우리의 방법의 중요성은 다재다능함과 힘입니다. 그것은 연구원이 기존 방법을 사용하여 달성하기 어려운 방법으로 내인성 유전자 발현에 대한 강력한 제어를 할 수 있습니다. 그것은 연구원이 각종 발현 수준 및 spatio-측두성 방식으로 유전자의 기능을 조사하는 것을 허용합니다.
따라서 질병 관련 유전자를 연구할 때 유용한 표현형의 가역성을 테스트할 수 있습니다. 억압을 달성하기 위해, 표적 유전자 intron는 12 대칭 Lac 연산자를 포함하는 repron R을 포함하도록 설계되었습니다. LacIGY 억압자가 원하는 조직 특정 프로모터로부터 발현되면 표적 유전자가 억압된다.
표적 유전자의 억압은 LacIGY 억압자의 길항제인 IPTG의 투여에 의해 원하는 발현 수준으로 반전되거나 조절될 수 있다. 상향 조절을 달성하기 위해, 표적 유전자 프로모터는 rtTA-M2 활성제에 대한 결합 부위로서 4개 이상의 Tat 연산자 T를 포함하도록 설계되었습니다. 활성제는 독시사이클린의 존재에서 원하는 조직-특정 프로모터로부터 발현될 때, 표적 유전자의 상향 조절이 유도된다.
대상 유전자의 상향 조절은 독시사이클린의 농도를 철회하거나 변경함으로써 원하는 발현 수준으로 반전되거나 조절될 수 있다. 억압과 활성화를 모두 달성하기 위해 락 억제기 및 Tat 활성제 시스템을 결합할 수 있습니다. 억압에 대한 관심 유전자를 수정하려면, 관심 있는 유전자의 5개의 주요 끝을 향한 전사적으로 불활성 인트론이 레프레론 서열의 삽입을 위해 확인되어야 한다.
관심 있는 유전자에 대한 게놈 서열을 얻으려면 UCSC 게놈 브라우저로 이동하여 게놈 탭 하에서 마우스 게놈의 최신 초안을 선택한다. 관심 있는 유전자의 이름이나 기호를 검색 모음에 입력하여 유전자에 대한 성적증명서를 본 다음 이동을 클릭합니다. 그런 다음, 관심 있는 유전자에 대한 원하는 성적증명서 이체를 선택하고 관심 있는 성적증명서 변이체 옆의 유전자 심볼을 클릭한다.
다음으로 도구 및 데이터베이스 배너에 대한 시퀀스 및 링크에서 게놈 시퀀스 링크를 클릭합니다. 서열 검색 영역 옵션의 경우 유전자당 엑손, 인트론 및 기본 하나의 FASTA 레코드만 선택합니다. 서열 서식 옵션을 보려면 대문자로 엑슨을 선택하고 소문자의 다른 모든 것을 선택하고 마스크가 N.Then로 반복되면 제출을 클릭합니다.
마지막으로 이 시퀀스를 저장하여 이 시퀀스를 저장하여 인음칠할 수 있는 문서 또는 프로그램에서 상문자 및 소문자 서식을 유지합니다. CpG 제도의 중단을 방지하려면 UCSC 게놈 브라우저의 발현 및 조절 배너 아래에 CpG 제도 트랙에 대한 표시를 선택하고 새로 고침을 클릭합니다. 다섯 개의 주요 인트론을 확대하고 녹색으로 표시된 각 CpG 섬을 클릭하고 이 기능에 대한 DNA 보기를 선택합니다.
N으로 반복되는 마스크 반복을 선택한 후 DNA를 클릭하여 CpG 제도 서열을 얻습니다. 마지막으로 이러한 시퀀스를 원래 시퀀스 파일과 오버레이하고 이러한 시퀀스 에 대한 정보를 피해야 하는 내향 영역으로 음신합니다. 관심 있는 조직에 증강 서명이 있는 내향 영역을 피하려면 ENCODE 데이터 베이스로 이동하여 실험 아이콘을 선택합니다.
분석 유형의 경우, ChiP-seq 또는 DNase-seq를 선택하고 엔지니어링할 셀에 따라 다른 범주를 채웁니다. 피처 선택 후 왼쪽 대부분의 그림그림을 파란색으로 선택하여 결과를 목록으로 봅니다. 그런 다음, 가장 밀접하게 엔지니어링 할 세포와 일치하는 h3k4 단조량, h3k27 아세틸화, DNase 1 및 CTCF의 대상에 대한 데이터 세트를 선택합니다.
각 관련 데이터 집합 내에서 파일 섹션으로 스크롤하고 mm10 및 UCSC가 선택되었는지 확인하고 시각화 단추를 클릭합니다. 이제 UCSC 게놈 브라우저에서 5개의 주요 인트론을 확대하고 인트윗된 피크 트랙의 각 피크를 클릭합니다. 각 피크에 대한 염색체 좌표를 클릭하여 각 피크 영역에 대한 DNA 서열을 가져옵니다.
뷰 드롭다운 메뉴에서 DNA를 선택하고 마스크 반복을 N.Finally로 선택하고 이러한 시퀀스를 원래 시퀀스 파일로 오버레이하고 이를 내성 영역으로 부음하여 피하십시오. 높은 특이성과 예상 효율 점수를 가진 나머지 내성 지역에서 sgRNA를 식별하려면 CRISPOR와 같은 선택의 온라인 sgRNA 설계 도구로 이동합니다. 관심 있는 내성 영역의 서열을 입력하고, 관련 기준 게놈을 지정하고, 원하는 프로토스페이스어 인접 모티프를 선택한다.
그런 다음 제출을 클릭합니다. 다음으로, 예측된 sgRNA의 특이성 점수를 정렬하고 또한 높은 예측 효율 점수를 갖는 하나 이상의 sgRNA를 선택합니다. 마지막으로, SgRNA 절단 부위에 해당하는 60기 상동성 팔에 의해 양쪽에 측면에 있는 PITT 랜딩 패드 서열을 포함하는 DNA 템플릿을 설계한다.
표적 유전자 억압의 반전을 위해, 투여 당일 멸균 증류수에서 원하는 양의 IPTG를 완전히 용해시킴으로써 이해의 수정된 송계로 호마시구스 사육 마우스의 식수에서 IPTG를 투여한다. 병을 호일로 감싸고 IPTG 물을 가벼운 보호 병으로 투여하여 적절한 유전자형의 마우스에 투여하고 적어도 일주일 동안 제어한다. 표적 조직에 대한 관심 유전자의 발현을 분석하여 진행한다.
유전자 상향 조절을 유도하기 위해, 1주일 동안 식단에서 독시사이클린을 투여하고 표적 조직에 대한 관심 유전자의 발현을 분석하는 진행한다. qRT PCR anaylisis는 DNMT1 발현이 프로모터 기반 접근법을 사용하여 규제되지 않은 수준의 15%로 억압된 것으로 나타났습니다. 억압은 다양한 양의 IPTG를 가진 마우스를 취급해서 복용량 의존적인 방식으로 반전되었습니다.
IPTG 치료에 의한 DNMT1 억압 및 DNMT1 억압의 반전은 면역스테인링에 의한 단백질 수준에서 검증되었다. mKate2 발현의 qRT PCR 분석은 인트론 기반 접근법이 전사 연신을 감쇠하여 전사 시작 부위의 여러 킬로베이스 하류에 위치한 사업자로부터 90% 이상의 억압을 달성한 것으로 나타났다. LacIGY 억압자 유무에 관계없이 마우스의 작은 텐스틴에서 mKate2 발현의 공초점 이미지는 인트론 기반 접근법을 검증하였다.
DNMT1 발현의 강력한 강화 조절 및 다운규제는 Tat 및 Lac 연산체서와 함께 변형된 내인성 DNMT1 을 포함하는 배아 줄기 세포에서 달성되었다. 두 규정 모두 IPTG및 Dox 치료에 의해 완전히 뒤집을 수 있고 유도할 수 있었습니다. DNMT1의 강력한 강화 조절은 간, 비장 및 신장에서 관찰되었다.
그러나, 심장에서 검출 가능한 업규제가 관찰되지 않았으며, DMNT1의 세포 주기 의존식 패턴과 심장내 증식 세포의 희소성이 이러한 관찰의 근간을 겪을 수 있음을 시사한다. 그것의 표현을 조작하여 중요한 유전자의 생체 내 기능을 공부하는 것은 수시로 치사 때문에 도전이었습니다. 우리의 방법은 우리가 관심의 유전자에 대한 치명적인 표현형을 극복 할 수 있게하고 우리가 생체 내 종양 발생에 미치는 역할을 연구 할 수있었습니다.
마찬가지로, 이 기술은 공부하기 어려웠던 그밖 필수 유전자의 조사를 가능하게 할 것입니다.
