Наша лаборатория исследует пространственную и временную регуляцию циклического АМФ, чтобы понять, какие условия вызывают конкретные последующие события. Чтобы эффективно имитировать субклеточную активацию и ингибирование циклической передачи сигналов АМФ, мы охарактеризовали распространение оптогенетического инструмента, называемого bPAC-нанолюциферазой. Чтобы проверить достоверность современных моделей циклической передачи сигналов АМФ, мы разработали инструменты для оценки, имитации и блокирования циклической передачи сигналов АМФ из субклеточных компартментов в живых клетках.
Этот протокол может быть использован для стимуляции и оценки распространения и функционирования оптогенетических инструментов на систематической основе. Наша цель состояла в том, чтобы проверить, может ли процесс фокусного света точно активировать оптогенетические белки в определенных клеточных зонах, тем самым избегая воздействия на окружающие белки. Этот метод будет иметь жизненно важное значение для изучения белков с диффузным распределением или если предполагаемым эффектом является генерация локализованного увеличения циклического АМФ или других сигнальных молекул.
В оптогенетических экспериментах типичный подход включает в себя стимуляцию либо целого поля клеток, либо иногда небольших выделенных областей. Однако выбор этой области и интенсивности часто бывает произвольным. Наш систематический подход позволяет исследователям проводить более точные эксперименты, помогая имитировать паттерны сигнальных путей.
Для этого исследования использовались клетки, ко-трансфицированные с нацеленным на ядро циклическим сенсором АМФ и оптогенетическим белком, нацеленным на ядерную энергию, NLS-bPAC-нанолюциферазой. Культивируйте и манипулируйте клетками, экспрессирующими ядерный bPAC, в темной среде. Используйте красную лампу безопасного света, чтобы избежать воздействия длин волн менее 500 нанометров.
Проведите эксперименты с визуализацией на моторизованном двухдековом микроскопе, оснащенном мультисветодиодным световым модулем, колесом фильтра излучения, моторизованным XY-столиком, цифровой CMOS-камерой ORCA-Fusion и масляным объективом со 100-кратным увеличением и числовой апертурой 1,4. Для получения изображений используйте программное обеспечение для цифровой микроскопии. Эта установка способна одновременно стимулировать клетки и выполнять измерения FRET с помощью независимого светового тракта, оснащенного дихроичным фильтром ZT458rdc.
После включения геосистемы UGA-42 и лазеров LDI-7 включите микроскоп, чтобы настроить его соответствующим образом для сбора данных с помощью датчика H208 FRET. Затем последовательно откройте программное обеспечение для визуализации и программное обеспечение SysCon, которое управляет микроскопом. Чтобы откалибровать систему перед каждым использованием, перейдите в окно «Камера» и выберите вкладку «Калибровка».
Установите длину волны лазера, совместимую с оптогенетическим белком. Выбирайте 445 нанометров для стимуляции bPAC-нанолюциферазы. Выберите вкладку «Камера» и нажмите «Начать сбор», чтобы начать сбор данных с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
Снова выберите вкладку Калибровка. Нажмите кнопку «Начать калибровку». В появившемся выпадающем списке выберите подходящий режим калибровки.
Следуйте инструкциям по калибровке, указанным производителем. При необходимости измените настройки программного обеспечения для обработки изображений, чтобы выполнить правильную калибровку. Убедитесь, что калибровка выполнена на участке образца, свободном от клеток.
Затем, используя программное обеспечение для визуализации, получите одно флуоресцентное изображение. Флуоресцентные ячейки появятся в окне просмотра изображений. Расположите клетку, которая будет стимулироваться с помощью микроскопа, в пределах зоны воздействия, желательно в ее центре.
Прежде чем приступить к фактическому эксперименту, используйте режим «Щелчок и выстрел», чтобы быстро оценить реакцию отдельной ячейки. В окне «Временная шкала» настройте параметры стимуляции клеток, включая источник света, продолжительность и интенсивность стимула. В окне просмотра изображений щелкните примерно по центру ячейки и оцените реакцию.
В окне просмотра изображений выберите круглый значок на панели инструментов слева, а в выпадающем меню нажмите на «Заполнено», чтобы нарисовать заполненные круглые объекты стимуляции. Повторите этот шаг, чтобы создать несколько одинаковых кругов и распределить их равномерно, обеспечив однородное покрытие всей цитоплазмы стимулируемой клетки. В окне просмотра изображений щелкните значок указателя мыши слева, а затем щелкните правой кнопкой мыши один из объектов стимуляции, чтобы проверить и отредактировать его свойства.
Вы также можете выбрать все нарисованные объекты стимуляции, а затем щелкнуть правой кнопкой мыши, чтобы отредактировать свойства всех выбранных объектов стимуляции. В подокне Вид нажмите кнопку Привязка к сетке. Эта сетка может помочь сохранить равномерное расстояние и выравнивание окружностей для формирования правильной матрицы или массива.
Кроме того, настройте свойства сетки с помощью кнопки «Задать сетку». Равномерно распределите объекты стимуляции с помощью сетки. При необходимости добавьте больше объектов стимуляции, чтобы покрыть всю клетку.
Убедитесь, что все они обладают одинаковыми свойствами. Каждый объект стимуляции, ранее созданный в окне просмотра изображений, будет присутствовать в окне временной шкалы, где можно редактировать другой набор свойств, включая время начала, продолжительность, задержку, интенсивность и многое другое. Чтобы правильно визуализировать объекты стимуляции, сначала разверните окно «Временная шкала».
Теперь временные свойства объектов стимуляции можно увидеть в окне Временная шкала. Выберите все объекты стимуляции и отредактируйте их задержку и продолжительность в подокне «Время объекта». В подокне Источник света настройте длины волн и интенсивность объекта.
Обеспечьте одинаковую длину волны и интенсивность для всех. Чтобы предотвратить наложение эффекта двух или более стимулов, установите разное время начала для каждого объекта или варьируйте задержку между ними в зависимости от ожидаемого результата. Затем в окне «Временная шкала» измените последовательность, в которой при необходимости будет активирован каждый объект стимуляции.
Настройте последовательность стимуляций в регулярной или случайной последовательности в зависимости от эксперимента. После загрузки последовательности в систему настройте количество циклов или запусков последовательности, которые система будет выполнять в подокне Последовательность. Чтобы измерить изменения флуоресценции стимулируемой клетки, поместите интересующие области в программном обеспечении визуализации в нужные позиции.
Начните получать флуоресцентные изображения. Наконец, нажмите кнопку воспроизведения в окне UGA-42, чтобы начать стимуляцию клеток. Наблюдайте за реальными пучками стимуляции, которые также могут быть захвачены камерой, и их корреляцией с объектами стимуляции.
Обратите внимание на изменение интенсивности только зеленого следа, который показывает увеличение циклической концентрации АМФ, измеренной датчиком. Это происходит именно тогда, когда луч достигает части клетки с минимальным количеством bPAC-нанолюциферазы. Для определения положения ядра использовалась флуоресценция YFP H208.
Область интереса, охватывающая все ядро, была использована для измерения изменений отношения FRET сенсора H208 из-за стимуляции в указанных синих точках. Это показало, что временное увеличение циклического АМФ происходило только тогда, когда синий свет был направлен на области, содержащие bPAC-нанолюциферазу. Это подтвердило, что нацеленная на ядра bPAC-нанолюцифераза экспрессируется исключительно в ядерном компартменте клеток HC-1.
