تسجيل الضغط داخل الكهف في نموذج فأر إصابة العصب الكهفي

يصف هذا البروتوكول تطوير نموذج فئران مستقر لإصابة الأعصاب الكهفية الثنائية لاستئصال البروستاتا الجذري المرتبط بضعف الانتصاب وقياس الضغط داخل الكهف.

تم استخدام نموذج الفئران لإصابة العصب الكهفي الثنائي (CN) على نطاق واسع لمحاكاة إصابة الأعصاب الكهفية السريرية المرتبطة بضعف الانتصاب (ED) لتقييم تأثير الأساليب العلاجية السريرية. ومع ذلك ، فإن طرق بناء نموذج إصابة CN معيبة ومتنوعة في مجال أبحاث الضعف الجنسي. إن إصابة سحق CN هي الطريقة الأكثر استخداما في السنوات الأخيرة. تهدف هذه الدراسة إلى تقديم وصف مفصل لإجراء بناء نموذج الفئران الثنائي لإصابة CN وقياس تسجيل الضغط داخل الكهف (ICP) ، مما يوفر نموذجا موثوقا به وقابلا للتكرار لإصابة CN. نجح هذا العمل في تطوير طريقة إصابة CN لإصابة سحق الإرقاء باستخدام إبرة حقنة كدعم صلب وتمستر بغلاف مطاطي. أيضا ، تخلص هذه الطريقة إلى أن الجهد 1.0 فولت ، وتردد 20 هرتز ، وعرض النبضة البالغ 5 مللي ثانية هي معلمات التحفيز المحسنة لتسجيل برنامج المقارنات الدولية في نموذج فئران إصابة CN الثنائي.

الضعف الجنسي هو أحد الأمراض الشائعة لدى الرجال البالغين. تشير التقديرات إلى أن عدد مرضى الضعف الجنسي في العالم سيصل إلى 322 مليون بحلول عام 2025¹. تظهر دراسة استقصائية واسعة للعينات متعددة المراكز في الصين أن نسبة الضعف الجنسي الناجم عن جراحة الحوض أو الصدمة تبلغ حوالي 8٪ ². على الرغم من التحسين المستمر للتقنيات الجراحية والأدوات الجراحية ، إلا أن معدل الإصابة بالضعف الجنسي لا يزال مرتفعا. لقد تم اعتبار أن تطور وتطور الضعف الجنسي بعد استئصال البروستاتا الجذري الذي يحافظ على الأعصاب (RP) يساهم في إصابة الأعصاب الكهفية مما يؤدي إلى ضمور العضلات الملساء الكهفية ، وموت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية ، وإعادة التشكيل المرضي^3،4.

لدراسة آلية ديناميكا الدم والتغيرات النسيجية المرضية لإصابة CN المرتبطة بالضعف الجنسي ، تم تطوير وتقييم عدة أنواع مختلفة من نماذج إصابة CN ، بما في ذلك القوارض والقطط^5،6،7. بالاعتماد على المزايا في الإنفاق وقابلية التكاثر ، أصبح نموذج الفئران الثنائي CN هو النموذج الأكثر شيوعا لتقييم الضعف الجنسي بعد جراحة الحوض الجذرية⁸. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أشكال مختلفة من إصابة الأعصاب في العديد من الأدبيات التي تتمثل اختلافاتها الرئيسية في مناهج إصابة الأعصاب (السحق والتجميد والقطع والاستئصال) ^9،10،11. علاوة على ذلك ، قد يؤدي تنوع مناهج إصابة الأعصاب إلى عدم الاتساق في معلمات تسجيل الضغط داخل الكهف (ICP) في نموذج الفئران ، والذي يحدد دقة وتقييم برنامج المقارنات الدولية⁸. ومع ذلك ، لا توجد طريقة موحدة لإحداث إصابة الأعصاب وتسجيل برنامج المقارنات الدولية للنموذج حتى الآن.

لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى بناء نموذج فئران إصابة CN ثنائي أكثر موثوقية وقابلية للتكرار. توفر هذه الطريقة وصفا تفصيليا لإجراء بناء النموذج وقياس برنامج المقارنات الدولية ، والذي قد يكون مفيدا لدراسة آليات الضعف الجنسي وتطوير علاجات فعالة في المستقبل.

تم استخدام خمسة عشر فأرا بالغا من ذكور Sprague-Dawley (3 أشهر) يتراوح وزنهم بين 300-350 جراما في هذه الدراسة. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وبموافقة المستشفى الخامس التابع للجنة رعاية واستخدام المؤسسي بجامعة صن يات صين. تم إيواء في منشأة مريحة مع التحكم في درجة الحرارة والضوء.

1. التحضير لمواد الإجراءات الجراحية

1. قم بإعداد الأدوات التالية: مشرط ، مقص مناديل ، مقص خيوط ، ملقط ثني ، ملقط أنسجة ، ملقط الجراحة المجهرية ، ملقط مرقئ للبعوض هارتمان ، صفائح جراحية معقمة ، حامل إبرة دقيقة ، مباعد بطن الفئران ، ونظام الحصول على الإشارات البيولوجية ومعالجتها (انظر جدول المواد).
   1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل العملية. استخدم مناديل الكحول (70٪ الإيثانول) لتنظيف منطقة الجراحة.
      ملاحظة: يجب تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق الغمر بالكحول طوال الليل.
2. تحضير نظام تسجيل الضغط
   1. قم بتوصيل حقنة سعة 10 مل تحتوي على محلول ملحي من الهيبارين وإبرة تحت الجلد 25 جم بمحبس ثلاثي الاتجاهات بأنبوب (بطول 20 سم). اغسل الأنبوب المعقم بمحلول ملحي معقم من الهيبارين (200 وحدة / مل).
      ملاحظة: يؤدي ملء الأنبوب بمحلول الهيبارين الملحي إلى تجنب إدخال فقاعات الهواء في النظام.
3. ارفع الإبرة 25 جم 20 سم (طول الأنبوب فقط) فوق وسادة تشغيل. ثم افحص دقة قياس نظام تسجيل الضغط عن طريق التنظيف أو التنصت.

2. تحضير

1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق (60 مجم / كجم) الصوديوم (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: للتأكد من عمق التخدير الكافي ، تم إجراء تقييم لإيقاع التنفس التلقائي وردود أفعال الفئران عن طريق قرص المخلب الخلفي.
2. ضعي المرهم على العينين لتجنب جفاف القرنية.
3. بعد التأكد من التخدير المناسب ، احلق النصف السفلي من البطن والرقبة والعجان باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. ضع الجرذ في وضع ضعيف على وسادة تسخين (37 درجة مئوية). ارتد قفازات طبية للحفاظ على ظروف معقمة أثناء العمليات الجراحية.

3. إجراء عزل وإصابة CN

1. استخدم مشرطا لعمل شق بطول 4 سم عبر الجلد في أسفل خط البطن الوسطي. لكشف المثانة والبروستاتا بالكامل ، استخدم مقص الأنسجة وملقط الأنسجة لعمل شق بطول مناسب من خلال اللفافة تحت الجلد والأنسجة العضلية والصفاق.
2. استخدم ضام بطن الفئران لتكبير الخريطة الميدانية الجراحية. استخدم مسحات قطنية ماصة لفصل البروستاتا عن الأنسجة المجاورة ، مثل الأربطة.
   ملاحظة: يمكن العثور على العقدة الحوضية الرئيسية (MPG) و CN في واحدة من منطقتين ظهريتين من البروستاتا.
3. استخدم مقصا صغيرا بزاوية لشق اللفافة التي تعلوها CN 1-6 مم بعيدة إلى ميلا في الغالون. ثم حرك خياطة 9-0 تحت CN باستخدام ملقط الجراحة المجهرية.
4. ضع إبرة حقنة (25 جم) أسفل CN ، 5 مم بعيدة إلى ميلا في الغالون. ثم ضع الإرقاء في ضوء هيكل شطيرة "طرف المحرقة - طرف الإبرة - العصب - الإرقاء" (الشكل 1 والشكل 2).
   ملاحظة: يجب أن تكون إبرة الحقنة مطحونة بشكل مسطح.
5. ضع الإرقاء مع إغلاق كامل الطرف عند 5 مم بعيدا عن العقدة لمدة 1 دقيقة ، ثم اسحب الإرقاء وإبرة المحقنة (الشكل 2).
6. ارفع العصب قليلا عن طريق خياطة 9-0 ، وضع خطافات القطب ثنائي القطب (انظر جدول المواد) حول CN 2-4 مم بعيدا إلى MPG (الشكل 3).
   ملاحظة: تم تشغيل زوجين من MPG و CN بنفس الطريقة.

4. قسطرة الجسم الكهفي وتحفيز CN لقياس برنامج المقارنات الدولية

1. اغسل الأنبوب بمحلول ملحي معقم من الهيبارين (200 وحدة / مل) قبل إدخاله في الجسم الكهفي.
2. أمسك إبرة 25 G وحافظ على اتجاه الإدخال موازيا لمسار الجسم الكهفي (الشكل 3).
   ملاحظة: يجب شد الغلالة البيضاء لتسهيل الإدخال.
3. ادفع الإبرة 25 جم 6 مم في الجسم الكهفي (الشكل 3). اغسل الأنبوب واضغط على الجسم الكهفي برفق لتقييم حساسية محول الطاقة (الشكل 4). لمنع السقوط العرضي ، قم بتثبيت الأنبوب على طاولة العمل بشريط لاصق.
4. استخدم المعلمات التالية لتحفيز CN: الجهد عند 1.0 فولت ، التردد عند 20 هرتز ، عرض النبضة عند 5 مللي ثانية. ضع دقيقة واحدة من التحفيز مع 5 دقائق من الراحة بين التحفيز التالي.
   ملاحظة: أدر محبس 3 اتجاهات إلى قناة محول الضغط عند بدء القياس.

5. رعاية ما بعد الجراحة

1. ضع الفئران على وسادة دافئة (37 درجة مئوية) وراقبها بعناية لاستعادة التخدير.
2. للسيطرة على الألم بعد الجراحة ، قم بتوفير الأدوية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (مثل كاربروفين ، 0.5 مجم / كجم ، الحقن تحت الجلد) (انظر جدول المواد) عندما تتعافى الفئران تماما.
3. انقل الفئران إلى القفص المعقم وراقبها 2 أيام لتقييم حالة تغذية الجرح الجراحي والحالة العقلية والعدوى.

أنتج إجراء الجراحة منحنى استجابة ICP نموذجي باستخدام هذا البروتوكول مع إعدادات التحفيز الموصى بها. يرتفع منحنى استجابة برنامج المقارنات الدولية على الفور عند تحفيز العصب وينخفض عند سحب التحفيز (الشكل 5). من الضروري فحص خط الضغط داخل الكهف قبل قياس برنامج المقارنات الدولية ، مما يؤثر على تقييم قيم برنامج المقارنات الدولية المتزايدة (الشكل 4).

كما هو موضح في الشكل 6 ، لا يوجد فرق كبير بين ذروة برنامج المقارنات الدولية وهضبة برنامج المقارنات الدولية عندما يكون الجهد أعلى من 1.0 فولت على الفئران العادية (بدون إصابة الأعصاب الكهفية). ومع ذلك ، تزداد ذروة برنامج المقارنات الدولية وهضبة برنامج المقارنات الدولية مع زيادة جهد التحفيز فوق 1.0 فولت بعد إصابة العصب الكهفي (الشكل 7). تم تقييم قياس برنامج المقارنات الدولية قبل العملية ، 0 و 7 و 28 يوما بعد سحق CN. كان هناك فرق يعتد به في برنامج المقارنات الدولية بين 0 أيام و 7 أو 28 يوما بعد العملية ، ولكن لم يكن هناك فرق إحصائي بين 7 أيام و 28 يوما (الشكل 8). يشير إلى أن نموذج الفئران المصاب CN الذي يتبع الطريقة الحالية موثوق به.

الشكل 1: أدوات إصابة سحق الإرقاق. (أ ، ب) المرقئ بغلاف مطاطي. (C-E) يظهر الهيكل المحاكي ل "طرف المحرقة - طرف المحقنة - إبرة العصب - الإرقاء". الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إجراء إصابة الأعصاب الكهفية. (أ) التركيب التشريحي ل MPG و CN (مميز بخط أحمر). (ب) وضع إبرة حقنة تحت CN بزاوية معينة (سهم أحمر). (ج) تم تطبيق hemostat على CN لأداء الإصابة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: قسطرة الجسم الكهفي وربط العصب. (أ) كانت إبرة 25 G موازية لمسار الجسم الكهفي عند القسطرة. (ب) دفع إبرة 25 جم إلى الجسم الكهفي. (ج) وضع العصب على خطافات القطب ثنائي القطب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: فحص خط الضغط داخل الكهف. يشير منحنى الاستجابة الحساسة إلى أن إبرة 23 G في الموضع الصحيح داخل الكهف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: منحنى استجابة برنامج المقارنات الدولية النموذجي للفئران العادية. عند البدء في تحفيز CN ، يرتفع برنامج المقارنات الدولية بسرعة ويدخل في هضبة. انخفض برنامج المقارنات الدولية إلى خط الأساس دون تحفيز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تأثير تحفيز تدرج الجهد على برنامج المقارنات الدولية دون إصابة العصب الكهفي. مع زيادة جهد التحفيز فوق 1.0 فولت ، لا تزداد ذروة برنامج المقارنات الدولية وهضبة برنامج المقارنات الدولية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: تحفيز تدرج الجهد على برنامج المقارنات الدولية مع إصابة العصب الكهفي في الوقت الفعلي. مع زيادة جهد التحفيز فوق 1 فولت ، تزداد ذروة برنامج المقارنات الدولية وهضبة برنامج المقارنات الدولية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: قياس برنامج المقارنات الدولية في أوقات مختلفة بعد العملية. يحافظ انخفاض برنامج المقارنات الدولية على مستوى أقل من برنامج المقارنات الدولية حتى 28 يوما. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الضعف الجنسي هو أحد المضاعفات الشديدة لجراحة الحوض أو الصدمة. على الرغم من خضوعه لعملية تجنيب الأعصاب ، فإن معدل حدوث الضعف الجنسي يبلغ حوالي 14-90٪ في استئصال البروستاتا ^{الجذري (RP) 12}. بسبب التجديد الإشكالي للإصابة CN ، يكون التأثير العلاجي السريري أقل من مرض. وبالتالي ، فإن نموذج إصابة CN المستقر لاستكشاف علاجات الضعف الجنسي أمر ضروري. أبلغ Quinlan et al. لأول مرة عن نموذج الفئران لإصابة CN لدراسة ED¹³ المرتبط ب RP. طورت العديد من الدراسات نماذج فئران إصابة CN بناء على نموذج Quinlan ، بما في ذلك القطع ، والاستئصال ، والسحق ، وتجميد CN^{8،14،15،16،17}. يمكن إجراء كل نوع من أنواع الإصابات من جانب واحد أو ثنائي لتصميم تجربة معين.

على الرغم من أقل درجة من الإصابة ، يمكن لنوع السحق أن يحتفظ بالعصب المحيط في CN. إصابة سحق CN الثنائية هي أفضل تشبيه ل RP^18،19 الذي يحافظ على الأعصاب. ومع ذلك ، هناك بعض المشاكل في طرق إصابة سحق CN التي تم الإبلاغ عنها في الدراسة الحالية. عدم وجود درجة كافية من الإصابة والإصابات المتعددة تحد من تطبيق النموذج. يتمتع نموذج الإصابة أحادي النقطة بدرجة كافية بميزة لا مثيل لها في البحث الأساسي. لذلك ، قمنا بتطوير نموذج فئران إصابة CN الثنائي الأكثر استقرارا من الضعف الجنسي المرتبط ب RP.

CN عرضة للإصابة بالتهاب الأعصاب بسبب حجمه النحيف. اقترحت هذه الدراسة أولا مهارة تشغيل لضمان درجة الإصابة الكافية وتجنب قطع الأعصاب ، باستخدام إبرة حقنة كدعم صلب ومرق بغلاف مطاطي. ومع ذلك ، فإن قوى الضغط المختلفة وأوقات الضغط ستحدد درجة الإصابة التي تؤثر على معدل نجاح بناء النموذج. وجدت الدراسة الحالية أن تطبيق الإرقاء مع إغلاق كامل للطرف على بعد 5 مم من العقدة لمدة دقيقة واحدة قد يكون وضع التشغيل الأنسب.

لتقييم استقرار وموثوقية النموذج ، تم تقييم استعادة وظيفة الانتصاب في 0 و 7 و 28 يوما بعد سحق CN. وجد أن هناك فرقا كبيرا في برنامج المقارنات الدولية بين 0 أيام و 7 أو 28 يوما. ومع ذلك، لم يكن هناك فرق يعتد به بين قيم برنامج المقارنات الدولية لأيام 7 و28 يوما. يشير إلى أن وظيفة الانتصاب تتدهور تدريجيا ويبدو أنها تحافظ على مستوى أقل من برنامج المقارنات الدولية لمدة تصل إلى 28 يوما. يشير هذا إلى أن نموذج الفئران الثنائي CN المناسب لتصميم تجربة لمدة شهر واحد.

لا يحتوي جهد تحفيز CN في الدراسات على اتفاق عام ، والذي يتراوح من 1.0 إلى 12 فولت ، أولا ، تم استكشاف تأثير تحفيز تدرج الجهد على برنامج المقارنات الدولية في الفئران العادية. مع زيادة جهد التحفيز فوق 1.0 فولت ، لا ترتفع ذروة برنامج المقارنات الدولية وهضبة برنامج المقارنات الدولية. نتيجتنا متوافقة مع عمل Hox ، M. et al.²⁰. تشير هذه الظاهرة إلى أن التيار الذي يتم إجراؤه عبر العصب أعلى من العتبة وكاف لتحفيز المنعكس مما يؤدي إلى استجابة فسيولوجية كاملة. بعد الإصابة ، تم تحفيز CN على الفور بواسطة جهد التدرج ، وتم تسجيل برنامج المقارنات الدولية. بالمقارنة مع 1.0 فولت ، تزداد ذروة برنامج المقارنات الدولية وهضبة برنامج المقارنات الدولية مع زيادة جهد التحفيز فوق 1 فولت. قد يؤدي استخدام جهد تحفيز أعلى إلى منحنى استجابة برنامج المقارنات الدولية "الإيجابي الكاذب". بشكل عام ، يوصى باستخدام جهد 1.0 فولت ، وتردد 20 هرتز ، وعرض نبضة 5 مللي ثانية كمعلمات تحفيز لتسجيل برنامج المقارنات الدولية في نموذج فأر إصابة CN الثنائي.

كما هو الحال مع النماذج الحيوانية الأخرى ، فإن نموذج الفئران الثنائي CN عبر الطريقة الحالية له أيضا بعض القيود مقارنة بالمرضى السريريين. قد يؤثر نموذج الفئران مع قدرة تجديدية أفضل للجهاز العصبي المحيطي على تقييم تجديد الأعصاب وتعافيها. في المقابل ، فإنه يوفر طريقة بحث مقبولة في الدراسة الحالية. لذلك ، من الضروري إنشاء نموذج فئران إصابة CN ثنائي أكثر استقرارا من الضعف الجنسي ، مما يساهم في تحول الإنجازات في العلاج السريري.

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82071636).