Name: light-driven enzymatic decarboxylation
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
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R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell&#39;uso. Molti dei prodotti chimici utilizzati in queste sintesi sono altamente tossici e cancerogeni. Tutte le fasi che coinvolgono solventi organici nocivi, in particolare l&#39;estrazione dei prodotti di reazione e la derivatizzazione di acidi grassi devono essere effettuate sotto una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni full-length, scarpe chiuse ). Tutte le operazioni che coinvolgono organismi geneticamente modificati in questo lavoro richiedono installazioni che sono stati approvati per la gestione di organismi geneticamente modificati della S1 livello di sicurezza. 1. L&#39;espressione della ricombinante decarbossilasi olet JE in E. coli <ol><li> Preparazione del ceppo produttivo <ol><li> Preparare un gene sintetico di Olet JE dal Jeotgalicoccus e clonato nel vettore di espressione PASK-IBA37plus come descritto. 8 </sup&gt; NOTA: Per evitare la degradazione degli acidi grassi dagli enzimi del metabolismo batterico, E. coli ceppo JW5020 della collezione Keio con un percorso disfunzionale per la degradazione degli acidi grassi è stato utilizzato. </li></ol></li><li> La coltivazione e l&#39;induzione di espressione dell&#39;enzima <ol><li> Preparare una pre-cultura inoculando la E. coli JW5020 olet mutante da un LB-plate (contenente 100 mg ml -1 ampicillina) in due 3 ml di LB-media in provetta. Pipetta ampicillina (100 ug ml -1) da una soluzione madre nel mezzo di selezione e incubare a 37 ° C per 15 h in un incubatore agitazione a 180 rpm. </li><li> Aggiungere 2 ml di pre-culture di due 200 ml di LB-media, contenente ampicillina (100 mg ml -1), in 1 fiaschi L agitare. Incubazione procede a 37 ° C e 180 rpm. </li><li> Monitorare il cambiamento di OD 600nm dopo l&#39;inoculazione. Quando la OD 600 raggiunge un valore compreso tra 0,6 und 0.8 indurre l&#39;espressione con l&#39;aggiunta di tetraciclina (0,2 mg ml -1). Incubare le culture per 15 ore a 20 ° C e 180 rpm. NOTA: Poiché Olet JE contiene un cofattore eme, è necessaria aggiunta di acido levulinico δ-Amino (0,5 mM) prima dell&#39;induzione di fornire la cultura con un precursore per la sintesi cofattore. </li></ol></li><li> La lisi cellulare <ol><li> Eseguire i seguenti passi sul ghiaccio. Trasferire le culture per decantazione o pipettando nella provette da centrifuga e utilizzare una scala per garantire la parità di distribuzione. Centrifugare le colture per 20 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminare attentamente il supernatante e risospendere il pellet in 50 ml di tampone (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) pipettando e trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga conica. </li><li> Dopo centrifugazione per 15 min a 4000 xga 4 ° C scartare il surnatante, risospendere ogni pellet in 3 ml di tampone pipettando. </li><li> Eseguire la lisi cellulare da cosìnicating le soluzioni su ghiaccio (tre cicli x 30 sec) lasciando un 1 minuto di pausa tra i cicli. Centrifugare le soluzioni per 20 min a 15.000 xg a 4 ° C per rimuovere detriti cellulari e trasferire il surnatante in un tubo di centrifugazione conica senza disturbare il pellet pipettando. Eliminare il pellet. NOTA: Una frazione solventi sarà utilizzato direttamente per biocatalisi dopo piccole molecole vengono rimossi. La seconda frazione sarà utilizzata per la purificazione del His-tag Olet JE. </li></ol></li><li> La rimozione di piccole molecole di Cell-estratti <ol><li> Prima di utilizzare l&#39;estratto grezzo in biocatalisi rimuovere piccole molecole che possono interferire con la formazione di perossido di idrogeno o trasferimento elettronico pipettando 3 ml di estratto cellulare in un&#39;unità filtrante centrifuga con 10 kDa membrana e centrifugare a 4000 xga 4 ° C. Risospendere la proteina residua in 3 ml di Tris-HCl-buffer. </li></ol></li><li> Purificazione di Olet </strong&gt; <ol><li> Applicare 3 ml del secondo estratto cellulare ai suoi Pur Ni-NTA colonne di rotazione, che sono stati equilibrati prima con tampone di equilibrazione (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazolo 10 mM). </li><li> Sigillare le colonne con i tappi di fondo e tappi a vite superiore e stringere leggermente fino a quando la resina viene distribuito equamente con l&#39;estratto cellulare. Incubare le colonne caricate per 30 min in un agitatore testa a 4 ° C. </li><li> Lavare le colonne di 1 ml di tampone di lavaggio (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazolo 20 mM, pH 7,4) per centrifugazione a 700 xg per 2 minuti. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Posizionare le colonne in un tubo di centrifugazione conica fresco e aggiungere 1 ml di tampone di eluizione (Tris 20 mM, NaCl 300 mm, 250 mm imidazolo, pH 7,4) olet JE. Centrifugare a 700 g per 2 minuti e ripetere l&#39;operazione due volte. NOTA: Imidazole si legherà al nichel e quindi rimuovere olet JE dalla colonna. </li><li> Trasferire il eluizione di un gruppo filtro centrifuga (10 mem kDabrane) e centrifugare a 4000 xga 4 ° C per rimuovere imidazolo. </li><li> Controllare la purezza dell&#39;enzima da un SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 microlitri della eluizione con SDS-buffer (1x concentrazione finale) e incubare la soluzione a 95 ° C per 5 minuti per denaturazione. Successivamente applicare la quantità totale su un SDS-PAGE. Attivare il gel a 35 mA utilizzando uno standard commerciale proteine. Rilevare la proteina a 50 kDa. </li><li> Per determinare la concentrazione proteica utilizzare una disposizione BSA-kit commerciale. Pipettare 50 ml di campioni di proteine ​​diluito (1: 100, 1: 200, 1: 500) e standard di BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) in una piastra a 96 pozzetti . Aggiungere 200 ml di reagente di Bradford, misurare l&#39;assorbanza a 595 nm dopo 15 min con un fluorimetro e calcolare le concentrazioni utilizzando la curva standard. </li></ol></li></ol> 2. Biotrasformazione Light-catalizzata <ol><li> Le reazioni biocatalitici senza aggiunta di perossido di idrogeno<ol><li> Preparare una soluzione di 10 ml di 10 mM di acido stearico (M r 284,5 g mol -1) aggiungendo 10% (v / v) tergitol e 0,0284 g di acido stearico di acqua distillata. Riscaldare la soluzione in una stufa a 60 ° C fino l&#39;acido grasso è completamente sciolto. </li><li> Biocatalisi e campionamento <ol><li> Preparare due 2 ml miscele di reazione contenenti 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM acido stearico in Tris-HCl-buffer. Aggiungere una barra di agitazione magnetica per apporto di ossigeno sufficiente e posizionare i tubi di vetro in un bagno d&#39;acqua, riscaldata a 25 ° C. </li><li> Aggiungere 200 mg ml -1 di enzima purificato o 10% (v / v) estratto cellulare a ciascuna delle miscele di reazione e illuminare con una lampadina di vetro chiaro (120 W) in 15 cm di distanza delle provette di reazione. </li><li> Prendere 200 campioni microlitri in punti temporali specifici (0, 10, 30, 60 e 120 min e durante la notte) fermare la reazione con 20 l 37% di HCl. Aggiungere 5 ml di acido miristico (10 mM magazzino cosìluzione) come standard interno. </li></ol></li></ol></li><li> Analisi dei prodotti di reazione <ol><li> Per l&#39;estrazione aggiungere 500 microlitri di acetato di etile ai campioni due volte, invertire i tubi e centrifugare per 1 min a 13.000 x g. </li><li> Togliere 400 ml di surnatante e lasciare che il solvente completamente evaporare. </li><li> Derivatize gli acidi carbossilici in acido trimethylsilylcarboxylic aggiungendo 200 microlitri N -methyl- N - (trimetilsilil) acetammide trifluoro (MSTFA). Incubare la soluzione a 60 ° C per 30 minuti per convertire i gruppi ossidrilici di trimetilsilil etere. </li><li> Determinazione della conversione in GC / FID NOTA: Determinare la formazione di 1-eptadecene (RT: 8,34 min), acido stearico α- e β-idrossi (RT: 12.05 e 12.1 min) e la diminuzione del substrato (RT: 11,15 min) mediante GC / FID. <ol><li> Impostare il profilo di temperatura descritto di seguito impostare la temperatura di iniezione a 340 ° C. tenerela temperatura iniziale del forno è a 90 ° C per 3,5 minuti e successivamente aumenta a 45 ° C min -1. A 220 ° C, mantenere la temperatura per 2 min. Dopo un ripetuto aumento di 45 ° C min -1, mantenere la temperatura a 280 ° C per 2 minuti e poi aumentare con 60 ° C min -1. NOTA: La temperatura massima di 330 ° C è tenuto per 1.44 min. </li><li> Iniettare 4 ml di campione, con un rapporto di divisione di 5 per ottenere una rapida volatilizzazione e miscelazione omogenea con elio gas di trasporto. NOTA: In dipendenza dalla temperatura crescente substrato e prodotti entreranno nella fase gassosa. Le sostanze sono rilevati dal rilevatore / FID GC dopo aver superato la colonna in tempi di ritenzione specifici e vengono visualizzati come picchi sullo schermo. Osservare la formazione del picco sul monitor. </li><li> Calcolare la concentrazione di prodotto formato dalla seguente formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; NOTA: Il fattore di calibrazione è stata determinata specificamente per questa colonna per ogni substrato e prodotto calcolando la curva standard dalla quantità note delle sostanze derivatizzati e la loro area del picco corrispondente. </li></ol></li><li> Identificare i picchi di acido olefine e beta-idrossi mediante GC / MS. <ol><li> Identificare i picchi di acido olefine e beta-idrossi mediante GC / MS. Impostare il profilo di temperatura. Impostare la temperatura di iniezione a 250 ° C. Mantenere la temperatura del forno a 100 ° C per 5 minuti e poi aumentare a 20 ° C min -1. NOTA: massima temperatura viene mantenuta per 7,5 min. </li><li> Impostare la temperatura del rivelatore spettrometro di massa a 250 ° C e la scansione da 50 a 500 m / z in modalità impatto elettronico. NOTA: Electron impatto ionizzazione rimuove un singolo elettrone causando la formazione di un catione radicale che verrà passato in avanti per l&#39;analisi di massa. A causa dei legami covalenti energia intramolar alte all&#39;interno delpausa molecola creando frammenti di bassa m / z. Questi frammenti formano un&#39;impronta digitale specifico per una sostanza. </li><li> Iniettare 1 ml di campione. Detect 1-eptadecene dopo 11.4 min Tempo di ritenzione dal corrispondente impronta digitale (Figura 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La generazione di luce-driven di perossido di idrogeno può essere applicato per una gamma redox trasformazioni, tra cui peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 e P450 monoossigenasi 5. Si tratta di un approccio semplice e praticabile. A lungo termine, l&#39;uso di luce visibile apre la prospettiva di utilizzare la luce solare per trasformazioni chimiche, che è un&#39;alternativa sostenibile per reazioni ricchi di energia. Il metodo è applicabile con l&#39;enzima purificato o con estratto cellulare. Mentre quest&#39;ultimo richiede meno costi e lavoro, va notato che le piccole molecole nel estratto grezzo possono interferire con la conversione catalizzata luce. Un approccio possibile è rimuovere questi piccoli componenti con micromembrana (cioè, per centrifugazione in un gruppo filtro centrifugo o dialisi). La concentrazione della molecola luce raccolta FMN determina la concentrazione del perossido di idrogeno. A seconda della affinity del ossidoreduttasi, questa concentrazione è determinante per l&#39;attività enzimatica. Un altro fattore importante è la concentrazione di EDTA donatore di elettroni sacrificale. Il parametro più importante, tuttavia, è la stabilità operativa e l&#39;attività dell&#39;enzima. Il olefinization di acidi grassi è un elegante reazione per la conversione di acidi grassi a base biologica in olefine che appartengono ai principali prodotti per l&#39;industria chimica. Il biocatalitica decarbossilazione light-driven può essere effettuata a temperatura ambiente ed a pH neutro, che offre evidenti vantaggi in termini di sostenibilità. I nostri risultati mostrano che generazione in situ di perossido di idrogeno è una strategia per fornire il cofattore senza compromettere la stabilità dell&#39;enzima, portando ad una conversione elevata. metodi attuali per la rigenerazione del cofattore utilizzano prodotti agricoli o prodotti chimici a base di petrolio. Le reazioni luce-driven stanno emergendo come alternativa rinnovabile. Futuroricerca sarà dedicata ai metodi per la sostituzione del reagente EDTA sacrificale da molecole più economici e per ridurre la quantità della molecola FMN luce raccolta.

Il cambiamento climatico e il prevedibile esaurimento delle risorse rinnovabili rappresenta una grave minaccia per la nostra società. In questo contesto, catalisi enzimatica rappresenta un potenziale ancora pienamente sfruttata per lo sviluppo di sostenibile e &#39;verde&#39; chimica 1. Ossidoriduttasi hanno la capacità di catalizzare l&#39;introduzione e la modifica dei gruppi funzionali in condizioni lievi reazioni e appartengono alle più importanti biocatalizzatori 2. La maggior parte delle trasformazioni redox richiedono la fornitura di esterna di cofattori quali NAD (P) H. Metodi per la rigenerazione del cofattore sono stati applicati in scala industriale. Tuttavia, ancora si traducono in alti costi di processo, che limita la loro applicazione soprattutto per prodotti di alto valore. È interessante notare che diversi perossidasi 3,4 e monoossigenasi P450 5 accetta elettroni da perossido di idrogeno attraverso la cosiddetta shunt perossido. Mentre H 2 O 2 è un buon co-reagente, è riferito harmful per molti enzimi. Una costante formazione in situ di basse concentrazioni di perossido di idrogeno è un approccio praticabile per guidare la reazione senza compromettere la stabilità operativa di enzima. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Figura 1. Set-up sperimentale della decarbossilazione photobiocatalytic di acidi grassi da olet JE. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> L&#39;uso della luce come fonte di energia per processi chimici e biologici ha ricevuto una crescente attenzione negli ultimi anni 6. Generazione di luce-driven di perossido di idrogeno è emerso come un metodo semplice e robusto per la fornitura di acqua ossigenata per le trasformazioni redox (Figura 1). Un fotocatalizzatore come flavina adenina mononucleotide (FMN) permette la riduzione dell&#39;ossigeno molecolare al perossido di idrogeno, che viene quindi utilizzato come cofattore per la reazione enzimatica oxyfunctionalization. Possibili donatori di elettroni sono acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), ascorbato o formiato poco costoso. Il metodo è generalmente applicabile per H 2 O 2 enzimi -dipendenti, tra cui perossidasi 3,4 e monoossigenasi P450 5. Abbiamo recentemente studiato l&#39;applicazione di una decarbossilasi batterica novel 7 per la trasformazione dei grassi naturali in olefine 8. Questo sarebbe un percorso sostenibile per la sintesi di sostanze chimiche piattaforma ampiamente utilizzati da una fonte a base biologica. Il decarbossilasi olet JE dal batterio gram-positivi Jeotgalicoccus sp. catalizza la decarbossilazione ossidativa degli acidi grassi e forma 1-alcheni come prodotti. Olet JE è strettamente legato al monoossigenasi batteriche P450 e ha bisogno di elettroni fperossido di idrogeno rom per la reazione. Sfortunatamente, l&#39;aggiunta di H 2 O 2 ad una soluzione di substrato e l&#39;enzima provocato basse conversioni e una scarsa riproducibilità dei risultati, presumibilmente a causa di un effetto nocivo di perossido di idrogeno sulla stabilità del Olet JE. Generazione di una proteina di fusione con la NADPH-reduttasi RhFred fatto un decarbossilazione NADPH-dipendente possibile. 9 Tuttavia, il prezzo elevato di NADPH e le attuali limitate possibilità di una rigenerazione conveniente ci hanno spinto a indagare donatori di elettroni meno costosi. Ispirato dalla somiglianza di olet JE con monoossigenasi P450, abbiamo usato la generazione di luce-catalizzata di H 2 O 2. Siamo stati lieti di ottenere elevate conversioni (fino a&gt; 95%) utilizzando estratti privi di cellule o soluzioni di enzimi purificati. Con l&#39;esempio di decarbossilazione degli acidi grassi, vi presentiamo un protocollo generale per enzym luce-driventrasformazioni redox ATIC utilizzando FMN come il perossido di fotocatalizzatore e idrogeno come cofattore. I metodi presentati includono la produzione dell&#39;enzima in cellule ricombinanti di E. coli, la purificazione dell&#39;enzima, l&#39;applicazione per la sintesi di 1-alcheni e l&#39;analisi dei prodotti di reazione.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochlorid acid 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;delta;-Amino levulinic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Myristic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stearic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation rotors</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-FID&amp;nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0.25&amp;nbsp;mm x 0.25 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-MS</td><td>FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>Spectral photometer</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity chromatography column</td><td>His Pur Ni-NTA spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>96 Well Multiply&amp;reg;PCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Ossidoriduttasi appartengono agli enzimi industriali più-applicate. Tuttavia, hanno bisogno di elettroni esterni la cui fornitura è spesso costoso e impegnativo. Riciclaggio del NADH o NADPH donatori di elettroni richiede l&#39;uso di altri enzimi e substrati sacrificali. È interessante notare che diversi ossidoreduttasi accettano perossido di idrogeno come donatore di elettroni. Pur essendo poco costoso, questo reagente spesso riduce la stabilità degli enzimi. Una soluzione a questo problema è la generazione in situ del cofattore. L&#39;alimentazione continua del cofattore a bassa concentrazione guida la reazione senza compromettere la stabilità dell&#39;enzima. Questo documento illustra un metodo per la luce catalizzata generazione in situ di perossido di idrogeno con l&#39;esempio della decarbossilasi acido grasso eme-dipendente Olet JE. Il decarbossilasi acido grasso Olet JE stato scoperto grazie alla sua capacità unica di produrre catena lunga 1-alcheni da acidi grassi, un enzimatica finora sconosciutoreazione. 1-alcheni sono ampiamente utilizzati additivi plastificanti e lubrificanti. Olet JE ha dimostrato di accettare elettroni da perossido di idrogeno per la decarbossilazione ossidativa. Mentre aggiunta di idrogeno perossido danneggia l&#39;enzima e si traduce in basse rese, generazione in situ del cofattore aggira questo problema. Il sistema photobiocatalytic mostra evidenti vantaggi per quanto riguarda l&#39;attività enzimatica e la resa, risultando in un sistema semplice ed efficiente per decarbossilazione di acido grasso.

Mentre l&#39;aggiunta di perossido di idrogeno alla miscela di reazione ha determinato bassa a moderata conversioni (&lt;10%), generazione in situ di perossido di idrogeno aumentato la conversione fino al 80% di conversione. Analisi mediante GC / MS mostra la formazione di olefine da acidi grassi (Figura 2). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Profilo di temperatura per misure GC / MS. (B) impronte digitali del eluizione 1-eptadecene dopo 11.4 min. (C) caratteristica secondaria ioni C n H 2n-1 frammento di olefine terminali esemplare mostrato per 1-eptadecene. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> E. coli. Una soluzione enzimatica purificata ha mostrato una chiara correlazione tra la concentrazione di enzima e la conversione. Aumentando la concentrazione del piombo molecola di FMN luce raccolta a conversioni più elevate. Tuttavia, aumentando la concentrazione oltre 10 mM non accelerare ulteriormente le reazioni, indicando che la quantità di perossido di idrogeno è sufficientemente disponibili e non più il fattore limitante. Oltre alla decarbossilazione degli acidi grassi, Olet JE catalizza anche una idrossilazione nel β-posizione. Nella conversione di acido stearico, la decarbossilazione è circa tre volte più veloce della idrossilazione. In un tipico esperimento utilizzando una soluzione di 0,5 mM di acido stearico e 10 pM FMN, 99% del substrato sono stati convertiti ad una miscela di 1-eptadecene e acido 2-idrossistearico con un rapporto di3.3: 1 (Figura 3) 8. Un&#39;indagine dello spettro substrato della biocatalisi light-driven mostrato che per acidi grassi con catene più lunghe acilici, Olet JE catalizza preferenzialmente la decarbossilazione, mentre la quantità relativa di acidi idrossile-grassi nella miscela di prodotto aumenta con breve lunghezza della catena. Acidi grassi più brevi di acido miristico (C14) non hanno subito decarbossilazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Figura 3. L&#39;analisi gas cromatografica Olet JE mediata decarbossilazione di acido stearico (11.15 min) in 1-eptadecene (8.4 min), acido stearico (12.04 min) β-idrossi acido stearico α-idrossi (12,1 min). Viene mostrato il cambiamento delle aree di picco di campioni prelevati nel corso di un tempo-corso di 2 ore. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vie</a>wa più grande versione di questa figura. Sorprendentemente, il acidi insaturi acido oleico (C18: 1D9 cis) e acido linoleico (C18: 2d9d12) non sono stati accettati come substrati, che indica che la configurazione ritorta di doppi legami cis non può essere accolto in una modalità produttiva legame dell&#39;enzima. Aggiunta di acido oleico (10%) anche impedito la conversione di acido stearico. È interessante notare che, acido stearico (C18: 1D9 trans) è stato convertito da Olet JE, ma con l&#39;attività leggermente inferiore quindi acido stearico.

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Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Descriviamo un protocollo per la generazione di luce-catalizzata di perossido di idrogeno - cofattore per trasformazioni ossidative.

Enzimatica decarbossilazione Luce-driven

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Universidad San Sebastian

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Carboxylic Acids

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10.6K Views.  Ruhr Universität Bochum.  Descriviamo un protocollo per la generazione di luce-catalizzata di perossido di idrogeno - cofattore per trasformazioni ossidative. 

Video: Light-driven Enzymatic Decarboxylation

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Un Toolkit per permettere la conversione di idrocarburi in ambienti acquosi

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Ricerca

Bioingegneria

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Biochimica

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Reazioni a cascata enzimatica per la sintesi di Amino alcoli chirali da L-lisina

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Chimica

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Espressione, purificazione, cristallizzazione e saggi enzimatici di Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un test per misurare l&#39;attività di Escherichia coli Inducibile Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biologia

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

Mappatura metabolica: Enzima quantitativa citochimica e istochimica per determinare l'attività della deidrogenasi in cellule e tessuti

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Immunologia e infezioni

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &beta;-Ketoacids

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation easily. However, a silver salt of carboxylic acid&#160;reacts with bromine or iodine under high temperature to release carbon dioxide gas and forms halide&#160;with one less carbon. This reaction is called the Hunsdiecker reaction.
<img alt="Figure1" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 55px;" />
Unlike monocarboxylic acids, &#42933;-keto acids bearing a keto group at the &#946; position to the carboxyl group, readily undergo decarboxylation under an acid medium to form a ketone and releases carbon dioxide gas.
<img alt="Figure2" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 60px;" />
Decarboxylation reaction is biologically relevant while oxidizing food materials in the tricarboxylic acid (TCA) cycle. In this cycle, oxalosuccinic acid is formed as an intermediate that bears three carboxyl groups and one carbonyl group. However, as the carbonyl group is at the &#42933;-position to only one carboxyl group, only one of the three carboxyl groups undergoes decarboxylation to produce &#945;-ketoglutaric acid by losing CO2.
<img alt="Figure3" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_3.svg" style="text-align: center; height: 128px;" />

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &amp;#946;-Ketoacids

Perdita del gruppo carbossilante come CO2: decarbossilazione dei β-chetoacidi

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation ...

Enzimatica decarbossilazione Luce-driven

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