Il significato del nostro metodo è la sua versatilità e potenza. Consente ai ricercatori di avere un robusto controllo sull'espressione genica endogena in modi che sono stati difficili da ottenere utilizzando i metodi esistenti. Permette ai ricercatori di indagare la funzione di un gene a vari livelli di espressione e in modo spazio-temporale.
Quindi consente di testare la reversibilità di un fenotipo, che è utile quando si studiano i geni correlati alla malattia. Per compiere la repressione, l'introne genico bersaglio è progettato per contenere repron R, che contiene 12 operatori lac simmetrici. Quando il repressore LacIGY è espresso dal promotore specifico del tessuto desiderato, il gene bersaglio viene represso.
La repressione del gene bersaglio può essere invertita o adattata al livello di espressione desiderato mediante somministrazione di IPTG, un antagonista del repressore LacIGY. Per realizzare l'upregolazione, il promotore genico target è progettato per contenere quattro o più operatori Tat, T, come siti di binding per gli attivatori rtTA-M2. Quando l'attivatore è espresso dal promotore desiderato specifico del tessuto in presenza di doxiciclina, viene indotta l'upregolazione del gene bersaglio.
L'upregolazione del gene bersaglio può essere invertita o regolata al livello di espressione desiderato ritirando o alterando la concentrazione di doxiciclina. Per realizzare sia la repressione che l'attivazione, i sistemi di repressore Lac e attivatore Tat possono essere combinati. Per modificare il gene di interesse per la repressione, è necessario identificare un introne inerte trascrittamente verso l'estremità dei cinque primi del gene di interesse per l'inserimento della sequenza di repron.
Per ottenere la sequenza genomica per il gene di interesse, passare al browser del genoma UCSC e selezionare l'ultima bozza del genoma del topo sotto la scheda genomi. Immettere il nome o il simbolo del gene di interesse nella barra di ricerca per visualizzare le trascrizioni per il gene e quindi fare clic su vai. Quindi, selezionare la variante di trascrizione desiderata per il gene di interesse e fare clic sul simbolo del gene accanto alla variante di trascrizione di interesse.
Successivamente, sotto la sequenza e i collegamenti a strumenti e database banner, fare clic sul collegamento della sequenza genomica. Per le opzioni dell'area di recupero delle sequenze, selezionare solo esoni, introni e un record FASTA predefinito per gene. Per sequenziare le opzioni di formattazione, selezionare esoni in maiuscolo, tutto il resto in minuscolo e la maschera si ripete in N.Quindi, fare clic su Invia.
Infine, salvare questa sequenza, mantenendo la formattazione maiuscola e minuscola in un documento o in un programma che può essere annotato. Per evitare l'interruzione delle isole CpG, selezionare mostra per la traccia delle isole CpG sotto il banner di espressione e regolazione del browser del genoma UCSC e fare clic su aggiorna. Ingrandindo i cinque introni primi, clicca su ogni isola CpG mostrata in verde e seleziona visualizza il DNA per questa funzione.
Dopo aver selezionato le ripetizioni della maschera su N, fare clic su ottieni DNA per ottenere la sequenza delle isole CpG. Infine, sovrapponi queste sequenze con il file di sequenza originale e annotale come regioni introniche da evitare. Per evitare le regioni introniche con firme enhancer nei tessuti di interesse, passare alla base di dati ENCODE e selezionare l'icona degli esperimenti.
Per il tipo di saggio, selezionare ChiP-seq o DNase-seq e popolare le altre categorie in base alle celle da progettare. Dopo la selezione delle feature, selezionare il pittogramma più a sinistra in blu, per il quale vengono visualizzato i risultati della visualizzazione come elenco. Quindi, selezionare i set di dati per le destinazioni di monometilazione h3k4, acetilazione h3k27, DNasi 1 e CTCF che corrispondevano maggiormente alle celle da progettare.
All'interno di ogni set di dati pertinente scorrere fino alla sezione del file, verificare che mm10 e UCSC siano selezionati e fare clic sul pulsante visualizza. Ora, nel browser del genoma UCSC, ingrandite i cinque introni primi e fate clic su ogni picco nelle tracce di picco annotate. Ottenere la sequenza di DNA per ogni regione di picco cliccando sulle coordinate cromosomiche per ogni picco.
Nel menu a discesa visualizza, selezionate DNA e fate clic su ripetizioni maschera (Mask Repeats) su N.Infine, sovrapporte queste sequenze con il file di sequenza originale e annotatele come regioni introniche da evitare. Per identificare uno sgRNA nelle restanti regioni introniche con alta specificità e punteggi di efficienza previsti, passare a uno strumento di progettazione di sgRNA online preferito, come CRISPOR. Immettere la sequenza della regione di interesse intronica, specificare il genoma di riferimento pertinente e selezionare il motivo adiacente del protospazior desiderato.
Quindi, fare clic su Invia. Quindi, ordina gli sgRNA previsti in base al punteggio di specificità e seleziona uno o più sgRNA che hanno anche un punteggio di efficienza previsto elevato. Infine, progetta un modello di DNA contenente una sequenza di piattaforma di atterraggio PITT affiancata su entrambi i lati da bracci di omologia a 60 basi che corrispondono al sito di taglio dello sgRNA.
Per l'inversione della repressione genica bersaglio, somministrare IPTG nell'acqua potabile dei topi allevati omozigoti con l'allele di interesse modificato sciogliendo completamente la quantità desiderata di IPTG in acqua distillata sterile il giorno della somministrazione. Avvolgere la bottiglia con un foglio e somministrare l'acqua IPTG in una bottiglia leggera protetta ai topi del genotipo appropriato e controlli per almeno una settimana. Procedere all'analisi dell'espressione del gene di interesse nel tessuto bersaglio.
Per indurre l'upregolazione genica, somministrare doxiciclina nella dieta per una settimana e procedere all'analisi dell'espressione del gene di interesse nel tessuto bersaglio. l'anaylisis PCR qRT ha mostrato che l'espressione DNMT1 è stata repressa al 15% dei livelli non regolamentati utilizzando l'approccio basato sul promotore. La repressione è stata invertita in modo dose-dipendente trattando topi con quantità variabili di IPTG.
La repressione del DNMT1 osservata e l'inversione della repressione DNMT1 da parte del trattamento IPTG sono state convalidate a livello proteico mediante immunosocienza. L'analisi PCR qRT dell'espressione mKate2 ha mostrato che l'approccio basato sull'introne ha raggiunto oltre il 90% di repressione da parte di operatori situati a diversi kilobase a valle del sito iniziale di trascrizione attenuando l'allungamento della trascrizione. Le immagini confocali dell'espressione mKate2 nella piccola intensificazione dei topi con o senza il repressore LacIGY hanno convalidato l'approccio basato sull'introne.
Robusta upregulation e downregulation dell'espressione DNMT1 sono stati ottenuti in cellule staminali embrionali contenenti l'allele Endogeno DNMT1 modificato con sequenze di operatori Tat e Lac. Entrambe le normative erano completamente reversibili e inducibili dai trattamenti IPTG e Dox. Forte upregulation di DNMT1 è stato osservato dal fegato, milza e rene.
Tuttavia, non è stata osservata alcuna upregulation rilevabile nel cuore, suggerendo che il modello di espressione dipendente dal ciclo cellulare di DMNT1 e la scarsità di cellule proliferatrici nel cuore possono essere alla base di questa osservazione. Studiare la funzione in vivo di un gene critico manipolandone l'espressione è stato spesso impegnativo a causa della letalità. Il nostro metodo ci ha permesso di superare il fenotipo letale per il nostro gene di interesse e ci ha permesso di studiare il suo ruolo nella tumorogenesi in vivo.
Allo stesso modo, questa tecnologia consentirà lo studio di altri geni essenziali che sono stati difficili da studiare.
