Этот метод помогает понять фенотипические различия RP-клеток по всей сетчатке человека. Техника рассечения, разработанная Давиде Ортоланом, очень воспроизводима в создании отслоения между RP и сетчаткой. И программное обеспечение REShAPE действительно заметно при анализе больших изображений плоских креплений RP.
Метод, который разработал Давиде, может быть использован для изучения региональных различий в фенотипе РП у пациентов с различными типами дегенеративных заболеваний сетчатки. Для начала отрежьте 50-миллилитровую коническую трубку чуть ниже отметки в 5 миллилитров. С помощью горячего клея прикрепите наконечник трубки к дну весовой лодки.
Затем смешайте два компонента комплекта силиконовых эластомеров в соотношении 10 к 1, избегая захвата воздуха. Налейте смесь в весовую лодку, содержащую этот сферический кусок трубки с круглым дном. Отверните силикон при комнатной температуре на ночь.
Снимите весовую лодку и трубку с круглым дном из отвержденной силиконовой формы. Сначала заполните шприц объемом 1 миллилитр 1700 миллимолей раствора D-маннита и прикрепите его к игле 21-го калибра. Вставьте иглу через pars plana, чтобы избежать прокола передней камеры глаза и введите 400 микролитров раствора в стекловидное тело.
Оставьте глаз при комнатной температуре на 45 минут. С помощью пары мелких ножниц и щипцов разрежьте переднюю камеру на уровне pars plana. Заполните заднюю камеру глаза DPBS, содержащим кальций и магний.
Под стереомикроскопом локализуйте макулу, визуализируемую как желтое пятно на сетчатке. Разрезать глаз на квадранты, а именно носовые, височные, верхние и нижние, обеспечивая при этом сохранение макулярной области. Удалите иглы, если они мешают.
Перенесите бабочку в заднюю камеру глаза в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую DPBS с кальцием и магнием. Перед удалением сетчатки отметьте лепесток, содержащий макулу, сделав V-образный разрез в цилиарном крае. Поднимите и срежьте все стекловидное тело, которое лежит на сетчатке.
Вырежьте сетчатку от цилиарных краев во всех лепестках, чтобы не поцарапать RPE. Поместите ткань в 4% PFA и инкубируйте в течение одного часа. Трижды промыть DPBS, содержащим кальций и магний.
Переложите ткань в контейнер, наполненный таким же буфером, и храните его при 4 градусах Цельсия. Далее переложите образец на 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую DPBS с кальцием и магнием. Выбить головку зрительного нерва 1,5-миллиметровым ударом биопсии.
Соберите сетчатку и храните ее в том же буфере при 4 градусах Цельсия. Чтобы удалить склеру из сосудистой оболочки RPE, осторожно поднимите слой сосудистой оболочки RPE с периферии. Затем с помощью пары пружинных ножниц Vannas перережьте сосуды сосудистой оболочки и соединительную ткань, которые находятся между склерой и RPE.
После полного отделения от склеры соберите слой сосудистой оболочки RPE. Переложите ткань в контейнер, наполненный DPBS, содержащим кальций и магний, и храните его при 4 градусах Цельсия. Перенесите сосудистую оболочку РПЭ в одну лунку из шестилуночной пластины.
Блокируйте и пермеабилизируйте образец в течение одного часа при комнатной температуре. Инкубируют образец в течение одного часа при комнатной температуре с фаллоидином, сопряженным с флуорофором 647 при разведении от 1 до 250 в буфере пермеабилизации. Промыть три раза в DPBS, содержащих кальций и магний.
Перенесите образец сосудистой оболочки RPE на стеклянный слайд размером 50 x 75 миллиметров и сгладите его. Разрежьте каждый лепесток на две части, чтобы образец был более плоским. Нарисуйте контур плоского крепления гидрофобной ручкой.
Чтобы погасить автофлуоресценцию липофусцина, добавляют 500 микролитров раствора автофлуоресцентного гасителя и инкубируют при комнатной температуре в течение двух минут. Тщательно промыть в DPBS, содержащих кальций и магний. Извлеките DPBS и добавьте монтажный носитель.
Поместите покровное стекло на плоское крепление и запечатайте лаком для ногтей. Откройте программное обеспечение. На вкладке Каталоги выберите входные и выходные папки.
В выходном каталоге позвольте программному обеспечению автоматически изменить путь к входному каталогу или процессу. Кроме того, можно изменить выходной каталог вручную. Чтобы сгенерировать тепловые карты, выберите все из выпадающего меню на вкладке Создание цветных изображений.
Установите флажок нет в функции ограничения использования вручную, чтобы программное обеспечение использовало минимальные и максимальные значения, обнаруженные в каждом изображении. Установите флажок да, чтобы вручную настроить диапазон значений для каждой метрической тепловой карты фигуры. Затем нажмите на кнопку установить ограничения и вставьте значения в текстовые поля, чтобы выбрать диапазоны для отдельных параметров.
После изменения интересующих значений нажмите кнопку Сохранить. Нажмите на низкие значения по умолчанию, чтобы сбросить все ограничения. Чтобы выбрать пороговое значение размера ячейки при меньшем размере ячейки, вставьте размер самой маленькой ячейки, которая будет включена в анализ.
В поле Верхний размер ячейки вставьте размер самой большой ячейки, которая должна быть включена. При преобразовании пикселей в реальные единицы установите флажок нет, чтобы выполнить анализ в пиксельных единицах, проверьте да, чтобы выполнить анализ в микрометрах. В поле Длина пикселов шкалы введите значение пикселя в текстовом поле.
В длину шкалы бар микрон введите соответствующее расстояние в микрометрах. Чтобы начать анализ, нажмите кнопку Go for it. Этот протокол приводит к одноплокостному изображению плоского крепления, где местоположение ячейки идентифицируется с помощью сгенерированной REShAPE сегментации границ ячеек RPE.
Кроме того, 30 показателей формы, включая площадь отдельных клеток RPE, измеряются для каждой правильно идентифицированной ячейки RPE. Черные плитки, образовавшиеся в остатках сетчатки или других ярких объектов, можно удалить, выбрав один из вариантов фильтрации, доступных в раскрывающемся меню фильтра RT. Использование изображений RBG для анализа измененной формы приведет к созданию полностью черных двоичных изображений.
В этом случае при преобразовании RGB-изображений в оттенки серого будут получены правильно сегментированные двоичные изображения. Если окрашивание не является оптимальным или если образец поврежден царапиной, то большие скопления клеток могут быть идентифицированы как одна очень большая клетка. В этом случае крупные объекты могут быть исключены из анализа путем изменения порога размера ячейки.
Чтобы получить плоскую ткань, RP и сосудистую оболочку нужно отделить от склеры, даже если эти шаги могут занять много времени. После генерации плоского крепления RP можно окрашивать дополнительные маркеры RPE, чтобы можно было изучать различные области монослоя RP. Используя этот метод, мы обнаружили пять различных популяций RP, которые дифференциально чувствительны к различным дегенеративным заболеваниям сетчатки.
