L’importance de notre méthode est sa polyvalence et sa puissance. Il permet aux chercheurs d’avoir un contrôle solide sur l’expression des gènes endogènes d’une manière qui a été difficile à réaliser en utilisant les méthodes existantes. Il permet aux chercheurs d’étudier la fonction d’un gène à différents niveaux d’expression et d’une manière spatio-temporelle.
Ainsi, il permet de tester la réversibilité d’un phénotype, qui est utile lors de l’étude des gènes liés à la maladie. Pour accomplir la répression, le gène cible intron est conçu pour contenir le repron R, qui contient 12 opérateurs symétriques de Lac. Lorsque le répresseur LacIGY est exprimé à partir du promoteur spécifique du tissu désiré, le gène cible est réprimé.
La répression du gène cible peut être inversée ou ajustée au niveau d’expression désiré par l’administration d’IPTG, un antagoniste du répresseur LacIGY. Pour effectuer l’upregulation, le promoteur du gène cible est conçu pour contenir quatre opérateurs Tat ou plus, T, comme sites de liaison pour les activateurs rtTA-M2. Lorsque l’activateur est exprimé à partir du promoteur tissulaire désiré en présence de doxycycline, l’upregulation du gène cible est induite.
L’upregulation du gène cible peut être inversée ou ajustée au niveau d’expression désiré en retirant ou en modifiant la concentration de doxycycline. Pour accomplir à la fois la répression et l’activation, les systèmes d’activateur Lac et Tat peuvent être combinés. Pour modifier le gène d’intérêt pour la répression, une intronisation transcriptionnellement inerte vers les cinq extrémités principales du gène d’intérêt doit être identifiée pour l’insertion de la séquence de repron.
Pour obtenir la séquence génomique du gène d’intérêt, accédez au navigateur du génome de l’UCSC et sélectionnez le dernier brouillon du génome de la souris sous l’onglet génomes. Entrez le nom ou le symbole du gène d’intérêt dans la barre de recherche pour afficher les transcriptions du gène, puis cliquez sur aller. Ensuite, sélectionnez la variante de transcription souhaitée pour le gène d’intérêt et cliquez sur le symbole génétique à côté de la variante transcription d’intérêt.
Ensuite, sous la séquence et les liens vers des outils et des bases de données bannière, cliquez sur le lien séquence génomique. Pour les options de récupération de séquence, sélectionnez uniquement les exons, les introns et le par défaut un enregistrement FASTA par gène. Pour les options de mise en forme de séquençage, sélectionnez les exons dans le majuscule, tout le reste dans le cas inférieur et le masque se répète à N.Then, cliquez sur soumettre.
Enfin, enregistrez cette séquence, en préservant le formatage supérieur et minuscule dans un document ou un programme qui peut être annoté. Pour éviter l’interruption des îles CpG, sélectionnez le spectacle pour la piste des îles CpG sous la bannière expression et régulation du navigateur génome de l’UCSC et cliquez sur actualiser. En zoomant sur les cinq introns principaux, cliquez sur chaque île CpG indiquée en vert et sélectionnez l’ADN de vue pour cette fonctionnalité.
Après avoir sélectionné les répétitions de masque à N, cliquez sur obtenir de l’ADN pour obtenir la séquence des îles CpG. Enfin, superposez ces séquences avec le fichier séquence d’origine, et annotez-les comme des régions introniques à éviter. Pour éviter les régions introniques avec des signatures enhancer dans les tissus d’intérêt, naviguez vers la base de données ENCODE et sélectionnez l’icône expériences.
Pour le type d’analyse, sélectionnez ChiP-seq ou DNase-seq et remplissez les autres catégories en fonction des cellules à concevoir. Après la sélection des fonctionnalités, sélectionnez le pictogramme le plus à gauche en bleu, pour lequel afficher les résultats comme liste apparaît. Ensuite, sélectionnez les ensembles de données pour les cibles de la monomethylation h3k4, h3k27 acetylation, DNase 1, et CTCF qui correspondait le plus étroitement aux cellules à concevoir.
Dans chaque ensemble de données pertinent, faites défiler vers la section fichier, vérifiez que les mm10 et UCSC sont sélectionnés, et cliquez sur le bouton de visualisation. Maintenant, dans le navigateur du génome de l’UCSC, zoomez sur les cinq introns principaux et cliquez sur chaque pic dans les pistes de pointe annotées. Obtenez la séquence d’ADN pour chaque région de pointe en cliquant sur les coordonnées chromosomiques pour chaque pic.
Dans le menu de drop-down de vue, sélectionnez l’ADN, et cliquez sur masque répète à N.Finally, superposer ces séquences avec le fichier séquence d’origine et annoter ces régions introniques pour éviter. Pour identifier un sgRNA dans les régions introniques restantes avec une grande spécificité et des scores d’efficacité prévus, naviguez vers un outil de conception sgRNA en ligne de choix, tel que CRISPOR. Entrez la séquence de la région intronronique d’intérêt, spécifiez le génome de référence pertinent et sélectionnez le motif adjacent protospacer désiré.
Ensuite, cliquez sur soumettre. Ensuite, trier le sgRNA prédit par score de spécificité et sélectionnez un ou plusieurs sgRNA qui ont également un score d’efficacité élevé prédit. Enfin, concevoir un modèle d’ADN contenant une séquence de plaquette d’atterrissage PITT flanquée des deux côtés par des bras d’homologie de 60 bas qui correspondent au site de coupe sgRNA.
Pour l’inversion de la répression des gènes cibles, administrer iPTG dans l’eau potable des homozygotes élevés souris avec l’allèle modifié d’intérêt en dissolvant complètement la quantité désirée d’IPTG dans l’eau distillée stérile le jour de l’administration. Envelopper la bouteille de papier d’aluminium et administrer l’eau IPTG dans une bouteille protégée par la lumière aux souris du génotype approprié et les commandes pendant au moins une semaine. Procéder à l’analyse de l’expression du gène d’intérêt dans le tissu cible.
Pour induire l’upregulation des gènes, administrer de la doxycycline dans l’alimentation pendant une semaine et procéder à l’analyse de l’expression du gène d’intérêt dans le tissu cible. qRT PCR anaylisis a montré que l’expression DNMT1 a été réprimée à 15% des niveaux non réglementés en utilisant l’approche basée sur le promoteur. La répression a été inversée d’une manière dépendante de la dose en traitant les souris avec des quantités variables d’IPTG.
La répression observée du DNMT1 et l’inversion de la répression du DNMT1 par le traitement de l’IPTG ont été validées au niveau des protéines par immunostaining. l’analyse pcr qRT de l’expression mKate2 a montré que l’approche basée sur l’intron a atteint plus de 90% de répression de la part des opérateurs situés à plusieurs kilobases en aval du site de démarrage de transcription en atténuant l’allongement de transcription. Les images confocales de l’expression mKate2 dans la petite intenstine des souris avec ou sans le répresseur LacIGY ont validé l’approche à base d’intron.
La réglementation et la downregulation robustes de l’expression de DNMT1 ont été réalisées dans les cellules souches embryonnaires contenant l’allèle endogène modifié de DNMT1 avec des séquences d’opérateur de Tat et de Lac. Les deux règlements étaient entièrement réversibles et inductibles par les traitements IPTG et Dox. La forte upregulation de DNMT1 a été observée du foie, de la rate, et du rein.
Cependant, aucune upregulation détectable dans le coeur n’a été observée, suggérant que le modèle d’expression cycle-dépendant de cellules de DMNT1 et la rareté des cellules prolifératives dans le coeur puissent sous-tendre cette observation. L’étude de la fonction in vivo d’un gène critique en manipulant son expression a souvent été difficile en raison de la létalité. Notre méthode nous a permis de surmonter le phénotype mortel pour notre gène d’intérêt et nous a permis d’étudier son rôle dans la tumorogenèse in vivo.
De même, cette technologie permettra d’étudier d’autres gènes essentiels qui ont été difficiles à étudier.
