설치류의 대립적 추격 행동을 연구하기 위한 실시간 인터랙티브 시스템

여기에서는 마우스 모델에서 포식적 추격 행동을 감지하고 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 플랫폼은 생쥐의 포식적 추격 행동의 역학 및 신경 메커니즘을 연구하기 위한 새로운 연구 패러다임을 제공하고 추격 행동을 연구하기 위한 표준화된 플랫폼을 제공할 것입니다.

포식적 추격 행동은 동물이 먹이를 포획하는 데 성공하는 데 중요한 운동, 학습 및 의사 결정과 같은 일련의 중요한 생리학적 과정을 포함합니다. 그러나 실험실, 특히 일반적으로 사용되는 포유류 모델인 생쥐에서 포식자 추격 행동을 연구하는 방법과 시스템은 거의 없습니다. 이 연구를 제한하는 주요 요인은 살아있는 먹이(예: 귀뚜라미)의 통제 불가능성과 실험 표준을 조화시키는 데 따른 어려움입니다. 이 연구의 목표는 로봇 미끼를 먹은 쥐의 포식자 추격 행동을 감지하고 정량화하는 대화형 플랫폼을 개발하는 것이었습니다. 이 플랫폼은 컴퓨터 비전을 사용하여 마우스와 로봇 미끼의 상대적 위치를 실시간으로 모니터링하여 로봇 미끼의 모션 패턴을 프로그래밍하고, 대화형 2차원 슬라이더는 로봇 미끼의 움직임을 자기적으로 제어하여 폐쇄 루프 시스템을 달성합니다. 로봇 미끼는 접근하는 배고픈 쥐를 실시간으로 피할 수 있으며, 탈출 속도와 방향을 조정하여 다양한 상황에서 포식자 추격 과정을 모방할 수 있습니다. 짧은 기간의 감독되지 않은 훈련(2주 미만) 후, 생쥐는 상대적으로 높은 효율성(15초 미만)으로 포식 작업을 수행할 수 있었습니다. 로봇 미끼와 생쥐의 속도와 궤적과 같은 운동학적 매개변수를 기록함으로써 다양한 조건에서 추적 과정을 정량화할 수 있었습니다. 결론적으로, 이 방법은 포식적 행동 연구를 위한 새로운 패러다임을 제공하며 포식적 추격 행동의 역학과 신경 메커니즘을 더 자세히 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

포식자에 의한 피식자 추적은 생존을 위한 투쟁을 생생하게 보여주는 것일 뿐만 아니라 자연의 생태적 균형과 에너지 흐름을 유지하는 종 진화의 핵심 동인이기도 합니다 ^1,2. 포식자에게 먹이를 쫓는 활동은 다양한 생리적 과정을 포함하는 정교한 노력입니다. 이러한 과정에는 포식자가 사냥을 하도록 유도하는 동기 부여^{상태 3}, 먹이를 감지하고 추적할 수 있는 지각 능력 ^4,5,6 , 사냥의 과정을 지시하는 의사 결정^능력7, 신체적 추격을 가능하게 하는 운동 기능 ^8,9 및 시간이 지남에 따라 사냥 전략을 개선하는 학습 메커니즘 ^{10 등이 포함된다. 11}. 따라서 포식적 추격은 최근 몇 년 동안 중요하고 복잡한 행동 모델로 많은 주목을 받고 있습니다.

실험실에서 널리 사용되는 포유류 모델로서, 생쥐는 자연 서식지와 실험실 연구에서 귀뚜라미를 사냥하는 것으로 기록되어 왔다¹². 그러나 포식자 추적 행동을 정량화하는 데 있어 살아있는 먹이의 다양성과 통제 불가능성은 실험의 재현성뿐만 아니라 다른 실험실 간의 비교 교환을 제한합니다¹³. 첫째, 귀뚜라미 균주는 실험실마다 다를 수 있으며, 이로 인해 추격 행동에 영향을 미칠 수 있는 먹이 특성의 차이가 있을 수 있습니다. 둘째, 개별 귀뚜라미는 포식적 상호작용의 결과에 영향을 미칠 수 있는 독특한 특성을 가지고 있다¹⁴. 예를 들어, 각 귀뚜라미의 탈출 속도가 다르기 때문에 추격 역학이 가변적일 수 있습니다. 또한 일부 귀뚜라미는 경고 거리가 짧을 수 있으며, 이는 포식자가 추격에 참여할 기회가 없을 수 있기 때문에 추격 과정이 부족할 수 있습니다. 마지막으로, 일부 귀뚜라미는 스트레스를 받았을 때 방어적이고 공격적인 행동을 보일 수 있으며, 이는 실험 데이터의 해석을 복잡하게 만든다¹⁵. 포식자 행동의 변화가 피식자의 방어 전략 때문인지 아니면 포식자의 행동 패턴에 내재되어 있는지 판단하기 어렵습니다. 피식자 방어와 포식자 전략 사이의 모호한 경계는 포식자 추격 연구에 또 다른 복잡성을 더합니다.

이러한 한계를 인식한 연구자들은 실험 조건을 통제하고 표준화하는 수단으로 인공 먹이로 눈을 돌렸습니다^16,17. 생쥐를 포함한 7종의 설치류는 인공 먹이에 대해 상당한 포식 행동을 보이는 것으로 나타났다¹³. 따라서 제어 가능한 로봇 미끼는 포식자 추격 행동에 대한 연구에서 실현 가능할 수 있습니다. 다른 인공 먹이를 설계함으로써 연구자들은 살아있는 먹이^18,19에서는 불가능한 실험 조건에 대한 통제력을 발휘할 수 있습니다. 또한, 소수의 선행 연구에서는 인위적으로 제어된 로봇 물고기 또는 먹이를 사용하여 물고기의 무리 행동과 포식을 연구했습니다 15,17,19. 이러한 연구는 실험 연구를 위해 일관되고 반복 가능하며 조작 가능한 자극을 제공하는 로봇 시스템의 가치를 강조했지만, 이러한 발전에도 불구하고 설치류 행동 분야, 특히 생쥐의 경우 로봇 미끼를 사용하여 포식자 추격 행동을 감지하고 정량화하기 위한 전용 플랫폼이 부족합니다.

위와 같은 이유에 따라 우리는 생쥐의 포식자 추격 행동을 연구하기 위해 오픈 소스 실시간 인터랙티브 플랫폼을 설계했습니다. 플랫폼에 있는 로봇 미끼는 실시간으로 쥐로부터 탈출할 수 있으며 로봇 미끼는 제어가 용이하므로 다양한 탈출 방향이나 속도를 설정하여 다양한 포식 시나리오를 시뮬레이션할 수 있습니다. 컴퓨터의 Python 프로그램을 사용하여 로봇 먹이의 모션 매개변수를 생성하고, STM32 마이크로 컨트롤러와 결합하여 서보 모터를 구동하고 로봇 미끼의 움직임을 제어했습니다. 모듈식 하드웨어 시스템은 특정 실험실 환경에 실시간으로 적용할 수 있으며 소프트웨어 시스템은 실험 요구 사항에 따라 연구 목적에 더 잘 부합하도록 시스템의 난이도와 지표를 조정할 수 있습니다. 경량 시스템을 사용하면 컴퓨터 처리 시간을 크게 줄일 수 있으며, 이는 시스템의 효율성에 필수적이며 이식성을 향상시킵니다. 플랫폼은 다음과 같은 기술적 특징을 지원합니다 : 쉬운 반복 및 모델링을위한 유연하고 제어 가능한 인공 먹이; 자연 환경에서 사냥 과정의 최대 시뮬레이션; 실시간 상호 작용 및 낮은 시스템 대기 시간; 하드웨어 및 소프트웨어의 확장성과 확장성; 비용 효율성 및 사용 용이성. 이 플랫폼을 사용하여 다양한 조건에서 포식자 작업을 수행하도록 생쥐를 성공적으로 훈련시켰으며 포식자 추격 중 궤적, 속도 및 상대 거리와 같은 매개변수를 정량화할 수 있었습니다. 이 플랫폼은 포식적 추격 이면의 신경 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 포식적 추격 패러다임을 확립하는 신속한 방법을 제공합니다.

성체 C57BL/6J 마우스(수컷, 6-8주령)는 육군 의과 대학 실험실 동물 센터에서 제공합니다. 모든 실험 절차는 제도적 동물 복지 지침에 따라 수행되며 육군 의과 대학의 동물 관리 및 사용 위원회(No. AMUWEC20210251). 생쥐는 12시간 역 라이트/다크 사이클(20:00-8:00 점등)과 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 온도 조절 조건(22-25°C)에서 사육됩니다.

1. 실시간 인터랙티브 플랫폼을 위한 하드웨어 준비

1. 전체 플랫폼 위의 크로스바에 웹캠을 장착하여 아래 경기장에서 마우스와 로봇 미끼의 위치를 실시간으로 모니터링하고 이미지를 컴퓨터로 전송합니다(그림 1A).
2. 바닥의 정사각형 아크릴 패널과 테두리로 아크릴 튜브로 구성된 대형 원형 경기장(직경 800mm, 높이 300mm)을 디자인합니다. 경기장 내부 벽에 균일한 간격의 4개 아이콘(정사각형, 삼각형, 원 및 십자형)을 배치하여 시각적 단서로 사용합니다(그림 1B).
   알림: 아크릴 튜브의 내벽과 정사각형 아크릴 판의 표면은 불투명 스티커로 덮어야 합니다.
3. 로봇 미끼로 음식 알갱이(5 × 0.2 mg)와 함께 둥근 네오디뮴 자석(직경 40mm, 높이 10mm, 귀뚜라미 길이 약 2-4cm, ^4,22)을 사용합니다. 식별 및 위치를 위해 자석 표면에 파란색 스티커를 부착합니다.
4. 경기장 아래에 2차원 슬라이더(유효 이동 거리 1000mm)를 장착합니다. 캐리어에 또 다른 네오디뮴 자석을 당기는 자석으로 설치하여 로봇 미끼를 자기 및 원격으로 당깁니다.
5. 풀러 자석을 STM32 보드와 스위칭 회로로 제어되는 서보 모터로 구동합니다. 속도 방향 모드를 사용하여 서보 모터(16,000펄스당 75mm)를 구동하면 STM32 기판의 출력 포트에서 PWM 파형의 주파수가 속도를 인코딩하고 높음 또는 낮은 레벨(3.3V 또는 0V)이 순방향 또는 역방향을 인코딩합니다(그림 1C).
   알림: 스위칭 회로는 보충 그림 1에 나와 있으며, 한 슬라이드의 이동과 다른 슬라이드의 제어에 필요한 속도 및 방향 신호 연결 다이어그램만 동일한 방식으로 보여줍니다. 두 슬라이드 제어 회로의 접지선은 함께 연결할 수 있습니다.

2. 실시간 인터랙티브 플랫폼을 위한 소프트웨어 설계

1. 메인 프로그램을 사용하여 마우스와 로봇 미끼의 상대적 위치를 감지하고 로봇 미끼의 모션 신호를 STM32 마이크로 컨트롤러로 전송합니다(그림 1D).
2. 컴퓨터가 웹캠에서 이미지를 수신하면 Python 환경에서 프레임을 처리합니다.
3. OpenCV²⁰ 모듈(cv2.cvtColor)을 사용하여 RGB 색상 모델의 각 프레임을 HSV 색상 모델로 변환합니다.
   참고: 생쥐는 야행성 수렵 동물이기 때문에 식별의 안정성을 위해 실험은 낮고 안정적인 조명 조건에서 수행되어야 하며, 경기장에서 일관된 조명 조건을 보장하고 부분적인 그림자를 피해야 합니다. 이 실험의 조도는 약 95lux였습니다.
4. 각각 HSV 색상 모델(cv2.inRange)의 색상 범위를 기반으로 마우스와 로봇 미끼의 마스크 이미지를 획득합니다.
5. 마스크 이미지에 중앙값 필터링을 적용하여 마우스와 로봇 미끼의 윤곽을 더 선명하고 안정적으로 만듭니다(cv2.medianBlur).
6. 윤곽 감지 기능(cv2.findContours)을 사용하여 마우스와 로봇 미끼의 윤곽 정보를 얻은 다음 윤곽 영역을 덮을 수 있는 최소 사각형을 찾습니다. 이 사각형의 중심 좌표를 각각 마우스와 로봇 미끼의 위치로 사용하고 TXT 파일로 저장합니다.
7. 각 프레임에서 마우스와 로봇 미끼의 위치 정보를 기반으로 마우스의 속도와 로봇 미끼까지의 상대적 거리를 계산하고 이러한 매개변수를 TXT 파일로 저장합니다.
   참고: 이미지 처리와 관련된 계산의 시간 비용을 고려할 때 스크립트의 실제 처리 속도는 약 41fps이며, 이는 시스템이 약 24ms에서 마우스 및 로봇 미끼 움직임을 감지할 수 있음을 의미합니다. 모션 명령을 보내고 움직임을 감지하는 사이의 시스템 지연은 59.4 ± 7.3 ms (n = 8)이므로 마우스의 움직임과 마우스에 의해 유발 된 먹이 움직임 사이의 지연은 약 83ms입니다 (귀뚜라미의 반응 시간은 250ms 미만입니다²²).
8. 마우스와 로봇 미끼 사이의 상대적 거리와 경기장에서의 각각의 위치에 따라 로봇 미끼의 탈출 전략을 결정하십시오 21,22,23.
   참고: 마우스가 로봇 미끼(>250mm)에서 비교적 멀리 떨어져 있으면 로봇 미끼가 안전 지대에 있는 것으로 간주됩니다. 마우스가 로봇 미끼(<80mm, 이 방법의 상대 거리는 마우스와 로봇 루어의 중심을 기준으로 결정되므로 마우스의 몸체 길이(약 11cm)와 루어의 지름(4cm)을 기준으로 이 임계값 거리를 조정했습니다. 이 경우 성공적인 포획으로 간주되며 로봇 미끼가 중지되어 마우스가 미끼에 있는 음식 알갱이를 섭취할 수 있습니다(그림 2A). 직선 탈출 전략에서 미끼가 경기장의 중앙 영역(경계까지의 거리 >75mm)에 있고 모든 탈출 방향에서 충분한 공간을 나타내는 경우 마우스가 자신을 향해 이동하는 방향으로 이동합니다. 반대로, 미끼가 주변 지역(경계까지의 거리 ≤75mm)에서 알 수 있듯이 경기장 벽에 가까우면 지속적인 이동을 위한 공간이 충분하지 않음을 나타내며 경기장 경계까지 더 먼 거리(더 많은 사용 가능한 공간, 그림 2B)로 측면으로 90° 회전합니다. 턴 기반 탈출 전략에서 로봇 미끼는 0.5초 간격으로 판단하여 탈출할 수 있는 더 많은 공간을 확보하면서 측면으로 90° 회전합니다(그림 2C).
9. 탈출 전략을 결정한 후 Python 스크립트가 속도 및 방향 신호를 별도로 인코딩하고 직렬 포트(ser.port = 'COM3')를 통해 115200의 비트 전송률로 STM32로 보내도록 합니다.
   참고: STM32의 스크립트는 C 환경에서 컴파일됩니다. 속도 신호가 수신되면 수정 발진기 주파수 분배기 및 출력에 의해 해당 주파수의 PWM 파로 변환됩니다(STM32 수정 주파수는 72000000). 방향 신호를 수신한 후 디지털 신호는 출력 포트의 전압(0 또는 3.3V)을 위 또는 아래로 당겨 변환됩니다.
10. 직렬 포트 버너를 사용하여 컴파일된 C 프로그램을 STM32에 굽습니다.
11. 리셋 프로그램을 사용하여 로봇 미끼를 경기장 중앙으로 이동하세요.
    참고: 경기장에서 로봇 미끼의 위치를 감지하여 로봇 미끼는 중앙 위치(5cm/s)를 향해 지속적으로 구동되며, 중앙 위치에서 <20mm의 거리가 감지되면 경기장 중앙에 도달한 것으로 간주되어 움직임을 멈춥니다. 메인 프로그램을 실행하기 전에 재설정 프로그램을 실행하십시오.

3. 습관화(그림 2D)

1. 마우스를 12시간 동안 고정하여 동물의 체중을 정상의 90-95%로 줄이고 이 기간 동안 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다.
2. 먼저 리셋 프로그램을 실행하여 로봇 미끼를 경기장 중앙으로 이동한 다음 배플을 사용하여 경기장 가장자리에 있는 배고픈 쥐를 격리합니다.
3. 메인 프로그램에서 파일의 저장 경로와 로봇 미끼의 이동 속도(5cm/s)를 설정합니다. 그런 다음 Run을 클릭하고 팝업 비디오 창에서 마우스와 로봇 미끼가 안정적으로 인식되는지 확인합니다.
4. 배플을 제거하고 타이머를 시작하여 20분 동안 마우스의 포식 행동을 관찰하고 마우스가 로봇 미끼에서 음식 알갱이를 처음 가져간 시간을 기록합니다. 마우스가 그렇게 하지 않으면 미끼를 멈추고 먹이를 주기 위해 마우스 옆에 놓습니다.
5. 쥐를 우리로 되돌리고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 24시간 회복 기간을 허용합니다. 그런 다음 습관화를 반복하십시오. 동일한 동물 그룹 내에서 두 번의 연속 시험 간에 첫 번째 먹이 채취까지의 시간에 큰 차이가 없는 경우, 습관화가 완료된 것으로 간주합니다. 이 기간은 일반적으로 3-5번의 시도가 소요됩니다.
6. 습관화할 때마다 75% 알코올과 물로 경기장을 적절하게 청소하십시오.

4. 포식 작업(그림 2D)

1. 습관화 직후 포식 작업을 시작하십시오.
2. 마우스를 12시간 동안 고정하여 동물의 체중을 정상의 90-95%로 줄이고 이 기간 동안 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다.
3. 먼저 리셋 프로그램을 실행하여 로봇 미끼를 경기장 중앙으로 옮긴 다음 배플을 사용하여 경기장 가장자리에 있는 배고픈 쥐를 격리합니다.
4. 메인 프로그램에서 파일의 저장 경로와 로봇 미끼의 이동 속도(0-60cm/s, 실험 요구에 따라 다른 속도 설정 가능)를 설정합니다. 그런 다음 실행을 클릭하고 팝업 비디오 창에서 마우스와 로봇 미끼가 안정적으로 감지되는지 확인합니다.
5. 배플을 제거하고 타이머를 시작하여 60초 동안 마우스의 포식 행동을 관찰합니다.
   1. 마우스가 60초 이내에 로봇 미끼를 성공적으로 잡으면 메인 프로그램을 닫고 마우스가 케이지로 돌아가기 전에 모든 음식 알갱이를 먹도록 합니다.
   2. 마우스가 60초 이내에 로봇 미끼를 잡지 못하면 보상이나 처벌 없이 마우스를 케이지에 직접 풀어줍니다.
6. 4시간 후에 4.3-4.5단계를 반복하여 두 번째 포식 작업을 수행합니다.
7. 쥐가 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 24시간 동안 회복 기간을 허용합니다. 그런 다음 포식 작업을 반복합니다. 두 번의 연속 시도에서 80% 이상의 마우스가 15초 미만을 소비하면 마우스는 숙련된 포식자로 간주됩니다.
8. 각 포식 작업이 끝나면 75%의 알코올과 물로 경기장을 적절하게 청소하십시오.

포식자로부터 도망치기 위해 피식자는 종종 탈출 속도를 변경하거나 예측할 수 없는 방향으로 도망치는 것과 같은 유연하고 가변적인 탈출 전략을 사용합니다 21,22,23. 본 연구에서는 로봇 미끼의 이동 패턴을 속도와 방향에서 유연하게 제어하여 탈출 방향과 로봇 미끼의 속도를 변경하여 각각 다른 ?...

이 프로토콜에서는 낮은 시스템 대기 시간으로 실시간 제어를 달성하기 위해 가볍고 효율적인 컴퓨터 비전 라이브러리인 OpnenCV와 색상 모델을 사용하여 마우스와 로봇 미끼의 위치를 식별합니다. 이를 위해서는 경기장의 조명이 비교적 안정적이어야 하고 경기장의 그림자를 최대한 피하여 검은 쥐의 감지를 방해하지 않도록 해야 합니다. 비교적 안정적인 윤곽 감지를 ?...

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이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China)의 지원을 받아 YZ에 지원되었다(32171001, 32371050).