Um sistema interativo em tempo real para estudar o comportamento de perseguição de confronto em roedores

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar e quantificar o comportamento de perseguição predatória em um modelo de camundongo. Esta plataforma fornece um novo paradigma de pesquisa para estudar a dinâmica e os mecanismos neurais do comportamento de perseguição predatória em camundongos e fornecerá uma plataforma padronizada para estudar o comportamento de perseguição.

O comportamento de perseguição predatória envolve uma série de processos fisiológicos importantes, como locomoção, aprendizado e tomada de decisão, que são essenciais para o sucesso de um animal na captura de presas. No entanto, existem poucos métodos e sistemas para estudar o comportamento de perseguição predatória em laboratório, especialmente em camundongos, um modelo de mamífero comumente usado. Os principais fatores que limitam esta pesquisa são a incontrolabilidade de presas vivas (por exemplo, grilos) e o desafio de harmonizar os padrões experimentais. O objetivo deste estudo foi desenvolver uma plataforma interativa para detectar e quantificar comportamentos de perseguição predatória em camundongos em uma isca robótica. A plataforma usa visão computacional para monitorar as posições relativas do mouse e da isca robótica em tempo real para programar os padrões de movimento da isca robótica, e os controles deslizantes bidimensionais interativos controlam magneticamente o movimento da isca robótica para obter um sistema de circuito fechado. A isca robótica é capaz de escapar da aproximação de ratos famintos em tempo real, e sua velocidade e direção de fuga podem ser ajustadas para imitar o processo de perseguição predatória em diferentes contextos. Após um curto período de treinamento não supervisionado (menos de duas semanas), os camundongos foram capazes de realizar a tarefa de predação com uma eficiência relativamente alta (menos de 15 s). Ao registrar parâmetros cinemáticos, como velocidade e trajetórias da isca robótica e dos camundongos, fomos capazes de quantificar o processo de perseguição sob diferentes condições. Em conclusão, este método fornece um novo paradigma para o estudo do comportamento predatório e pode ser usado para investigar mais a fundo a dinâmica e os mecanismos neurais do comportamento de perseguição predatória.

A busca de presas por predadores não é apenas uma demonstração vívida da luta pela sobrevivência, mas também um fator-chave da evolução das espécies, mantendo o equilíbrio ecológico e o fluxo de energia na natureza ^1,2. Para os predadores, a atividade de perseguir presas é um empreendimento sofisticado que envolve uma variedade de processos fisiológicos. Esses processos incluem os estados motivacionais que levam o predador a caçar³, as habilidades perceptivas que lhe permitem detectar e rastrear presas ^4,5,6, as habilidades de tomada de decisão que ditam o curso da caça⁷, a função locomotora que permite a perseguição física ^8,9 e os mecanismos de aprendizagem que refinam as estratégias de caça ao longo do tempo ^{10, 11}. Agosto Portanto, a busca predatória tem recebido muita atenção nos últimos anos como um modelo comportamental importante e complexo.

Como um modelo de mamífero amplamente utilizado em laboratório, os ratos foram documentados para caçar grilos tanto em seu habitat natural quanto em estudos de laboratório¹². No entanto, a diversidade e a incontrolabilidade de presas vivas na quantificação do comportamento de perseguição predatória limitam a reprodutibilidade dos experimentos, bem como a troca de comparações entre diferentes laboratórios¹³. Primeiro, as cepas de grilo podem ser diferentes entre os laboratórios, resultando em diferenças nas características da presa que podem influenciar o comportamento de perseguição. Em segundo lugar, os grilos individuais têm características únicas que podem afetar o resultado das interações predatórias¹⁴. Por exemplo, a velocidade de escape de cada grilo pode ser diferente, levando à variabilidade na dinâmica de perseguição. Além disso, alguns grilos podem ter uma curta distância de advertência, o que pode levar à falta de processo de perseguição, pois o predador pode não ter a oportunidade de se envolver em perseguição. Finalmente, alguns grilos podem exibir comportamento defensivo e agressivo quando estressados, o que complica a interpretação dos dados experimentais¹⁵. É difícil determinar se as mudanças no comportamento do predador são devidas às estratégias defensivas da presa ou são inerentes aos padrões de comportamento do predador. Essa linha tênue entre a defesa da presa e as estratégias do predador adiciona outra camada de complexidade ao estudo da perseguição predatória.

Reconhecendo essas limitações, os pesquisadores se voltaram para as presas artificiais como meio de controlar e padronizar as condições experimentais^16,17. Sete espécies de roedores, incluindo camundongos, demonstraram exibir comportamento predatório significativo em relação a presas artificiais¹³. Portanto, uma isca robótica controlável pode ser viável no estudo do comportamento de perseguição predatória. Ao projetar diferentes presas artificiais, os pesquisadores podem exercer um nível de controle sobre as condições experimentais, o que não é possível com presas vivas^18,19. Além disso, um pequeno número de estudos anteriores usou peixes ou presas robóticas controladas artificialmente para estudar o comportamento de cardume e predação em peixes 15,17,19. Esses estudos destacaram o valor dos sistemas robóticos no fornecimento de estímulos consistentes, repetíveis e manipuláveis para pesquisas experimentais, mas, apesar desses avanços, o campo do comportamento de roedores, particularmente em camundongos, carece de uma plataforma dedicada para detectar e quantificar o comportamento de perseguição predatória usando isca robótica.

Com base nas razões acima, projetamos uma plataforma interativa em tempo real de código aberto para estudar o comportamento de perseguição predatória em camundongos. A isca robótica na plataforma pode escapar dos ratos em tempo real, e a isca robótica é altamente controlável, para que possamos definir diferentes direções ou velocidades de fuga para simular diferentes cenários de predação. Um programa Python no computador foi usado para gerar os parâmetros de movimento da presa robótica, que foi combinado com um microcontrolador STM32 para acionar os servomotores e controlar o movimento da isca robótica. O sistema de hardware modular pode ser adaptado ao ambiente específico do laboratório em tempo real, e o sistema de software pode ajustar a dificuldade do sistema, bem como os indicadores para melhor atender ao propósito da pesquisa de acordo com as necessidades experimentais. O sistema leve permite uma redução significativa no tempo de processamento do computador, o que é essencial para a eficácia do sistema e melhora sua portabilidade. A plataforma suporta as seguintes características técnicas: presas artificiais flexíveis e controláveis para fácil repetição e modelagem; simulação máxima do processo de caça em ambiente natural; interação em tempo real e baixa latência do sistema; a escalabilidade de hardware e software, bem como escalabilidade; custo-benefício e facilidade de uso. Usando esta plataforma, treinamos com sucesso camundongos para realizar tarefas predatórias sob várias condições e conseguimos quantificar parâmetros como trajetória, velocidade e distância relativa durante a perseguição predatória. A plataforma fornece um método rápido para estabelecer um paradigma de busca predatória para investigar ainda mais os mecanismos neurais por trás da busca predatória.

Camundongos C57BL / 6J adultos (machos, 6-8 semanas de idade) são fornecidos pelo Centro de Animais de Laboratório da Universidade Médica do Exército. Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com as diretrizes institucionais de bem-estar animal e são aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica do Exército (No. AMUWEC20210251). Os camundongos são alojados em condições de temperatura controlada (22-25 ° C) com um ciclo reverso de luz / escuridão de 12 horas (luzes acesas 20:00-8:00) e livre acesso a comida e água.

1. Preparação de hardware para plataforma interativa em tempo real

1. Monte uma webcam em uma barra transversal acima de toda a plataforma para monitorar as posições do mouse e da isca robótica na arena abaixo em tempo real e transmitir as imagens para o computador (Figura 1A).
2. Projete uma grande arena circular (800 mm de diâmetro, 300 mm de altura) composta por um painel quadrado de acrílico na parte inferior e um tubo de acrílico como borda. Coloque quatro ícones uniformemente espaçados (quadrado, triângulo, círculo e cruz) nas paredes internas da arena para servir como dicas visuais (Figura 1B).
   NOTA: A parede interna do tubo de acrílico e a superfície da placa de acrílico quadrada precisam ser cobertas com um adesivo opaco.
3. Use um ímã redondo de neodímio (40 mm de diâmetro, 10 mm de altura, os grilos têm cerca de 2-4 cm de comprimento ^4,22) com pellets de comida (5 × 0,2 mg) como isca robótica. Cole um adesivo azul na superfície do ímã para identificação e localização.
4. Monte um controle deslizante bidimensional (com um curso efetivo de 1000 mm) sob a arena. Instale outro ímã de neodímio em seu transportador como um ímã de tração para puxar magnética e remotamente a isca robótica.
5. Acione o ímã extrator por servomotores controlados por uma placa STM32 e um circuito de comutação. Usando o modo de direção de velocidade para acionar um servo motor (75 mm por 16.000 pulsos), a frequência da onda PWM na porta de saída na placa STM32 codifica a velocidade e os níveis altos ou baixos (3.3 V ou 0 V) codificam a direção para frente ou para trás (Figura 1C).
   NOTA: O circuito de comutação é mostrado na Figura Suplementar 1, que mostra apenas o diagrama de conexão do sinal de velocidade e direção necessário para o movimento de uma corrediça e o controle da outra corrediça da mesma maneira. Os fios terra nos dois circuitos de controle deslizante podem ser conectados juntos.

2. Design de software para plataforma interativa em tempo real

1. Use o programa principal para detectar a posição relativa do mouse e da isca robótica e para transmitir o sinal de movimento da isca robótica para o microcontrolador STM32 (Figura 1D).
2. Quando o computador receber imagens da webcam, processe os quadros no ambiente Python.
3. Converta cada quadro do modelo de cores RGB para o modelo de cores HSV usando o módulo OpenCV²⁰ (cv2.cvtColor).
   NOTA: Como os camundongos são forrageadores noturnos e para a estabilidade da identificação, os experimentos devem ser conduzidos em condições de iluminação baixa e estável, garantindo condições de iluminação consistentes na arena e evitando sombras parciais. A iluminação neste experimento foi de aproximadamente 95 lux.
4. Adquira imagens de máscara do mouse e da isca robótica com base em suas faixas de cores no modelo de cores HSV, respectivamente (cv2.inRange).
5. Aplique filtragem mediana à imagem da máscara para tornar os contornos do mouse e da isca robótica mais claros e estáveis (cv2.medianBlur).
6. Obtenha as informações de contorno do mouse e da isca robótica usando a função de detecção de contorno (cv2.findContours) e, em seguida, encontre um retângulo mínimo que possa cobrir a área de contorno. Use as coordenadas centrais desse retângulo como a posição do mouse e da isca robótica, respectivamente, e salve-as como arquivos TXT.
7. Com base nas informações de posição do mouse e da isca do robô em cada quadro, calcule a velocidade do mouse e a distância relativa até a isca do robô e salve esses parâmetros como arquivos TXT.
   NOTA: Considerando o custo de tempo dos cálculos relacionados ao processamento de imagens, a velocidade real de processamento do script é de cerca de 41 fps, o que significa que o sistema pode detectar movimentos de mouse e isca robótica em cerca de 24 ms. O atraso do sistema foi testado entre o envio de um comando de movimento e a detecção de movimento é de 59,4 ± 7,3 ms (n = 8), então o atraso entre o movimento do mouse e o movimento da presa desencadeado pelo mouse é de cerca de 83 ms (os grilos têm um tempo de reação inferior a 250 ms²²).
8. Dependendo da distância relativa entre o mouse e a isca robótica e suas respectivas posições na arena, determine a estratégia de fuga da isca robótica 21,22,23.
   NOTA: Se o mouse estiver relativamente longe da isca robótica (>250 mm), presume-se que a isca robótica esteja em uma zona segura. Suponha que o mouse esteja perto o suficiente da isca robótica (<80 mm, uma vez que a distância relativa neste método é determinada com base no centro do mouse e na isca robótica, ajustamos essa distância limite com base no comprimento do corpo do mouse, aproximadamente 11 cm, e o diâmetro da isca, 4 cm). Nesse caso, é considerada uma captura bem-sucedida e a isca robótica irá parar, permitindo que o mouse consuma os pellets de comida nela (Figura 2A). Na estratégia de fuga em linha reta, se a isca estiver na área central da arena (distância até o limite >75 mm), indicando espaço suficiente em todas as direções de fuga, ela se moverá na direção em que o mouse está se movendo em sua direção. Pelo contrário, se a isca estiver próxima à parede da arena, conforme indicado pela área circundante (distância ao limite ≤75 mm), significando espaço insuficiente para movimento contínuo, ela fará uma curva de 90° para o lado com uma distância maior do limite da arena (mais espaço disponível, Figura 2B). Na estratégia de fuga baseada em turnos, a isca robótica girará 90° para o lado com mais espaço para escapar, julgado em intervalos de 0,5 s (Figura 2C).
9. Depois de determinar a estratégia de escape, faça com que o script Python codifique os sinais de velocidade e direção separadamente e envie-os para o STM32 através da porta serial (ser.port = 'COM3') a uma taxa de bits de 115200.
   NOTA: Os scripts no STM32 são compilados no ambiente C. Quando o sinal de velocidade é recebido, ele é convertido em uma onda PWM da frequência correspondente pelo divisor de frequência do oscilador de cristal e saída (a frequência do cristal STM32 é 72000000). Depois de receber o sinal de direção, o sinal digital é convertido puxando para cima ou para baixo a tensão da porta de saída (0 ou 3.3 V).
10. Use o gravador de porta serial para gravar um programa C compilado no STM32.
11. Use o programa de reinicialização para mover a isca robótica para o centro da arena.
    NOTA: Ao detectar a posição da isca robótica na arena, a isca robótica é continuamente conduzida em direção à posição central (5 cm/s) e, quando uma distância de <20 mm da posição central é detectada, considera-se que atingiu o centro da arena e para de se mover. Execute o programa de reinicialização antes de executar o programa principal.

3. Habituação (Figura 2D)

1. Prenda o mouse por 12 h para reduzir o peso corporal do animal para 90-95% do normal, com livre acesso à água durante este período.
2. Primeiro, execute o programa de reinicialização para mover a isca robótica para o centro da arena e, em seguida, isole o rato faminto na borda da arena com um defletor.
3. Defina o caminho de salvamento do arquivo e a velocidade de movimento da isca robótica (5 cm/s) no programa principal. Em seguida, clique em Executar e observe na janela de vídeo pop-up se os chamarizes do mouse e do robô são reconhecidos de forma estável.
4. Remova o defletor e inicie o cronômetro para observar o comportamento predatório do mouse por 20 min, registrando o tempo em que o mouse pega pela primeira vez uma bolinha de comida da isca robótica. Se o rato não o fizer, pare a isca e coloque-a ao lado do rato para se alimentar.
5. Retorne o rato à gaiola e permita um período de recuperação de 24 horas com livre acesso a comida e água. Em seguida, repita a habituação. Se não houver diferença significativa no tempo até a primeira recuperação do alimento entre dois ensaios consecutivos dentro do mesmo grupo de animais, considere que a habituação está completa. Este período normalmente leva de 3 a 5 tentativas.
6. Após cada habituação, limpe a arena adequadamente com álcool 75% e água.

4. Tarefa de predação (Figura 2D)

1. Comece a tarefa de predação imediatamente após a habituação.
2. Prenda o mouse por 12 h para reduzir o peso corporal do animal para 90-95% do normal, com livre acesso à água durante este período.
3. Primeiro, execute um programa de reinicialização para mover a isca robótica para o centro da arena e, em seguida, isole o rato faminto na borda da arena com um defletor.
4. Defina o caminho de salvamento do arquivo e a velocidade de movimento da isca robótica (0-60 cm/s, velocidades diferentes podem ser definidas de acordo com as necessidades experimentais) no programa principal. Em seguida, clique em Executar e observe na janela de vídeo pop-up se o mouse e a isca robótica são detectados de forma estável.
5. Remova o defletor e inicie o cronômetro para observar o comportamento predatório do mouse por 60 s.
   1. Se o mouse capturar com sucesso a isca robótica dentro de 60 s, feche o programa principal e permita que o mouse coma todos os pellets de comida antes de ser devolvido à gaiola.
   2. Se o mouse não capturar a isca robótica dentro de 60 s, solte o mouse diretamente de volta para a gaiola sem qualquer recompensa ou punição.
6. Realize uma segunda rodada de tarefas de predação 4 horas depois, repetindo as etapas 4.3-4.5.
7. Permita ao rato um período de recuperação de 24 horas com livre acesso a comida e água. Em seguida, repita a tarefa de predação. Se mais de 80% dos camundongos gastam menos de 15 s em dois testes consecutivos, os camundongos são considerados predadores habilidosos.
8. Após cada tarefa de predação, limpe a arena adequadamente com álcool 75% e água.

Para escapar de um predador, a presa geralmente emprega estratégias de fuga flexíveis e variáveis, como alterar a velocidade de fuga ou fugir em direções imprevisíveis 21,22,23. Neste estudo, o padrão de movimento da isca robótica é controlado de forma flexível em velocidade e direção para que possamos alterar a direção de fuga, bem como a velocidade da isca robótica para simular ...

Neste protocolo, para obter controle em tempo real com baixa latência do sistema, usamos o OpnenCV, uma biblioteca de visão computacional leve e eficiente, e um modelo de cores para identificar as posições dos mouses e do chamariz do robô. Isso requer que a iluminação na arena seja relativamente estável e que as sombras na arena sejam evitadas o máximo possível para evitar interferir na detecção dos ratos pretos. Para obter uma detecção de contorno relativamente estável, c...

Os autores não têm nada a divulgar.

Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China para YZ (32171001, 32371050).