Значение нашего метода заключается в его универсальности и потенции. Это позволяет исследователям иметь надежный контроль над эндогенной экспрессии генов таким образом, что были сложными для достижения с помощью существующих методов. Это позволяет исследователям исследовать функцию гена на различных уровнях экспрессии и в пространственно-временной манере.
Таким образом, это позволяет проверить обратимость фенотипа, который полезен при изучении генов, связанных с болезнями. Для выполнения репрессий, целевой ген intron разработан, чтобы содержать репрон R, который содержит 12 симметричных операторов Lac. Когда репрессор LacIGY выражается из желаемой ткани конкретного промоутера, целевой ген подавляется.
Репрессии в отношении гена-мишени могут быть обращены вспять или скорректированы до желаемого уровня экспрессии путем введения IPTG, антагониста репрессатора LacIGY. Для выполнения upregulation, целевой промоутер гена разработан, чтобы содержать четыре или более tat операторов, T, в качестве связывающих сайтов для активаторов rtTA-M2. Когда активатор выражается из желаемой ткани конкретных промоутер в присутствии доксициклина, upregulation целевого гена индуцируется.
Upregulation гена цели можно обратить вспять или отрегулировать к пожеланную уровень выражения путем снимать или изменять концентрацию доксициклина. Для выполнения как репрессий, так и активации могут быть объединены системы репрессатора Lac и Tat. Чтобы изменить ген, представляющий интерес для репрессий, транскрипционно инертный интрон к пяти основных концах гена интереса должны быть определены для вставки репронной последовательности.
Чтобы получить геномную последовательность для гена, представляющий интерес, перейдите в браузер генома UCSC и выберите последний проект генома мыши под вкладкой геномов. Введите имя или символ гена интереса в поле поиска, чтобы просмотреть стенограммы гена, а затем нажмите кнопку идти. Затем выберите желаемый вариант стенограммы для гена, представляющий интерес, и нажмите на символ гена рядом с вариантом интересной стенограммы.
Далее, под последовательностью и ссылками на инструменты и базы данных баннер, нажмите на ссылку геномной последовательности. Для вариантов области поиска последовательности выберите только экзоны, интроны и по умолчанию одну запись FASTA на ген. Для вариантов форматирования последовательности, выберите exons в верхнем случае, все остальное в нижнем случае и маска повторяется n.Then, нажмите представить.
Наконец, сохраните эту последовательность, сохранив форматирование верхнего и нижнего регистра в документе или программе, которые могут быть аннотированы. Чтобы избежать прерывания cpG островов, выберите шоу для cpG острова трек под выражением и регулирование баннера браузера генома UCSC и нажмите кнопку обновления. Масштабирование на пяти основных интронов, нажмите на каждом острове CpG показано зеленым цветом, и выберите вид ДНК для этой функции.
После выбора маски повторяется N, нажмите получить ДНК, чтобы получить последовательность островов CpG. Наконец, наложить эти последовательности с исходным файлом последовательности, и аннотировать их как intronic регионов, чтобы избежать. Чтобы избежать intronic регионов с усилителем подписей в тканях, представляющих интерес, перейдите на базу данных ENCODE и выберите значок экспериментов.
Для типа анализа выберите ChiP-seq или DNase-seq и заселите другие категории в соответствии с ячейками, которые должны быть спроектированы. После выбора функции выберите левую наиболее пиктограмму синим цветом, для которой отображается результат представления в списке. Затем выберите наборы данных для целей монометриляции h3k4, ацетилирования h3k27, DNase 1 и CTCF, которые наиболее тесно соответствовали ячейкам, которые должны быть спроектированы.
В каждом соответствующем наборе данных прокрутите раздел файла, убедитесь, что выбраны mm10 и UCSC, и нажмите кнопку визуализации. Теперь, в браузере генома UCSC, увеличьте масштаб пяти основных интронов и нажмите на каждый пик в аннотированных пиковых треках. Получите последовательность ДНК для каждой пиковой области, нажав на хромосомные координаты для каждого пика.
В меню высадки представления выберите ДНК и нажмите маску, чтобы N.Finally, наложить эти последовательности с исходным файлом последовательности и аннотировать их как intronic регионов, чтобы избежать. Чтобы определить sgRNA в остальных нетронных регионах с высокой специфичностью и прогнозируемыми показателями эффективности, перейдите на онлайн-инструмент проектирования sgRNA, такой как CRISPOR. Введите последовательность нетронной области интереса, укажите соответствующий эталонный геном и выберите нужный протопространственный смежный мотив.
Затем нажмите представить. Далее, сортировать предсказал sgRNA по специфике оценка и выбрать один или несколько sgRNA, которые также имеют высокий прогнозируемый балл эффективности. Наконец, дизайн шаблона ДНК, содержащего последовательность посадочной площадки PITT, окруженную с обеих сторон 60-базовыми гомологическими руками, которые соответствуют участку разреза sgRNA.
Для отмены целевых репрессий генов, управлять IPTG в питьевой воде гомозиготных выведенных мышей с модифицированным аллелью интереса путем полного растворения желаемого количества IPTG в стерильной дистиллированной воде в день введения. Оберните бутылку фольгой и ввемит воду IPTG в свет защищенную бутылку мышам соответствующего генотипа и элементы управления в течение по крайней мере одной недели. Приступайте к анализу экспрессии гена, представляющих интерес для ткани-мишени.
Чтобы вызвать гена upregulation, управлять доксициклина в рационе в течение недели и приступить к анализу экспрессии гена интереса в целевой ткани. qRT PCR anaylisis показал, что выражение DNMT1 было подавлено до 15% нерегулируемых уровней, используя подход, основанный на промоутере. Репрессии были отменены в дозе зависимой образом, рассматривая мышей с различным количеством IPTG.
Наблюдаемые репрессии DNMT1 и отмена репрессий DNMT1 с помощью лечения IPTG были подтверждены на уровне белка иммуностимулятором. QRT PCR анализ выражения mKate2 показал, что интрон-подход достиг более 90% репрессий со стороны операторов, расположенных на нескольких килобазах ниже по течению от места начала транскрипции путем ослабления удлинения транскрипции. Конфокальные изображения выражения mKate2 в небольшой интенсивности мышей с или без репрессора LacIGY подтвердили интрон-подход.
В эмбриональных стволовых клетках, содержащих модифицированный эндогенный аллель DNMT1 с последовательностями оператора Tat и Lac, были достигнуты устойчивые upregulation и downregulation выражения DNMT1. Оба правила были полностью обратимыми и неудобоваемыми для лечения IPTG и Dox. Сильная upregulation DNMT1 наблюдалась от печеночной печени, селезенки, и почки.
Тем не менее, не было отмечено upregulation в сердце не наблюдалось, предполагая, что клеточный цикл-зависимой модели выражения DMNT1 и нехватка пролиферативных клеток в сердце может лежать в основе этого наблюдения. Изучение функции in vivo критического гена путем манипулирования его экспрессией часто было сложной задачей из-за летальности. Наш метод позволил нам преодолеть смертельный фенотип для нашего гена интереса и позволил нам изучить его роль в tumorogenesis in vivo.
Аналогичным образом, эта технология позволит изучить другие важные гены, которые были трудно изучать.
