Интерактивная система в режиме реального времени для изучения конфронтационного поведения грызунов при преследовании

В этой статье мы представляем протокол для обнаружения и количественной оценки хищнического поведения в модели мыши. Эта платформа обеспечивает новую исследовательскую парадигму для изучения динамики и нейронных механизмов хищнического преследующего поведения у мышей и обеспечит стандартизированную платформу для изучения преследующего поведения.

Поведение хищника включает в себя ряд важных физиологических процессов, таких как передвижение, обучение и принятие решений, которые имеют решающее значение для успеха животного в захвате добычи. Тем не менее, существует мало методов и систем для изучения хищнического поведения в лаборатории, особенно на мышах, широко используемой модели млекопитающих. Основными факторами, ограничивающими это исследование, являются неконтролируемость живой добычи (например, сверчков) и проблема гармонизации экспериментальных стандартов. Целью данного исследования была разработка интерактивной платформы для обнаружения и количественной оценки хищнического поведения мышей на роботизированной приманке. Платформа использует компьютерное зрение для мониторинга взаимного расположения мыши и роботизированной приманки в режиме реального времени, чтобы запрограммировать модели движения роботизированной приманки, а интерактивные двумерные ползунки магнитно контролируют движение роботизированной приманки для достижения замкнутой системы. Роботизированная приманка способна уклоняться от приближающихся голодных мышей в режиме реального времени, а скорость и направление ее побега могут быть отрегулированы, чтобы имитировать процесс преследования хищника в различных контекстах. После короткого периода обучения без присмотра (менее двух недель) мыши смогли выполнить задачу хищничества с относительно высокой эффективностью (менее 15 с). Записывая кинематические параметры, такие как скорость и траектории роботизированной приманки и мышей, мы смогли количественно оценить процесс преследования в различных условиях. В заключение следует отметить, что этот метод обеспечивает новую парадигму для изучения хищнического поведения и может быть использован для дальнейшего исследования динамики и нейронных механизмов хищнического преследующего поведения.

Преследование добычи хищниками является не только яркой демонстрацией борьбы за выживание, но и ключевым двигателем эволюции видов, поддержанием экологического равновесия и потока энергии в природе ^1,2. Для хищников преследование добычи является сложным делом, включающим в себя множество физиологических процессов. Эти процессы включают в себя мотивационные^{состояния, которые} побуждают хищника к охоте, перцептивные способности, которые позволяют ему обнаруживать и отслеживать добычу ^4,5,6, способности к принятию^{решений, которые} диктуют ход охоты7, локомоторную функцию, которая обеспечивает физическое преследование ^8,9, и механизмы обучения, которые совершенствуют охотничьи стратегии^{с течением времени. 11}. Поэтому в последние годы хищническая погоня привлекла к себе большое внимание как важная и сложная поведенческая модель.

В качестве широко используемой модели млекопитающих в лаборатории было задокументировано, что мыши охотятся на сверчков как в их естественной среде обитания, так и в^{лабораторных исследованиях}. Тем не менее, разнообразие и неконтролируемость живой добычи при количественной оценке поведения хищника ограничивают воспроизводимость экспериментов, а также обмен сравнениями между различными лабораториями^. Во-первых, штаммы сверчков могут различаться в разных лабораториях, что приводит к различиям в характеристиках добычи, которые могут влиять на поведение при преследовании. Во-вторых, отдельные сверчки обладают уникальными характеристиками, которые могут влиять на исход хищнических^{взаимодействий.} Например, скорость убегания каждого сверчка может быть разной, что приводит к изменчивости динамики преследования. Кроме того, некоторые сверчки могут иметь короткую дистанцию предупреждения, что может привести к отсутствию процесса преследования, так как у хищника может не быть возможности участвовать в преследовании. Наконец, некоторые сверчки могут проявлять защитное, агрессивное поведение при стрессе, что усложняет интерпретацию экспериментальных^{данных.} Трудно определить, обусловлены ли изменения в поведении хищника защитными стратегиями жертвы или же они присущи поведенческим моделям хищника. Эта размытая грань между защитой добычи и стратегиями хищника добавляет еще один уровень сложности в изучение преследования хищников.

Осознавая эти ограничения, исследователи обратились к искусственной добыче как к средству контроля и стандартизации^{экспериментальных условий.} Было показано, что семь видов грызунов, включая мышей, демонстрируют значительное хищническое поведение по отношению к^{искусственной} добыче. Таким образом, управляемая роботизированная приманка может быть возможной при изучении поведения хищников. Разрабатывая различную искусственную добычу, исследователи могут осуществлять такой уровень контроля над экспериментальными условиями, который невозможен с живой добычей ^18,19. Кроме того, в небольшом числе предыдущих исследований использовались искусственно управляемые роботизированные рыбы или добыча для изучения стайного поведения и хищничества у рыб 15,17,19. Эти исследования подчеркнули ценность роботизированных систем в обеспечении последовательных, повторяемых и манипулируемых стимулов для экспериментальных исследований, но, несмотря на эти достижения, в области поведения грызунов, особенно у мышей, не хватает специальной платформы для обнаружения и количественной оценки поведения хищников с использованием роботизированной приманки.

Исходя из вышеуказанных причин, мы разработали интерактивную платформу с открытым исходным кодом в режиме реального времени для изучения хищнического поведения мышей. Роботизированная приманка на платформе может убегать от мышей в режиме реального времени, а роботизированная приманка хорошо контролируется, поэтому мы можем устанавливать различные направления или скорости побега, чтобы смоделировать различные сценарии хищничества. Программа на языке Python на компьютере использовалась для генерации параметров движения роботизированной добычи, которая была объединена с микроконтроллером STM32 для привода серводвигателей и управления движением роботизированной приманки. Модульная аппаратная система может быть адаптирована к конкретной лабораторной среде в режиме реального времени, а программная система может регулировать сложность системы, а также показатели для лучшего выполнения исследовательских целей в соответствии с экспериментальными потребностями. Легкая система позволяет значительно сократить время обработки данных на компьютере, что имеет важное значение для эффективности системы и повышает ее портативность. Платформа поддерживает следующие технические особенности: гибкая и управляемая искусственная добыча для легкого повторения и моделирования; максимальное моделирование охотничьего процесса в естественной среде; взаимодействие в режиме реального времени и низкая задержка системы; масштабируемость аппаратного и программного обеспечения, а также масштабируемость; экономичность и простота в использовании. Используя эту платформу, мы успешно обучили мышей выполнять хищнические задачи в различных условиях и смогли количественно оценить такие параметры, как траектория, скорость и относительное расстояние во время преследования хищников. Платформа предоставляет быстрый метод для создания парадигмы преследования хищников для дальнейшего исследования нейронных механизмов, лежащих в основе преследования хищников.

Взрослые мыши C57BL/6J (самцы, в возрасте 6-8 недель) предоставляются Центром лабораторных животных Армейского медицинского университета. Все экспериментальные процедуры выполняются в соответствии с институциональными рекомендациями по благополучию животных и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Армейского медицинского университета (No 100). AMUWEC20210251). Мыши содержатся в условиях контролируемой температуры (22-25°C) с 12-часовым обратным циклом света/темноты (освещение 20:00-8:00) и свободным доступом к пище и воде.

1. Подготовка аппаратного обеспечения к интерактивной платформе в режиме реального времени

1. Установите веб-камеру на перекладине над всей платформой, чтобы следить за положением мыши и роботизированной приманки на арене внизу в режиме реального времени и передавать изображения на компьютер (рис. 1A).
2. Спроектируйте большую круглую арену (диаметр 800 мм, высота 300 мм), состоящую из квадратной акриловой панели внизу и акриловой трубки в качестве бордюра. Разместите на равных расстояниях четыре значка (квадрат, треугольник, круг и крест) на внутренних стенах арены, чтобы они служили визуальными подсказками (рис. 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя стенка акриловой трубки и поверхность квадратной акриловой пластины должны быть покрыты непрозрачной наклейкой.
3. В качестве роботизированной приманки используйте круглый неодимовый магнит (диаметр 40 мм, высота 10 мм, сверчки около ^2-4 см в длину ^4,22 см) с пищевыми гранулами (5 × 0,2 мг). Прикрепите синюю наклейку к поверхности магнита для идентификации и определения местоположения.
4. Установите под арену двухмерный слайдер (с эффективным ходом 1000 мм). Установите еще один неодимовый магнит на его носитель в качестве притягивающего магнита для магнитного и дистанционного вытягивания роботизированной приманки.
5. Привод тягового магнита осуществляется с помощью серводвигателей, управляемых платой STM32 и коммутационной цепью. При использовании режима «скорость-направление» для привода серводвигателя (75 мм на 16 000 импульсов) частота волны ШИМ на выходном порту на плате STM32 кодирует скорость, а высокие или низкие уровни (3,3 В или 0 В) кодируют прямое или обратное направление (рис. 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммутационная цепь показана на дополнительном рисунке 1, где показана только схема подключения сигнала скорости и направления, необходимая для перемещения одного ползуна и управления другим ползуном таким же образом. Провода заземления в двух цепях управления заслонкой могут быть соединены вместе.

2. Разработка программного обеспечения для интерактивной платформы в режиме реального времени

1. Используйте основную программу для определения взаимного положения мыши и роботизированной приманки и для передачи сигнала движения роботизированной приманки на микроконтроллер STM32 (рис. 1D).
2. Когда компьютер получает изображения с веб-камеры, обработайте кадры в среде Python.
3. Преобразуйте каждый кадр из цветовой модели RGB в цветовую модель HSV с помощью модуля OpenCV²⁰ (cv2.cvtColor).
   Примечание: Поскольку мыши ведут ночной образ жизни и для стабильности идентификации, эксперименты следует проводить в условиях низкой и стабильной освещенности, обеспечивая постоянные условия освещения на арене и избегая полутеней. Освещенность в этом эксперименте составляла примерно 95 люкс.
4. Получение изображений маски мыши и роботизированной приманки на основе их цветовых диапазонов в цветовой модели HSV соответственно (cv2.inRange).
5. Примените медианную фильтрацию к изображению маски, чтобы сделать контуры мыши и роботизированной приманки более четкими и стабильными (cv2.medianBlur).
6. Получите информацию о контурах мыши и роботизированной приманки с помощью функции обнаружения контуров (cv2.findContours), а затем найдите минимальный прямоугольник, который может покрывать область контура. Используйте координаты центра этого прямоугольника в качестве положения мыши и роботизированной приманки соответственно и сохраните их в виде файлов TXT.
7. На основе информации о положении мыши и робота-приманки в каждом кадре рассчитайте скорость мыши и относительное расстояние до робота-приманки и сохраните эти параметры в виде файлов TXT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая временные затраты на вычисления, связанные с обработкой изображений, фактическая скорость обработки скрипта составляет около 41 кадра в секунду, что означает, что система может обнаруживать движения мыши и робота-приманки примерно за 24 мс. Проверенная системная задержка между отправкой команды движения и обнаружением движения составляет 59,4 ± 7,3 мс (n = 8), поэтому задержка между движением мыши и движением добычи, вызванным мышью, составляет около 83 мс (сверчки имеют время реакции менее 250 мс²²).
8. В зависимости от относительного расстояния между мышью и роботизированной приманкой и их соответствующего положения на арене определите стратегию убегания роботизированной приманки 21,22,23.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь находится относительно далеко от роботизированной приманки (>250 мм), предполагается, что роботизированная приманка находится в безопасной зоне. Предположим, что мышь находится достаточно близко к роботизированной приманке (<80 мм, так как относительное расстояние в этом методе определяется исходя из центра мыши и роботизированной приманки, мы скорректировали это пороговое расстояние, исходя из длины тела мыши, примерно 11 см, и диаметра приманки, 4 см). В этом случае это считается успешной поимкой, и роботизированная приманка остановится, позволяя мыши поглотить находящиеся на ней гранулы пищи (рис. 2A). В стратегии убегания по прямой, если приманка находится в центральной зоне арены (расстояние до границы >75 мм), что указывает на достаточное пространство во всех направлениях побега, она будет двигаться в том направлении, в котором мышь движется к себе. И наоборот, если приманка находится близко к стене арены, на что указывает окружающая площадь (расстояние до границы ≤75 мм), что указывает на недостаточное пространство для непрерывного движения, она будет поворачиваться на 90° в сторону с большим расстоянием до границы арены (больше доступного пространства, рис. 2Б). В пошаговой стратегии побега роботизированная приманка поворачивается на 90° в сторону, оставляя больше пространства для побега, если судить с интервалом в 0,5 секунды (рис. 2C).
9. После определения стратегии побега попросите скрипт Python закодировать сигналы скорости и направления отдельно и отправить их на STM32 через последовательный порт (ser.port = 'COM3') с битрейтом 115200.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипты в STM32 компилируются в среде C. При приеме сигнала скорости он преобразуется в ШИМ-волну соответствующей частоты делителем частоты и выходом кварцевого генератора (частота кристалла STM32 равна 72000000). После получения сигнала направления цифровой сигнал преобразуется путем повышения или уменьшения напряжения выходного порта (0 или 3,3 В).
10. Используйте устройство записи последовательных портов для записи скомпилированной программы C на STM32.
11. Используйте программу сброса, чтобы переместить роботизированную приманку к центру арены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определяя положение роботизированной приманки на арене, роботизированная приманка непрерывно движется к центральному положению (5 см/с), и когда обнаруживается расстояние <20 мм от центрального положения, считается, что она достигла центра арены и прекращает движение. Запустите программу сброса перед запуском основной программы.

3. Привыкание (Рисунок 2D)

1. Пристегните мышь на 12 ч, чтобы снизить массу тела животного до 90-95% от нормы, со свободным доступом воды в этот период.
2. Сначала запустите программу сброса, чтобы переместить роботизированную приманку к центру арены, а затем изолируйте голодную мышь на краю арены с помощью перегородки.
3. Задайте путь сохранения файла и скорость движения роботизированной приманки (5 см/с) в основной программе. Затем нажмите Run, и понаблюдайте во всплывающем видеоокне, стабильно ли распознаются мышь и роботы-приманки.
4. Снимите перегородку и запустите таймер, чтобы наблюдать за хищным поведением мыши в течение 20 минут, записывая время, когда мышь впервые берет пищевую гранулу из роботизированной приманки. Если мышь не может этого сделать, остановите приманку и положите ее рядом с мышью для кормления.
5. Верните мышь в клетку и дайте ей 24-часовой период восстановления со свободным доступом к пище и воде. Затем повторите привыкание. Если нет существенной разницы во времени до первого извлечения пищи между двумя последовательными попытками в одной и той же группе животных, считайте, что привыкание завершено. Этот период обычно занимает 3-5 попыток.
6. После каждого привыкания тщательно очищайте арену с помощью 75% спирта и воды.

4. Задача хищничества (Рисунок 2D)

1. Приступайте к задаче хищничества сразу после привыкания.
2. Пристегните мышь на 12 ч, чтобы снизить массу тела животного до 90-95% от нормы, со свободным доступом воды в этот период.
3. Сначала запустите программу сброса, чтобы переместить роботизированную приманку к центру арены, а затем изолируйте голодную мышь на краю арены с помощью перегородки.
4. Установите путь сохранения файла и скорость движения роботизированной приманки (0-60 см/с, могут быть установлены разные скорости в соответствии с экспериментальными потребностями) в основной программе. Затем нажмите «Запустить», и понаблюдайте во всплывающем видеоокне, стабильно ли обнаруживаются мышь и роботизированная приманка.
5. Снимите перегородку и запустите таймер, чтобы наблюдать за хищным поведением мыши в течение 60 секунд.
   1. Если мышь успешно захватывает роботизированную приманку в течение 60 секунд, закройте основную программу и позвольте мыши съесть все гранулы пищи, прежде чем вернуться в клетку.
   2. Если мышь не поймает роботизированную приманку в течение 60 секунд, отпустите мышь прямо в клетку без какого-либо вознаграждения или наказания.
6. Проведите второй раунд заданий на хищничество через 4 часа, повторяя шаги 4.3-4.5.
7. Предоставьте мышке 24-часовой период восстановления со свободным доступом к пище и воде. Затем повторите задание на хищничество. Если более 80% мышей проводят менее 15 секунд в двух последовательных испытаниях, мыши считаются опытными хищниками.
8. После каждого задания по хищничеству тщательно очищайте арену с помощью 75% спирта и воды.

Чтобы убежать от хищника, жертва часто использует гибкие и изменчивые стратегии побега, такие как изменение скорости побега или бегство в непредсказуемых^{направлениях.} В этом исследовании характер движения роботизи?...

В этом протоколе для достижения управления в режиме реального времени с низкой задержкой системы мы используем OpnenCV, легкую и эффективную библиотеку компьютерного зрения, а также цветовую модель для определения положения мышей и робота-приманки. Для этого необходимо...

Авторам нечего раскрывать.

Это исследование проводится при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (32171001, 32371050).