Ein interaktives Echtzeitsystem zur Untersuchung des konfrontativen Verfolgungsverhaltens bei Nagetieren

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um räuberisches Verfolgungsverhalten in einem Mausmodell zu erkennen und zu quantifizieren. Diese Plattform bietet ein neues Forschungsparadigma für die Untersuchung der Dynamik und der neuronalen Mechanismen des räuberischen Verfolgungsverhaltens bei Mäusen und wird eine standardisierte Plattform für die Untersuchung des Verfolgungsverhaltens bieten.

Räuberisches Verfolgungsverhalten umfasst eine Reihe wichtiger physiologischer Prozesse wie Fortbewegung, Lernen und Entscheidungsfindung, die für den Erfolg eines Tieres beim Fangen von Beute entscheidend sind. Es gibt jedoch nur wenige Methoden und Systeme, um das räuberische Verfolgungsverhalten im Labor zu untersuchen, insbesondere bei Mäusen, einem häufig verwendeten Säugetiermodell. Die Hauptfaktoren, die diese Forschung einschränken, sind die Unkontrollierbarkeit von lebender Beute (z.B. Grillen) und die Herausforderung, experimentelle Standards zu harmonisieren. Das Ziel dieser Studie war es, eine interaktive Plattform zu entwickeln, um räuberisches Verfolgungsverhalten bei Mäusen auf einem Roboterköder zu erkennen und zu quantifizieren. Die Plattform nutzt Computer Vision, um die relativen Positionen der Maus und des Roboterköders in Echtzeit zu überwachen, um die Bewegungsmuster des Roboterköders zu programmieren, und die interaktiven zweidimensionalen Schieberegler steuern magnetisch die Bewegung des Roboterköders, um ein geschlossenes System zu erreichen. Der Roboterköder ist in der Lage, sich nähernden hungrigen Mäusen in Echtzeit auszuweichen, und seine Fluchtgeschwindigkeit und -richtung können angepasst werden, um den räuberischen Verfolgungsprozess in verschiedenen Kontexten nachzuahmen. Nach einer kurzen Zeit unbeaufsichtigten Trainings (weniger als zwei Wochen) waren die Mäuse in der Lage, die Räuberaufgabe mit einer relativ hohen Effizienz (weniger als 15 s) durchzuführen. Durch die Aufzeichnung kinematischer Parameter wie Geschwindigkeit und Flugbahnen des Roboterköders und der Mäuse konnten wir den Verfolgungsprozess unter verschiedenen Bedingungen quantifizieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode ein neues Paradigma für die Untersuchung von räuberischem Verhalten darstellt und zur weiteren Untersuchung der Dynamik und der neuronalen Mechanismen des räuberischen Verfolgungsverhaltens verwendet werden kann.

Die Jagd nach Beute durch Raubtiere ist nicht nur ein anschauliches Beispiel für den Kampf ums Überleben, sondern auch ein wichtiger Motor der Evolution der Arten, der das ökologische Gleichgewicht und den Energiefluss in der Natur aufrechterhält ^1,2. Für Raubtiere ist die Verfolgung von Beute ein anspruchsvolles Unterfangen, das eine Vielzahl physiologischer Prozesse umfasst. Zu diesen Prozessen gehören die Motivationszustände, die das Raubtier zur Jagd antreiben³, die Wahrnehmungsfähigkeiten, die es ihm ermöglichen, Beute zu erkennen und zu verfolgen ^4,5,6, die Entscheidungsfähigkeiten, die den Verlauf der Jagd bestimmen⁷, die Bewegungsfunktion, die die körperliche Verfolgung ermöglicht ^8,9 und die Lernmechanismen, die die Jagdstrategien im Laufe der Zeit verfeinern ^{10, 11}. Anmelden Daher hat die räuberische Verfolgung in den letzten Jahren als wichtiges und komplexes Verhaltensmodell viel Aufmerksamkeit erhalten.

Als weit verbreitetes Säugetiermodell im Labor wurde dokumentiert, dass Mäuse Grillen sowohl in ihrem natürlichen Lebensraum als auch in Laborstudien jagen¹². Die Vielfalt und die Unkontrollierbarkeit der lebenden Beute bei der Quantifizierung des Jagdverhaltens schränkt jedoch die Reproduzierbarkeit von Experimenten sowie den Austausch von Vergleichen zwischen verschiedenen Laboratorien^{ein 13}. Erstens können Grillenstämme von Labor zu Labor unterschiedlich sein, was zu Unterschieden in den Beutemerkmalen führt, die das Verfolgungsverhalten beeinflussen könnten. Zweitens haben einzelne Grillen einzigartige Eigenschaften, die das Ergebnis räuberischer Interaktionen beeinflussen können¹⁴. Zum Beispiel kann die Fluchtgeschwindigkeit jeder Grille unterschiedlich sein, was zu einer Variabilität in der Verfolgungsdynamik führt. Darüber hinaus können einige Grillen einen kurzen Warnabstand haben, was zu einem Mangel an Verfolgungsprozess führen kann, da das Raubtier möglicherweise nicht die Möglichkeit hat, die Verfolgung aufzunehmen. Schließlich können einige Grillen bei Stress ein defensives, aggressives Verhalten zeigen, was die Interpretation der experimentellen Daten erschwert¹⁵. Es ist schwierig zu bestimmen, ob Veränderungen im Verhalten von Raubtieren auf die Abwehrstrategien der Beute zurückzuführen sind oder den Verhaltensmustern des Raubtiers inhärent sind. Diese verschwommene Grenze zwischen Beuteverteidigung und Raubtierstrategien fügt der Erforschung der Raubjagd eine weitere Komplexitätsebene hinzu.

In Anbetracht dieser Einschränkungen haben sich die Forscher der künstlichen Beute zugewandt, um die Versuchsbedingungen zu kontrollieren und zu standardisieren^16,17. Sieben Nagetierarten, darunter Mäuse, zeigten nachweislich ein signifikantes räuberisches Verhalten gegenüber künstlicher Beute¹³. Daher könnte ein kontrollierbarer Roboterköder bei der Untersuchung des räuberischen Verfolgungsverhaltens praktikabel sein. Durch die Konstruktion verschiedener künstlicher Beutetiere können die Forscher ein gewisses Maß an Kontrolle über die Versuchsbedingungen ausüben, was bei lebender Beute nicht möglich ist^18,19. Darüber hinaus wurde in einer kleinen Anzahl früherer Studien künstlich gesteuerte Roboterfische oder Beutetiere verwendet, um das Schwarmverhalten und die Prädation bei Fischen zu untersuchen 15,17,19. Diese Studien haben den Wert von Robotersystemen bei der Bereitstellung konsistenter, wiederholbarer und manipulierbarer Reize für die experimentelle Forschung hervorgehoben, aber trotz dieser Fortschritte fehlt auf dem Gebiet des Nagetierverhaltens, insbesondere bei Mäusen, eine spezielle Plattform zur Erkennung und Quantifizierung von räuberischem Jagdverhalten mit Roboterködern.

Aus den oben genannten Gründen haben wir eine interaktive Open-Source-Echtzeitplattform entwickelt, um das räuberische Verfolgungsverhalten von Mäusen zu untersuchen. Der Roboterköder auf der Plattform kann in Echtzeit von den Mäusen entkommen, und der Roboterköder ist hochgradig kontrollierbar, so dass wir verschiedene Fluchtrichtungen oder Geschwindigkeiten einstellen können, um verschiedene Prädationsszenarien zu simulieren. Zur Generierung der Bewegungsparameter der robotischen Beute wurde ein Python-Programm auf dem Computer verwendet, das mit einem STM32-Mikrocontroller kombiniert wurde, um die Servomotoren anzutreiben und die Bewegung des robotischen Köders zu steuern. Das modulare Hardwaresystem kann in Echtzeit an die spezifische Laborumgebung angepasst werden, und das Softwaresystem kann die Schwierigkeit des Systems sowie die Indikatoren anpassen, um den Forschungszweck entsprechend den experimentellen Anforderungen besser zu erfüllen. Das leichte System ermöglicht eine deutliche Reduzierung der Rechenzeit des Computers, was für die Effektivität des Systems unerlässlich ist und seine Portabilität verbessert. Die Plattform unterstützt die folgenden technischen Merkmale: flexible und kontrollierbare künstliche Beute für einfache Wiederholung und Modellierung; maximale Simulation des Jagdprozesses in einer natürlichen Umgebung; Echtzeit-Interaktion und geringe Systemlatenz; die Skalierbarkeit von Hard- und Software sowie die Skalierbarkeit; Wirtschaftlichkeit und Benutzerfreundlichkeit. Mit dieser Plattform haben wir Mäuse erfolgreich darauf trainiert, räuberische Aufgaben unter verschiedenen Bedingungen auszuführen und konnten Parameter wie Flugbahn, Geschwindigkeit und relative Distanz während der Jagd auf Raubtiere quantifizieren. Die Plattform bietet eine schnelle Methode zur Etablierung eines räuberischen Verfolgungsparadigmas, um die neuronalen Mechanismen hinter der räuberischen Verfolgung weiter zu untersuchen.

Erwachsene C57BL/6J-Mäuse (männlich, 6-8 Wochen alt) werden vom Army Medical University Laboratory Animal Center zur Verfügung gestellt. Alle Versuchsverfahren werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des institutionellen Tierschutzes durchgeführt und sind vom Animal Care and Use Committee der Army Medical University (Nr. AMUWEC20210251). Die Mäuse werden unter temperaturkontrollierten Bedingungen (22-25 °C) mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Umkehrzyklus (Licht an 20:00-8:00 Uhr) und freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten.

1. Hardwarevorbereitung für interaktive Echtzeitplattform

1. Montieren Sie eine Webcam an einer Querstange über der gesamten Plattform, um die Positionen der Maus und des Roboterköders in der Arena darunter in Echtzeit zu überwachen und die Bilder an den Computer zu übertragen (Abbildung 1A).
2. Entwerfen Sie eine große kreisförmige Arena (800 mm Durchmesser, 300 mm Höhe), bestehend aus einer quadratischen Acrylplatte an der Unterseite und einem Acrylrohr als Umrandung. Platzieren Sie gleichmäßig verteilte vier Symbole (Quadrat, Dreieck, Kreis und Kreuz) an den Innenwänden der Arena, die als visuelle Hinweise dienen (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Die Innenwand des Acrylrohrs und die Oberfläche der quadratischen Acrylplatte müssen mit einem undurchsichtigen Aufkleber bedeckt werden.
3. Verwenden Sie einen runden Neodym-Magneten (40 mm Durchmesser, 10 mm Höhe, Grillen sind ca. 2-4 cm lang ^4,22) mit Futterpellets (5 × 0,2 mg) als Roboterköder. Bringen Sie einen blauen Aufkleber zur Identifizierung und Positionierung auf der Oberfläche des Magneten an.
4. Montieren Sie einen zweidimensionalen Schieber (mit einem effektiven Verfahrweg von 1000 mm) unter der Arena. Installieren Sie einen weiteren Neodym-Magneten auf seinem Träger als Zugmagnet, um den Roboterköder magnetisch und ferngesteuert zu ziehen.
5. Antrieb des Abziehmagneten durch Servomotoren, die von einer STM32-Platine und einem Schaltkreis gesteuert werden. Bei Verwendung des Drehzahl-Richtungs-Modus zur Ansteuerung eines Servomotors (75 mm pro 16.000 Impulse) kodiert die Frequenz der PWM-Welle am Ausgangsanschluss der STM32-Platine die Drehzahl, und die hohen oder niedrigen Pegel (3,3 V oder 0 V) kodieren die Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Der Schaltkreis ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt, die nur den Anschlussplan für das Geschwindigkeits- und Richtungssignal zeigt, der für die Bewegung eines Schlittens und die Steuerung des anderen Schlittens auf die gleiche Weise erforderlich ist. Die Massedrähte in den beiden Schiebeschaltkreisen können miteinander verbunden werden.

2. Softwaredesign für interaktive Echtzeit-Plattform

1. Verwenden Sie das Hauptprogramm, um die relative Position der Maus und des Roboterköders zu erkennen und das Bewegungssignal des Roboterköders an den STM32-Mikrocontroller zu übertragen (Abbildung 1D).
2. Wenn der Computer Bilder von der Webcam empfängt, verarbeiten Sie die Frames in der Python-Umgebung.
3. Konvertieren Sie jeden Frame mit dem OpenCV^20-Modul (cv2.cvtColor) vom RGB-Farbmodell in das HSV-Farbmodell.
   HINWEIS: Da Mäuse nachtaktive Sammler sind und die Identifizierung stabil ist, sollten die Versuche unter Bedingungen geringer und stabiler Beleuchtung durchgeführt werden, um gleichbleibende Lichtverhältnisse in der Arena zu gewährleisten und Teilschatten zu vermeiden. Die Beleuchtung in diesem Experiment betrug etwa 95 Lux.
4. Erfassen Sie Maskenbilder der Maus und des Roboterköders basierend auf ihren Farbbereichen im HSV-Farbmodell (cv2.inRange).
5. Wenden Sie die Medianfilterung auf das Maskenbild an, um die Konturen der Maus und des Roboterköders klarer und stabiler zu machen (cv2.medianBlur).
6. Rufen Sie die Konturinformationen der Maus und des Roboterköders mit der Konturerkennungsfunktion (cv2.findContours) ab und suchen Sie dann ein minimales Rechteck, das den Konturbereich abdecken kann. Verwenden Sie die Mittelkoordinaten dieses Rechtecks als Position der Maus bzw. des Roboterköders und speichern Sie sie als TXT-Dateien.
7. Berechnen Sie basierend auf den Positionsinformationen der Maus und des Roboterköders in jedem Frame die Geschwindigkeit der Maus und den relativen Abstand zum Roboterköder und speichern Sie diese Parameter als TXT-Dateien.
   HINWEIS: Unter Berücksichtigung des Zeitaufwands für Berechnungen im Zusammenhang mit der Bildverarbeitung beträgt die tatsächliche Verarbeitungsgeschwindigkeit des Skripts etwa 41 fps, was bedeutet, dass das System Maus- und Roboterköderbewegungen in etwa 24 ms erkennen kann. Getestet wurde die Systemverzögerung zwischen dem Senden eines Bewegungsbefehls und dem Erkennen einer Bewegung von 59,4 ± 7,3 ms (n = 8), so dass die Verzögerung zwischen der Mausbewegung und der von der Maus ausgelösten Beutebewegung etwa 83 ms beträgt (Grillen haben eine Reaktionszeit von weniger als 250 ms²²).
8. Abhängig von der relativen Entfernung zwischen der Maus und dem Roboterköder und ihren jeweiligen Positionen in der Arena wird die Fluchtstrategie des Roboterköders 21,22,23 bestimmt.
   HINWEIS: Wenn die Maus relativ weit vom Roboterköder entfernt ist (>250 mm), wird davon ausgegangen, dass sich der Roboterköder in einer sicheren Zone befindet. Angenommen, die Maus befindet sich nahe genug am Roboterköder (<80 mm, da der relative Abstand bei dieser Methode anhand der Mitte der Maus und des Roboterköders bestimmt wird, haben wir diesen Schwellenabstand basierend auf der Körperlänge der Maus (ca. 11 cm) und dem Durchmesser des Köders (4 cm) angepasst. In diesem Fall wird es als erfolgreicher Fang angesehen, und der Roboterköder stoppt, sodass die Maus die darauf befindlichen Futterpellets verzehren kann (Abbildung 2A). Wenn sich der Köder bei der geradlinigen Fluchtstrategie im mittleren Bereich der Arena befindet (Abstand zur Begrenzung >75 mm), was auf ausreichend Platz in allen Fluchtrichtungen hinweist, bewegt er sich in die Richtung, in die sich die Maus auf sich selbst zubewegt. Im Gegenteil, wenn sich der Köder in der Nähe der Arenawand befindet, wie es die Umgebung anzeigt (Abstand zur Begrenzung ≤75 mm), was bedeutet, dass nicht genügend Platz für eine kontinuierliche Bewegung vorhanden ist, macht er eine 90°-Drehung zur Seite mit einem größeren Abstand zur Arenagrenze (mehr verfügbarer Platz, Abbildung 2B). Bei der rundenbasierten Fluchtstrategie dreht sich der Roboterköder um 90° zur Seite und bietet mehr Platz zum Entkommen, gemessen in Abständen von 0,5 s (Abbildung 2C).
9. Nach dem Festlegen der Escape-Strategie lassen Sie das Python-Skript die Geschwindigkeits- und Richtungssignale separat codieren und über die serielle Schnittstelle (ser.port = 'COM3') mit einer Bitrate von 115200 an den STM32 senden.
   HINWEIS: Skripts in STM32 werden in der C-Umgebung kompiliert. Wenn das Drehzahlsignal empfangen wird, wird es durch den Frequenzteiler und -ausgang des Quarzoszillators in eine PWM-Welle der entsprechenden Frequenz umgewandelt (die Quarzfrequenz des STM32 beträgt 72000000). Nach dem Empfang des Richtungssignals wird das digitale Signal umgewandelt, indem die Spannung des Ausgangsanschlusses (0 oder 3,3 V) nach oben oder unten gezogen wird.
10. Verwenden Sie den Brenner der seriellen Schnittstelle, um ein kompiliertes C-Programm auf den STM32 zu brennen.
11. Verwenden Sie das Reset-Programm, um den Roboterköder in die Mitte der Arena zu bewegen.
    HINWEIS: Durch die Erkennung der Position des Roboterköders in der Arena wird der Roboterköder kontinuierlich in Richtung der Mittelposition (5 cm/s) gefahren, und wenn ein Abstand von <20 mm von der Mittelposition erkannt wird, wird davon ausgegangen, dass er die Mitte der Arena erreicht hat und sich nicht mehr bewegt. Führen Sie das Reset-Programm aus, bevor Sie das Hauptprogramm ausführen.

3. Gewöhnung (Abbildung 2D)

1. Befestigen Sie die Maus 12 Stunden lang, um das Körpergewicht des Tieres auf 90-95% des Normalgewichts zu reduzieren, wobei Sie in dieser Zeit freien Zugang zu Wasser haben.
2. Führen Sie zuerst das Reset-Programm aus, um den Roboterköder in die Mitte der Arena zu bewegen, und isolieren Sie dann die hungrige Maus am Rand der Arena mit einer Schallwand.
3. Stellen Sie im Hauptprogramm den Speicherpfad der Datei und die Bewegungsgeschwindigkeit des Roboterköders (5 cm/s) ein. Klicken Sie dann auf Ausführen und beobachten Sie im Popup-Videofenster, ob die Maus und die Roboterköder stabil erkannt werden.
4. Entfernen Sie die Schallwand und starten Sie den Timer, um das räuberische Verhalten der Maus 20 Minuten lang zu beobachten, und zeichnen Sie die Zeit auf, zu der die Maus zum ersten Mal ein Futterpellet aus dem Roboterköder nimmt. Wenn die Maus dies nicht tut, stoppen Sie den Köder und legen Sie ihn zum Füttern neben die Maus.
5. Setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig ein und gönnen Sie sich eine 24-stündige Erholungsphase mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Wiederholen Sie dann die Gewöhnung. Gibt es keinen signifikanten Unterschied in der Zeit bis zur ersten Futterentnahme zwischen zwei aufeinanderfolgenden Versuchen innerhalb derselben Tiergruppe, so ist davon auszugehen, dass die Gewöhnung abgeschlossen ist. Dieser Zeitraum dauert in der Regel 3-5 Versuche.
6. Reinigen Sie die Arena nach jeder Gewöhnung ordnungsgemäß mit 75% Alkohol und Wasser.

4. Aufgabe der Prädation (Abbildung 2D)

1. Beginne sofort nach der Gewöhnung mit der Raubtieraufgabe.
2. Befestigen Sie die Maus 12 Stunden lang, um das Körpergewicht des Tieres auf 90-95% des Normalgewichts zu reduzieren, wobei Sie in dieser Zeit freien Zugang zu Wasser haben.
3. Führen Sie zuerst ein Reset-Programm aus, um den Roboterköder in die Mitte der Arena zu bewegen, und isolieren Sie dann die hungrige Maus am Rand der Arena mit einer Schallwand.
4. Stellen Sie den Speicherpfad der Datei und die Bewegungsgeschwindigkeit des Roboterköders (0-60 cm/s, verschiedene Geschwindigkeiten können je nach experimentellem Bedarf eingestellt werden) im Hauptprogramm ein. Klicken Sie dann auf Ausführen und beobachten Sie im Popup-Videofenster, ob die Maus und der Roboterköder stabil erkannt werden.
5. Entfernen Sie die Schallwand und starten Sie den Timer, um das räuberische Verhalten der Maus 60 s lang zu beobachten.
   1. Wenn die Maus den Roboterköder innerhalb von 60 s erfolgreich einfängt, schließen Sie das Hauptprogramm und lassen Sie die Maus alle Futterpellets fressen, bevor sie in den Käfig zurückgebracht wird.
   2. Wenn die Maus den Roboterköder nicht innerhalb von 60 s fängt, lassen Sie die Maus ohne Belohnung oder Bestrafung direkt wieder in den Käfig zurück.
6. Führen Sie 4 Stunden später eine zweite Runde von Raubtieraufgaben durch und wiederholen Sie die Schritte 4.3-4.5.
7. Gönnen Sie der Maus eine 24-stündige Erholungsphase mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Wiederholen Sie dann die Raubtieraufgabe. Wenn mehr als 80% der Mäuse in zwei aufeinanderfolgenden Versuchen weniger als 15 s verbringen, gelten die Mäuse als geschickte Raubtiere.
8. Reinigen Sie die Arena nach jeder Raubaufgabe ordnungsgemäß mit 75% Alkohol und Wasser.

Um einem Raubtier zu entkommen, verwendet die Beute oft flexible und variable Fluchtstrategien, wie z. B. das Ändern der Fluchtgeschwindigkeit oder die Flucht in unvorhersehbare Richtungen 21,22,23. In dieser Studie wird das Bewegungsmuster des Roboterköders flexibel in Geschwindigkeit und Richtung gesteuert, so dass wir sowohl die Fluchtrichtung als auch die Geschwindigkeit des Roboterköders...

Um eine Echtzeitsteuerung mit geringer Systemlatenz zu erreichen, verwenden wir in diesem Protokoll OpnenCV, eine leichtgewichtige und effiziente Computer-Vision-Bibliothek, und ein Farbmodell, um die Positionen der Mäuse und des Roboterköders zu identifizieren. Dies setzt voraus, dass die Beleuchtung in der Arena relativ stabil ist und die Schatten in der Arena so weit wie möglich vermieden werden, um die Erkennung der schwarzen Mäuse nicht zu beeinträchtigen. Um eine relativ stabi...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Studie wird von der National Natural Science Foundation of China to YZ (32171001, 32371050) unterstützt.