogenaz veya NADH ya da NADPH, farklı hücre tipleri bir doku veya bir doku zaman içinde farklı bölümlerini içinde oluşturmak diğer metabolik enzimler etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Laktat dehidrogenaz kök hücreler ve tümör biyolojisi anlamak için önemli bir enzimdir ve tek tek hücreler laktat dehidrogenaz etkinliğini izlemek için yeteneği önemli anlayışlar bu enzim fonksiyonu sağlamak olasıdır.
Bir önemli avantaj bu p...

Mekanlar enzimleri yüksek veya düşük aktivite olan dokularda anlamak anlayış geliştirme ve Fizyoloji için esastır. Transkript veya protein düzeyleri kez enzimatik aktivite için vekilleri olarak kullanılır. Bu tür çalışmalar bilgilendirici olabilir, onlar translasyonel modifikasyon, protein kompleksleri veya enzim hücre altı yerelleştirme varlığı gibi bir enzim aktivite belirlemek için kritik olabilir bilgi vermeyin. Enzimatik etkinliğini doğrudan ölçülen zaman, artık bir doku içinde yüksek veya düşük aktivite ile karışım veya kayma dağıtım hücrelerin içindeki tek tek hücreler hakkında bilgi içeren homojenize protein lysates içinde sık sık izlenir.
Biz burada bir doku örneği içinde enzimatik aktivite kayma dağılımını eşlemek için detaylı bir protokol sağlar. Metodoloji önceki çalışmalar tetrazolium tuzları dehydrogenases, redüktaz ve oxidases dondurulmuş doku1aktivite yerelleştirmek için kullanılabileceğini gösteren temel alır. Proton bir tetrazolium tuz2,3' e transfer edildiğinde bu yöntemler ile bir su çözünmez formazan oluşur. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz NADPH ve bir proton oluşturur ve tetrazolium aktivite ile tespit edilmiştir. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz içinde Avrupa dere pisisi tetkikine4, alveoler tip 2 hücrelerinde5 akciğer ve böbrek5ın takip. Tetrazolium tuzları da donmuş doku6transketolase etkinliğini izlemek için kullanılmaktadır. Benzer bir yaklaşım son zamanlarda bitişik slayt7aynı doku içinde birden çok dehydrogenases etkinliğini izlemek için kullanıldı.
Biz burada tetrazolium tuzları laktat dehidrogenaz aktivitesi (Şekil 1) kayma dağılımını izlemek için kullanılacak bir yöntem açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz glikoliz laktat ve ters tepki tarafından oluşturulan pyruvate dönüştürebilirsiniz. Laktat dehidrogenaz sonuç olarak pyruvate'nın giriş tricarboxylic asit çevrimi laktat onun salgısı karşı önemli bir belirleyici bir faaliyettir. Kan laktat seviyeleri kez hastalıklar, hastalık veya yaralanma hücreler zarar vermişse ve enzim piyasaya sinyal çünkü kanser8,9,10, dahil olmak üzere bir dizi teşhis etmek için kullanılır.
Dört laktat dehidrogenaz genler vardır: LDHA, LDHB, LDHC ve LDHD11. LDHA ve LDHB bir erken LDHA gen12tekrarını ortaya çıktığı düşünülmektedir. Karaciğer bir tetramer etkindir ve LDHA ve LDHB homotetramers ve heterotetramers birbirleri ile oluşabilir. LDHA LDHB daha yüksek laktat benzeşim ve tercihen laktat pyruvate13için dönüştürmek için rapor ederken pyruvate için daha yüksek ilgi var bildirilmektedir. LDHA organizatörü bağlayıcı siteleri HIF1α, cMYC ve FOXM1 transkripsiyon faktörleri11içerir. Buna ek olarak, birçok diğer glycolytic enzimler14,15gibi karaciğer post-translational modifications tarafından değiştirilebilir. Fibroblast büyüme faktörü reseptörü 1 LDHA tetramer oluşumu teşvik, Y10 veya NADH substrat bağlama16teşvik Y83 fazdan. LDHA-ebilmek da var olmak acetylated17. Bu nedenlerden dolayı sadece karaciğer protein düzeyleri, ama enzim aktivitesi de izleme karaciğer etkinlik tam bir anlayış gerektirir.
Burada mevcut yöntemi yanı sıra diğer yaklaşımlar laktat dehidrogenaz etkinliğini izlemek için kullanılmaktadır. Laktat dehidrogenaz aktivitesi spectrophotometrically homojenize protein lysate izlenebilir. Gibi laktat pyruvate için dönüştürülür NADH nesil 340 absorbans temel alarak ölçülebilir nm, süre gibi pyruvate laktat18için dönüştürülür NADH kaybolması izlenebilir. Laktat dehidrogenaz aktivitesi manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile de izlenir. 13 C-pyruvate idare ve laktat pyruvate dönüşüm oranı olarak izlenebilir [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate. Yüksek oranları [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate kanser dokusu19' gözlemlenmiştir. MRI tabanlı yaklaşımlar laktat dehidrogenaz aktivitesi normal ve hastalık doku üzerinde bilgi sağlayabilir iken, metodolojiler belirli hücrelerdeki faaliyet düzeyi belirlemek için gereken çözünürlük var mı. Burada sağlanan metodoloji laktat dehidrogenaz aktivitesi tek hücre doku alanları ve hatta ilgili bilgi sağlar.
Situ etkinlik testleri kullanarak, laktat dehidrogenaz aktivitesinin fare cilt20saç kökü kök hücrelerde yüksek olduğunu fark ettik. Biz de laktat dehidrogenaz kültürlü embriyonik kök hücre içinde etkinliğini izlemek ve faaliyetin besleyici katman kök hücre içinde daha yüksek olması kurmak için kullanılan yöntem. Son olarak, taze fare aort laktat dehidrogenaz aktivitesinin izlenmeli ve düz kas hücrelerinde boyama görülmektedir. Biz burada donmuş fare cilt laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme için detaylı bir protokol tanımlamak.

<table><tbody><tr><td>Surgical instruments</td><td></td><td></td><td>For collecting skin from euthanized mice</td></tr><tr><td>Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>For freezing mouse skin</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9638938</td><td>For mounting cryomolds</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polysine Adhesion Slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>4% formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td>Dilluted in water</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline, pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Phenazine methosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolium blue chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Lithium L-lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>Substrate</td></tr><tr><td>37&amp;deg;C incubator (or tissue culture incubator)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braziliant! Counter stain</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>Counter stain</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips for slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

Uzay ve zamanın enzimatik aktivite haritalama normal doku ve hastalık hücre davranışı moleküler temeli anlamak için önemlidir. Situ metabolik aktivite deneyleri bir doku içinde metabolik aktivite kayma dağıtımı hakkında bilgi sağlar. Biz burada enzim laktat dehidrogenaz doku örnekleri içinde doğrudan etkinliğini izlemeye yönelik detaylı bir protokol sağlar. Laktat dehidrogenaz olup tüketilen glikoz enerji aerobik veya anaerobik glikoliz yoluyla dönüştürülür önemli bir belirleyici olduğunu. Laktat ve NAD içeren bir çözüm bir donmuş doku bölümüne sağlanır. Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD) NADH ve tespit edilebilir bir proton azaltılmasına dayanan sağlanan aynı anda dönüştürme sırasında hücreleri yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi pyruvate için sağlanan laktat dönüştürme nitrotetrazolium mavi formazan, mavi bir çökelti görüntülenir. Biz fare cilt laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı uygulamak, laktat dehidrogenaz aktivitesi yüksek deneniyor saç kökü kök hücreleri cilt içinde olduğunu fark ettik. Protokol kültür fare embriyonik kök hücre için uygulama daha yüksek kültürlü embriyonik kök hücre boyama fare embriyonik fibroblastlar ortaya koydu. Çözümleme taze izole fare aort düz kas hücrelerinde aort için dikey boyama ortaya. Sağlanan metodoloji dağınık şekilde bir proton dondurulmuş ya da taze doku oluşturmak enzim aktivitesinin eşlemek için kullanılabilir.

Biz daha önce fare cilt20 in situ faaliyet deneyleri için sonuçlar bildirdin. Şekil 3' te gösterildiği gibi saç kökü kök hücre yukarıdaki yordamları tarif ederken Folliküler temelini laktat dehidrogenaz aktivitesinin yüksek seviyeleri takip edildi gözlenen. Bu bulgular deri saç kökü kök hücre için sıralama ve yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi kök hücre yerde sıralanmış hücreleri üzerinde etki...

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Biz nicotinatmide adenin dinükleotit fosfat (NAD(P)H) + H + doğrudan doku örnekleri '. oluşturmak enzimler için enzimatik aktivite kayma dağıtım eşleştirmek için bir protokol tarif

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.4K Görüntüleme.  UCLA. Biz nicotinatmide adenin dinükleotit fosfat (NAD(P)H) + H + doğrudan doku örnekleri '. oluşturmak enzimler için enzimatik aktivite kayma dağıtım eşleştirmek için bir protokol tarif

Video: Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert NADH and FADH into ATP. Since mitochondria are also the primary site for oxygen use and nutrient oxidation to carbon dioxide and water, how efficiently they use oxygen and produce ATP directly relates to the efficiency of nutrient metabolism, nutrient requirements of the animal, and health of the animal. The purpose of this method is to examine mitochondrial respiration, which can be used to examine the effects of different drugs, diets and environmental effects on mitochondrial metabolism. Results include oxygen consumption measured as proton dependent respiration (State 3) and proton leak dependent respiration (State 4). The ratio of State 3 / State 4 respiration is defined as respiratory control ratio (RCR) and can represent mitochondrial energetic efficiency. Mitochondrial proton leak is a process that allows dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) by uncoupling oxidative phosphorylation from ADP decreasing the efficiency of ATP synthesis. Oxygen and TRMP+ sensitive electrodes with mitochondrial substrates and electron transport chain inhibitors are used to measure State 3 and State 4 respiration, mitochondrial membrane PMF (or the potential to produce ATP) and proton leak. Limitations to this method are that liver tissue must be as fresh as possible and all biopsies and assays must be performed in less than 10 h. This limits the number of samples that can be collected and processed by a single person in a day to approximately 5. However, only 1 g of liver tissue is needed, so in large animals, such as dairy cattle, the amount of sample needed is small relative to liver size and there is little recovery time needed.

Here, we share methods for measuring mitochondrial oxygen consumption, a defining concept of nutritional energetics, and proton leak, the primary cause of inefficiency in mitochondrial generation of ATP. These results can account for 30% of the energy lost in nutrient utilization to help evaluate mitochondrial function.

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Biyokimya

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and progression. Complexity within the tumor microenvironment, including tumor secretome, low-grade inflammation, hypoxia, and redox imbalance, fosters heterotypic interaction and allows the transformation of inactive resident fibroblasts to become active CAFs. CAFs are metabolically distinguished from normal fibroblasts (NFs) as they are more glycolytically active, produce higher levels of reactive oxygen species (ROS), and overexpress lactate exporter MCT-4, leading to the opening of the mitochondrial permeability transition pore (MPTP). Here a method has been described to analyze the mitochondrial health of activated CAFs isolated from the multicellular 3D tumor spheroids comprising of human lung adenocarcinoma cells (A549), human monocytes (THP-1), and human lung fibroblast cells (MRC5). Tumor spheroids were disintegrated at different time intervals and through magnetic-activated cell sorting, CAFs were isolated. The mitochondrial membrane potential of CAFs was assessed using JC-1 dye, ROS production by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) staining, and enzyme activity in the isolated CAFs. Analyzing the mitochondrial health of isolated CAFs provides a better understanding of the reverse Warburg effect and can also be applied to study the consequences of CAF mitochondrial changes, such as metabolic fluxes and the corresponding regulatory mechanisms on lung cancer heterogeneity. Thus, the present study advocates an understanding of tumor-stroma interactions on mitochondrial health. It would provide a platform to check mitochondrial-specific drug candidates for their efficacies against CAFs as potential therapeutics in the tumor microenvironment, thereby preventing CAF involvement in lung cancer progression.

Multicellular 3D tumor spheroids were prepared with lung adenocarcinoma cells, fibroblasts, and monocytes, followed by the isolation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) from these spheroids. Isolated CAFs were compared with normal fibroblasts to assess mitochondrial health by studying the mitochondrial transmembrane potential, reactive oxygen species, and enzymatic activities.

3D Çok Hücreli Akciğer Tümörü Sferoidlerinden İzole Edilen Kanserle İlişkili Fibroblastlarda Mitokondriyal Sağlığın Değerlendirilmesi

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Kanser Araştırmaları

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

Metabolik eşleme: Nicel enzim Cytochemistry ve Histochemistry Dehydrogenases hücre ve dokulara etkinliğini belirlemek için

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Biyoloji

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Laktaz enzim etkinliğin ölçülmesi öğretim laboratuarında

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Evaluating Cytotoxicity and Membrane Integrity in Lung Slices via Lactate Dehydrogenase Assay

Source: Neuhaus, V., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57042">Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the lactate dehydrogenase, LDH assay to measure the cytotoxic effect of a test substance and its effect on the membrane integrity in human precision-cut lung slices. The assay provides a quantitative measure of cell death or damage in the sample.

Laktat Dehidrojenaz Testi ile Akciğer Dilimlerinde Sitotoksisite ve Membran Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines
1. General Preparation of Human PCLS ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Özelleşmiş Analizleri

Quantifying Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Source: Luhr, M. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57971">The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an assay for assessing bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells. It utilizes electroporation to release cytosolic proteins, including lactate dehydrogenase (LDH). The sequestered LDH and total cellular LDH fractions are determined to assess LDH sequestration, providing insights into the overall bulk sequestration activity.

Memeli Hücrelerinde Toplu Otofajik Sekestrasyon Aktivitesinin Ölçülmesi

1. Cell Seeding and Treatment

	Culture adherent cells in 75 cm2&#160;tissue culture flasks in a humidified incubator with 5% CO2&#160;at 37 &#176;C, ...

Hücresel İmmünodiyagnostik

Colorimetric Assay for Quantification of Lactate in Test Samples

Source: Yanase, S., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57807">Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video describes a colorimetric assay for lactate measurement in cell lysates by using the lactate dehydrogenase enzyme. This enzyme converts lactate into pyruvate, along with the conversion of NAD to NADH that reacts with tetrazolium dyes and gives a colored product that can be measured spectrophotometrically to quantitate the lactate.

Test Numunelerinde Laktat Miktarının Belirlenmesi için Kolorimetrik Test

Source: Yanase, S., et al. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. ...