Kavernöz Sinir Yaralanmalı Sıçan Modelinde İntrakavernöz Basınç Kaydı

Bu protokol, erektil disfonksiyon ve intrakavernöz basınç ölçümü ile ilişkili radikal prostatektominin stabil bir bilateral kavernöz sinir yaralanması sıçan modelinin geliştirilmesini tanımlar.

Bilateral kavernöz sinir (CN) yaralanması sıçan modeli, klinik terapötik yöntemlerin etkisini değerlendirmek için erektil disfonksiyon (ED) ile ilişkili klinik kavernöz sinir hasarını simüle etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, CN yaralanma modeli oluşturma yöntemleri, ED araştırma alanında kusurlu ve çeşitlidir. Son yıllarda en sık kullanılan yöntem CN ezilme yaralanmasıdır. Bu çalışma, güvenilir ve tekrarlanabilir bir CN yaralanması sıçan modeli sağlayarak, bilateral CN yaralanması sıçan modeli yapımı ve intrakavernöz basınç (ICP) kaydının ölçülmesi prosedürünün ayrıntılı bir tanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Bu çalışma, sert destek olarak bir şırınga iğnesi ve kauçuk manşonlu bir hemostat kullanarak hemostat ezilme yaralanmasının CN yaralanma yöntemini başarıyla geliştirdi. Ayrıca, bu yöntem, 1.0 V'luk bir voltaj, 20 Hz'lik bir frekans ve 5 ms'lik darbe genişliğinin, iki taraflı bir CN yaralanması sıçan modelinde ICP kaydı için optimize edilmiş stimülasyon parametreleri olduğu sonucuna varmıştır.

ED, erişkin erkeklerde sık görülen hastalıklardan biridir. Dünyadaki acil servis hastalarının sayısının 2025 yılına kadar 322 milyona ulaşacağı tahmin edilmektedir¹. Çin'de yapılan çok merkezli kapsamlı bir örneklem araştırması, pelvik cerrahi veya travmanın neden olduğu ED oranının yaklaşık %8 olduğunu ^{göstermektedir2}. Cerrahi tekniklerin ve cerrahi aletlerin sürekli gelişmesine rağmen, ED insidansı hala yüksektir. Sinir koruyucu radikal prostatektomi (RP) sonrası ED gelişimi ve ilerlemesinin, korpus kavernozum düz kas atrofisi, endotel hücrelerinin apoptozu ve patolojik yeniden şekillenme ile sonuçlanan kavernöz sinir hasarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir ^3,4.

ED ile ilişkili CN hasarının hemodinamik mekanizmasını ve histopatoloji değişikliklerini incelemek için, kemirgen, köpek, kedi ve maymun^dahil olmak üzere birkaç farklı CN yaralanması hayvan modeli geliştirilmiş ve değerlendirilmiştir ^5,6,7. Harcama ve tekrarlanabilirlikteki avantajlara dayanarak, bilateral CN yaralanmalı sıçan modeli, radikal pelvik cerrahi sonrası ED'yi değerlendirmek için en yaygın model haline gelmiştir⁸. Bununla birlikte, çok sayıda literatürde sinir yaralanması yaklaşımları (ezilme, dondurma, transeksiyon ve eksizyon) temel farklılıkları olan çeşitli sinir yaralanması formları bildirilmiştir9,10,11. Ayrıca, sinir yaralanması yaklaşımlarının çeşitliliği, sıçan modelinde intrakavernöz basınç (ICP) kayıt parametrelerinde tutarsızlığa yol açabilir ve bu da ICP^8'in doğruluğunu ve değerlendirmesini belirler. Bununla birlikte, sinir yaralanmasını indüklemek ve modelin ICP'sini kaydetmek için henüz standart bir yöntem yoktur.

Bu nedenle, bu çalışma daha güvenilir ve tekrarlanabilir bir bilateral CN yaralanması sıçan modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, ED mekanizmalarını incelemek ve gelecekte etkili tedaviler geliştirmek için faydalı olabilecek model oluşturma ve ICP ölçümü prosedürünün ayrıntılı bir tanımını sağlar.

Bu çalışmada ağırlıkları 300-350 g arasında değişen on beş yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçan (3 aylık) kullanıldı. Tüm hayvan prosedürleri, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak ve Sun Yat-Sen Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin beşinci bağlı hastanesinin onayı ile gerçekleştirildi. Hayvanlar, sıcaklık ve ışık kontrollü konforlu bir tesiste barındırıldı.

1. Cerrahi işlem malzemeleri için hazırlık

1. Aşağıdaki aletleri hazırlayın: neşter, doku makası, iplik makası, bükme forsepsleri, doku forsepsleri, mikrocerrahi forsepsleri, Hartman sivrisinek hemostatik forsepsleri, steril cerrahi çarşaflar, mikroiğne tutucu, sıçan abdominal ekartörleri ve biyolojik sinyal toplama ve işleme sistemi (bkz.
   1. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri sterilize edin. Ameliyat bölgesini temizlemek için alkollü (%70 etanol) mendil kullanın.
      NOT: Cerrahi aletler gece boyunca alkole daldırılarak sterilize edilmelidir.
2. Basınç kayıt sistemini hazırlayın
   1. Heparin salin ve hipodermik 25 G iğne içeren 10 mL'lik bir şırıngayı, tüplü (20 cm uzunluğunda) 3 bir musluka bağlayın. Sterilize edilmiş tüpü steril heparin salin (200 U / mL) ile yıkayın.
      NOT: Tüpün heparin salin ile doldurulması, sisteme hava kabarcıklarının girmesini önler.
3. 25 G'lik iğneyi hayvan ameliyat pedinin 20 cm (sadece tüp uzunluğu) üzerine kaldırın. Ardından, yıkama veya vurma yoluyla basınç kayıt sisteminin ölçüm doğruluğunu inceleyin.

2. Hayvanın hazırlanması

1. Sodyum pentobarbital (60 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyon ile sıçanları uyuşturun (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Yeterli anestezi derinliğini doğrulamak için, spontan solunum ritminin ve bir sıçanın reflekslerinin arka pençeyi sıkıştırarak değerlendirilmesi yapıldı.
2. Kornea kuruluğunu önlemek için iki taraflı gözlere merhem sürün.
3. Uygun bir anesteziyi onayladıktan sonra, elektrikli bir tıraş makinesi kullanarak karın, boynun ve perinenin alt yarısını tıraş edin. Fareyi bir ısıtma yastığı (37 °C) üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Cerrahi prosedürler sırasında steril koşulları korumak için tıbbi eldiven giyin.

3. CN izolasyonu ve yaralanma prosedürü

1. Alt, orta hat karın bölgesindeki deriden 4 cm'lik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Mesaneyi ve prostatı tamamen ortaya çıkarmak için, deri altı fasya, kas dokusu ve periton boyunca uygun uzunlukta bir kesi yapmak için doku makası ve doku forseps kullanın.
2. Operatif alan haritasını büyütmek için bir sıçan abdominal ekartör kullanın. Prostatı bağlar gibi bitişik dokulardan ayırmak için emici pamuklu çubuklar kullanın.
   NOT: Majör pelvik ganglion (MPG) ve CN, prostatın dorsolateral iki bölgesinden birinde bulunabilir.
3. MPG'nin 1-6 mm distalinde CN'nin üzerindeki fasyayı kesmek için açılı mikro makas kullanın. Daha sonra mikrocerrahi forseps kullanarak CN'nin altına 9-0'lık bir sütür kaydırın.
4. CN'nin altına, MPG'nin 25 mm distalinde bir şırınga iğnesi (5 G) yerleştirin. Daha sonra kanama durdurucuyu "hemostat ucu-şırınga iğne-sinir-hemostat ucu" sandviç yapısının ışığına koyun (Şekil 1 ve Şekil 2).
   NOT: Şırınga iğnesinin düz bir şekilde taşlanması gerekir.
5. Kanama durdurucuyu gangliondan 5 mm distalde tam uç kapanması ile 1 dakika boyunca uygulayın, ardından kanama durdurucu ve şırınga iğnesini geri çekin (Şekil 2).
6. 9-0'lık bir sütürle siniri hafifçe kaldırın ve bipolar elektrotun kancalarını (Malzeme Tablosuna bakınız) MPG'nin 2-4 mm distalindeki CN'nin etrafına yerleştirin (Şekil 3).
   NOT: İki çift MPG ve CN aynı şekilde çalıştırıldı.

4. Korpus kavernozumun kateterizasyonu ve ICP ölçümü için CN'nin uyarılması

1. Tüpü korpus kavernozuma sokmadan önce steril heparin salin (200 U / mL) ile yıkayın.
2. 25 G iğneyi tutun ve yerleştirme yönünü korpus kavernozumun seyri ile paralel tutun (Şekil 3).
   NOT: Tunika albuginea, yerleştirmeyi kolaylaştırmak için gerilmelidir.
3. 25 G iğneyi korpus kavernozumun içine 6 mm itin (Şekil 3). Dönüştürücünün hassasiyetini değerlendirmek için tüpü yıkayın ve korpus kavernozuma hafifçe bastırın (Şekil 4). Kazara düşmeyi önlemek için boruyu yapışkan bantla çalışma masasına sabitleyin.
4. CN stimülasyonu için aşağıdaki parametreleri kullanın: 1.0 V'ta voltaj, 20 Hz'de frekans, 5 ms'de darbe genişliği. Aşağıdaki stimülasyon arasında 5 dakika dinlenme ile 1 dakika stimülasyon uygulayın.
   NOT: Ölçümü başlatırken 3 vanayı basınç dönüştürücü kanalına çevirin.

5. Ameliyat Sonrası Bakım

1. Fareleri ısıtılmış bir ped (37 ° C) üzerine yerleştirin ve anestezi iyileşmesi için dikkatlice izleyin.
2. Postoperatif ağrı kontrolü için, sıçanlar tamamen iyileştiğinde steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (Carprofen, 0.5 mg / kg, deri altı enjeksiyon gibi) sağlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Fareleri aseptik kafese taşıyın ve insizyonel yaranın beslenme durumunu, zihinsel durumunu ve enfeksiyonunu değerlendirmek için 2 gün izleyin.

Cerrahi prosedür, önerilen stimülasyon ayarlarıyla bu protokolü kullanarak tipik bir ICP yanıt eğrisi üretti. ICP yanıt eğrisi, sinir uyarılırken anında yükselir ve stimülasyon geri çekildiğinde düşer (Şekil 5). Artan ICP değerlerinin değerlendirilmesini etkileyen ICP'yi ölçmeden önce intrakavernöz basınç çizgisinin incelenmesi önemlidir (Şekil 4).

Şekil 6'da gösterildiği gibi, normal sıçanlarda (kavernöz sinir hasarı olmadan) voltaj 1.0 V'un üzerinde olduğunda pik ICP ile ICP platosu arasında önemli bir fark yoktur. Bununla birlikte, kavernöz sinir yaralanmasından sonra 1.0 V'un üzerine çıkan stimülasyon voltajı ile pik ICP ve ICP platosu artar (Şekil 7). ICP ölçümü, CN ezilmesini takiben operasyon öncesi, 0, 7 ve 28. günlerde değerlendirildi. Ameliyat sonrası 0 gün ile 7 veya 28 gün arasında ICP'de anlamlı bir fark vardı, ancak 7 gün ile 28 gün arasında istatistiksel bir fark yoktu (Şekil 8). Mevcut yöntemi takip eden CN yaralanma sıçan modelinin güvenilir olduğunu gösterir.

Şekil 1: Hemostat ezilme yaralanması aletleri. (A, B) Lastik kılıflı kanama durdurucu. (C-E) "Hemostat ucu-şırınga iğne-sinir-hemostat ucu" nun simülatif yapısı gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kavernöz sinir yaralanması prosedürü. (A) MPG ve CN'nin anatomik yapısı (kırmızı çizgi ile işaretlenmiştir). (B) CN'nin altına belirli bir açıyla (kırmızı ok) bir şırınga iğnesi yerleştirmek. (C) Yaralanma gerçekleştirmek için CN'ye bir hemostat uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Korpus kavernozumun kateterizasyonu ve sinirin kancalanması. (A) Kateterize edilirken 25 G iğne korpus kavernozumun seyri ile paraleldi. (B) 25 G iğneyi korpus kavernozumun içine itmek. (C) Sinirin bipolar elektrotun kancalarına yerleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İntrakavernöz basınç çizgisinin incelenmesi. Hassas yanıt eğrisi, 23 G iğnenin intrakavernöz doğru pozisyonda olduğunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Normal sıçanların tipik ICP yanıt eğrisi. CN'yi uyarmaya başladığınızda, ICP hızla yükselir ve bir platoya girer. ICP, stimülasyon olmadan taban çizgisine düştü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Kavernöz sinir hasarı olmadan voltaj gradyan stimülasyonunun ICP üzerindeki etkisi. 1.0 V'un üzerinde artan stimülasyon voltajı ile, tepe ICP ve ICP platosu artmaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Gerçek zamanlı kavernöz sinir hasarı ile ICP'de voltaj gradyanı stimülasyonu. 1 V'un üzerinde artan stimülasyon voltajı ile, tepe ICP ve ICP platosu artar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Ameliyat sonrası farklı zamanlarda ICP ölçümü. ICP azalır, 28 güne kadar daha düşük bir ICP seviyesini korur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ED, pelvik cerrahi veya travmanın ciddi bir komplikasyonudur. Sinir koruyucu bir ameliyat geçirmesine rağmen, radikal prostatektomide (RP) ED görülme oranı yaklaşık %14-90'dır12. Yaralanma CN'nin sorunlu rejenerasyonu nedeniyle, klinik iyileştirici etki tatmin edici olmaktan daha azdır. Bu nedenle, ED tedavilerini araştırmak için stabil bir CN yaralanması hayvan modeli gereklidir. Quinlan ve ark. ilk olarak RP ile ilişkili ED¹³ çalışması için CN yaralanma sıçan modelini bildirmiştir. Çeşitli çalışmalar, CN ^{8,14,15,16,17'nin} transeksiyonu, eksizyonu, ezilmesi ve dondurulması dahil olmak üzere Quinlan modeline dayalı CN yaralanma sıçan modelleri geliştirmiştir. Her yaralanma türü, belirli bir deney tasarımı için tek taraflı veya iki taraflı olarak gerçekleştirilebilir.

En az ciddi yaralanma derecesine rağmen, ezilme tipi CN'nin perilemma epineuriumunu rezerve edebilir. Bilateral CN ezilme yaralanması, sinir koruyucu RP ^18,19'a en iyi benzetmedir. Bununla birlikte, mevcut çalışmada bildirilen CN ezilme yaralanması yöntemleriyle ilgili bazı sorunlar vardır. Yeterli derecede yaralanma olmaması ve birden fazla yaralanma modelin uygulanmasını sınırlar. Yeterli dereceye sahip tek noktalı bir yaralanma modeli, temel araştırmalarda benzersiz bir avantaja sahiptir. Bu nedenle, RP ile ilişkili ED'nin daha stabil bir bilateral CN yaralanması sıçan modeli geliştirdik.

CN, ince boyutu nedeniyle nörotimeze yatkındır. Bu çalışmada ilk olarak, yeterli yaralanma derecesini sağlamak ve sinir transeksiyonunu önlemek için, sert destek olarak bir şırınga iğnesi ve lastik manşonlu bir hemostat kullanarak bir ameliyat becerisi önerilmiştir. Bununla birlikte, farklı sıkıştırma kuvvetleri ve süreleri, model yapımının başarı oranını etkileyen yaralanma derecesini belirleyecektir. Mevcut çalışmada, ganglionun 5 mm distalinde 1 dakika süreyle tam uç kapanması olan bir kanama durdurucunun uygulanması en uygun ameliyat modu olabilir.

Modelin stabilitesini ve güvenilirliğini değerlendirmek için, CN ezilmesini takiben 0, 7 ve 28. günlerde erektil fonksiyon iyileşmesi değerlendirildi. ICP'nin 0 gün ile 7 veya 28 gün arasında anlamlı bir fark olduğu bulundu; ancak 7 gün ile 28 gün arasındaki ICP değerleri arasında anlamlı bir fark yoktu. Erektil fonksiyonun kademeli olarak dejenere olduğunu ve 28 güne kadar daha düşük bir ICP seviyesini koruduğunu gösterir. Bu, Bilateral CN ezilme yaralanması sıçan modelinin bir aylık bir deney tasarımı için uygun olduğunu göstermektedir.

Çalışmalarda CN stimülasyon voltajı, 1.0 ila 12 V arasında değişen genel bir anlaşmaya sahip değildir. İlk olarak, normal sıçanlarda voltaj gradyan stimülasyonunun ICP üzerindeki etkisi araştırıldı. 1.0 V'un üzerinde artan stimülasyon voltajı ile, tepe ICP ve ICP platosu yükselmez. Elde ettiğimiz sonuç, Hox, M. ve arkadaşlarının²⁰. Bu fenomen, sinir yoluyla iletilen akımın eşiğin üzerinde olduğunu ve refleksi tetiklemek için yeterli olduğunu ve bunun da tam bir fizyolojik tepkiye yol açtığını göstermektedir. Yaralandıktan sonra, CN anında gradyan voltajı ile uyarıldı ve ICP kaydedildi. 1.0 V ile karşılaştırıldığında, 1 V'un üzerinde artan stimülasyon voltajı ile pik ICP ve ICP platosu artar. Daha yüksek bir stimülasyon voltajı kullanmak "yanlış pozitif" bir ICP yanıt eğrisine yol açabilir. Genel olarak, bilateral CN yaralanmalı sıçan modelinde ICP kaydı için stimülasyon parametreleri olarak 1.0 V'luk bir voltaj, 20 Hz'lik bir frekans ve 5 ms'lik bir darbe genişliği kullanılması önerilir.

Diğer hayvan modellerinde olduğu gibi, mevcut yöntemle bilateral CN yaralanması sıçan modeli de klinik hastalarla karşılaştırıldığında bazı sınırlamalara sahiptir. Periferik sinir sisteminin daha iyi rejeneratif yeteneğine sahip sıçan modeli, sinir rejenerasyonu ve iyileşmesinin değerlendirilmesini etkileyebilir. Buna karşılık, mevcut çalışmada kabul edilebilir bir araştırma yöntemi sunmaktadır. Bu nedenle, klinik tedavide başarı dönüşümüne katkıda bulunan daha stabil bir bilateral CN yaralanması sıçan modeli oluşturmak gereklidir.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe NO. 82071636) tarafından desteklenmiştir.