Модель односторонней обструкции мочеточника для исследования интерстициального фиброза почек

В этом протоколе описан метод индуцирования односторонней обструкции мочеточника (НН) у мышей для изучения прогрессирования фиброза тканей при обструктивной нефропатии. Он включает в себя хирургические процедуры, послеоперационный уход и методы оценки фиброза.

Фиброз почек является конечным патологическим последствием прогрессирующей хронической болезни почек (ХБП). Модель односторонней обструкции мочеточника (НН) широко используется для выяснения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе интерстициального фиброза почек, и для выявления потенциальных терапевтических мишеней. Эта модель была установлена на мышах с помощью хирургического лигирования одностороннего мочеточника, процедуры, которая относительно проста и проста в выполнении. Тем не менее, известно, что мышиная модель UUO демонстрирует значительную изменчивость и непостоянство, на которые влияют такие факторы, как деформация мыши, возраст, пол, тип анестезии, продолжительность операции, температура тела во время процедуры, хирургические навыки оператора, условия кормления и общее состояние здоровья мышей. Различия в хирургических техниках, наложении швов и продолжительности обструкции способствуют вариабельности результатов. Кроме того, непоследовательный отбор проб из обструктивных почек еще больше увеличивает вариабельность в оценке фиброза почек. В этом исследовании описывается процесс разработки мышиной модели UUO и оценки интерстициального фиброза, обсуждаются технические проблемы, способствующие непредсказуемости модели, и предлагаются потенциальные решения. Эти выводы направлены на создание более стандартизированного и универсально применимого подхода к исследованию фиброза почек.

Хроническая болезнь почек (ХБП) поражает более 10% населения мира, и ее распространенность^{растет1}. Различные заболевания мочевыводящих путей, включая врожденные анатомические аномалии, нефролитиаз, гиперплазию предстательной железы и опухоли мочевого пузыря, могут приводить к обструкции мочеточника². В результате, мышиная модель односторонней обструкции мочеточника (UUO) является ключевым инструментом для выявления новых механизмов интерстициального фиброза почек, понимания прогрессирования заболевания и оценки потенциальных стратегий лечения. Он широко использовался для исследования происхождения миофибробластов, субкластеров (мио)фибробластов, метаболизма канальцевых клеток и остановки клеточного цикла, частичного эпителиально-мезенхимального перехода и других связанных с ним процессов 3,4,5,6,7,8.

В дополнение к интерстициальному фиброзу почек, индуцированному UUO, другие часто используемые модели интерстициального фиброза почек у грызунов включают модели, индуцированные токсинами, например, с использованием аристолоховой кислоты, фолиевой кислоты и аденина, а также хирургически индуцированные модели, такие как нефрэктомия 5/6 и ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ). Модель UUO имеет ряд преимуществ по сравнению с альтернативными моделями фиброза почек. Например, вызванный токсинами фиброз почек требует относительно длительного периода моделирования (примерно 1-2 месяца), а его токсические побочные эффекты на другие органы могут осложнить ^{исследование механизмов} фиброза^. Хирургически индуцированные модели, такие как нефрэктомия 5/6, могут привести к значительному кровотечению из почек и инфекции, увеличивая риск послеоперационной смертности. Кроме того, степень индуцированного интерстициального фиброза напрямую коррелирует с объемом резецированной почечной ткани, что затрудняет последовательное воспроизведение одной и той же степени фиброза у каждой мыши^.

Почечная модель IRI является основным методом индуцирования острого повреждения почек при ХБП и имеет значительную клиническую значимость. Тяжесть фиброза может быть модулирована путем регулировки времени ишемии и температуры тела; однако, по сравнению с моделью UUO, она более сложна хирургически, и индукция интерстициального фиброза требует более длительной продолжительности¹³. По сравнению с этими моделями, модель UUO имеет ряд преимуществ, в том числе короткую продолжительность моделирования, минимальную вариабельность, повторяемость и относительно простую хирургическую процедуру. Мышиная модель UUO, которая не включает токсины, создается путем перевязки одного мочеточника, что приводит к обструктивной нефропатии в течение двух недель. Это приводит к гидронефрозу, расширению канальцев и интерстициальному фиброзу, что очень похоже на патологический процесс, наблюдаемый у человека¹⁴. Тяжесть фиброза — легкую, умеренную или тяжелую — можно контролировать, корректируя продолжительность эксперимента.

Несмотря на то, что мышиная модель UUO проще в использовании, чем другие модели исследования ХБП, несколько факторов могут существенно повлиять на ее стабильность. Эти факторы включают в себя деформацию мыши, возраст, пол, тип анестезии, продолжительность операции, температуру тела во время операции, хирургические навыки оператора, а также условия кормления и состояние здоровья мышей^15,16.

Сведение к минимуму хирургического стресса и инфекции при выполнении процедуры устойчивым и организованным образом под анестезией имеет важное значение для создания воспроизводимой модели мыши UUO. Кроме того, исследования механизмов и потенциальных терапевтических мишеней ХБП могут быть скомпрометированы неопытными операторами, что приводит к увеличению потерь мышей и большей гетерогенности моделей. Для решения этих проблем выделяются ключевые технические аспекты хирургического процесса — до, во время и после процедуры — с акцентом на критические вопросы, требующие внимания. Кроме того, методология оценки мышиной модели UUO детализирована, чтобы предоставить исследователям последовательный и надежный подход.

Все процедуры с животными проводятся в соответствии с руководящими принципами агентства и одобрены Институциональным комитетом по этике животных Нанкинского медицинского университета. Для устранения половых и штаммовых различий и обеспечения сопоставимости результатов используют только самцов мышей CD1 в возрасте 8-10 недель и массой 22-25 г. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка животных и инструментов

1. Автоклавируйте все хирургические инструменты перед операцией.
2. Взвесьте и обезболите мышей (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Правильно подключите аппарат для ингаляционной анестезии и поместите мышей в индукционную камеру с 2% изофлураном, смешанным с кислородом в дозе 1-2 л/мин. Затем поместите нос мыши в носовой конус с постоянным запасом анестезии. Подтвердите надлежащий уровень седативного эффекта, оценив отсутствие реакции на защемление пальца ноги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно проверяйте частоту дыхания и оценивайте уровень анестезии с помощью педального рефлекса мышей. При необходимости отрегулируйте дозу изофлурана.
3. Поместите мышь на электронную грелку в положении лежа на спине, вытянув голову и шею, чтобы дыхательные пути оставались открытыми. Закрепите лапы малоклейкой лентой.
4. Используйте термометр для контроля температуры окружающей среды и поддерживайте ее на уровне 37-38 °C. Введите ректальный зонд и поддерживайте температуру тела мышей на уровне 36,5-37 °C во время процедуры.
5. Наносите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить травму при ксерозе роговицы.
6. Сбрейте волосы над хирургической областью с помощью крема для эпиляции и трижды продезинфицируйте их раствором бетадина.

2. Хирургическое вмешательство

ПРИМЕЧАНИЕ: Как только температура тела стабилизируется на заданном уровне и рефлекс защемления пальцев ног отсутствует, начните следующие хирургические процедуры.

1. С помощью хирургического лезвия сделайте вертикальный хирургический разрез примерно на 1-1,5 сантиметра от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер, чтобы обнажить брюшную полость.
2. Переместите кишечник в правую сторону брюшной полости с помощью ватного тампона, смоченного в стерильном обычном физрастворе, чтобы обнажить левую почку, расположенную ниже задней части селезенки и прилегающую к позвоночнику.
3. Используйте щипцы с изогнутой радужной оболочкой, чтобы очистить жир и соединительную ткань, окружающую левый мочеточник. После легкой изоляции перевяжите левый мочеточник близко к нижнему полюсу почки с помощью шелкового плетеного шва 3/0. Выполните вторую лигацию левого мочеточника между первой лигацией и мочевым пузырем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму вариабельность среди мышей, убедитесь, что положение лигирования остается одинаковым у всех субъектов. С помощью левых щипцов наложите шов на кончики правых щипцов и продвиньте шов обратно под мочеточник¹⁷. Избегайте включения избытка жира и соединительной ткани в лигирование, так как это может привести к неполной непроходимости почек. Добивайтесь этого, аккуратно поглаживая мочеточник сухими ватными палочками.
4. Осторожно переместите кишечник в брюшную полость. Сшивайте мышечный и кожный слои отдельно с помощью шелкового плетеного швова 3/0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наложение швов на кожу и мышечные слои может привести к разрыву раны и повреждению внутренних органов брюшной полости.
5. При работе с несколькими мышами очистите хирургические инструменты проточной водой и 75% этанолом, прежде чем приступать к следующей мыши.

3. Послеоперационный уход и мониторинг

1. Введите 0,5 мл теплого физиологического раствора внутрибрюшинно, чтобы предотвратить обезвоживание.
2. Поместите мышей обратно в чистую клетку, пока они не придут в полное сознание.
3. Вводите бупренорфин (50 мкг/кг) путем подкожной инъекции в течение 3 дней. Ежедневно наблюдайте за мышами на предмет признаков отсутствия груминга, снижения приема пищи и ненормальной осанки.

4. Послеоперационные оценки

1. Гистология
   1. Усыпьте мышей с помощью передозировки изофлурана (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Забор обструкционных и контралатеральных необструкционных почек¹⁸ после эвтаназии.
   2. Для гистологического исследования используйте наибольшую площадь поперечного сечения среза почки.
   3. Зафиксировать ткани почек в 4% параформальдегиде и разрезать полученные образцы на срезы по 4 мкм.
   4. Окрашивание срезов почек периодическим кислотным окрашиванием по методу Шиффа (PAS), трихромным окрашиванием по Массону (MTS) или окрашиванием по красному цвету Sirius для выявления повреждения почечных канальцев и фиброза почек.
   5. Выберите десять случайных полей срезов почек под световым микроскопом при увеличении 200×.
   6. Рассчитайте долю коллаген-положительной синей области с помощью программного обеспечения ImageJ.
2. Вестерн-блот
   1. Извлечь примерно 20 мг почечной ткани из того же полюса почек UUO с помощью буфера радиоиммунопреципитации (RIPA)¹⁸.
   2. Количественное определение концентрации белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты¹⁹.
   3. Загрузите равное количество образцов белка на 4%-10% гели Bis-Tris для электрофореза и перенесите их на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF).
   4. Заблокируйте мембраны PVDF 5% молоком в трис-буферизованном физиологическом растворе Tween (TBST) и инкубируйте их с первичными антителами в течение ночи при 4 °C.
   5. Мембраны PVDF промыть TBST и инкубировать их со вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 ч.
   6. Определяйте уровни белков с помощью метода усиленной хемилюминесценции (ECL) и анализируйте их с помощью программного обеспечения ImageJ с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPDH) в качестве контроля нагрузки.
3. Функция почек
   1. Обезболите мышей ингаляционным изофлураном (см. шаг 1.2).
   2. Соберите образцы крови ретроорбитально после анестезии.
   3. Центрифугируйте образцы крови при давлении 3000 x g в течение 15 минут при комнатной температуре.
   4. Измеряйте уровень креатинина сыворотки крови и азот мочевины (мочевины) в крови с помощью автоматического сухого химического анализатора для мониторинга функции почек.

Гистология
Периодическое окрашивание кислотой-Шиффом (PAS) выявило расширение канальцев, потерю границ кисти, образование гипса и отек эпителия канальцев. Трихромное окрашивание по методу Массона и окрашивание в красный цвет Сириуса показало интерстициальный фиброз после НВО, в отличие от нормальных компактных канальцев с различимыми просветами, наблюдаемых в фиктивной группе. Степень почечного интерстициального фиброза, обозначенная синими областями при трихромном окрашивании по Массону и красными участками при окрашивании в красный цвет по Сириусу, увеличивалась в зависимости от времени (рис. 1А).

Вестерн-блот
Фибронектин (FN), коллаген I (Col-1) и α-гладкомышечный актин (α-SMA) являются широко используемыми маркерами для оценки фиброза почек. По сравнению с фиктивной группой, уровни экспрессии этих фиброзных белков были значительно повышены после UUO и положительно коррелировали с продолжительностью обструкции (рис. 1B).

ПЦР в реальном времени
По сравнению с фиктивной группой, уровни мРНК фиброзных маркеров (FN, Col-1a1, α-SMA и трансформирующего фактора роста-β1 (TGF-β1)), а также воспалительных цитокинов, таких как моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1), фактор некроза опухоли-α (TNF-α) и мотив C-X-C хемокинового лиганда 1 (CXCL-1), были значительно повышены в группе UUO (рис. 1C).

Влияние биологических и хирургических факторов на исходы НВОО
Штамм, возраст и пол мышей существенно влияют на исходы в исследованиях UUO. В исследовании была установлена обратимая мышиная модель UUO, состоящая из шести дней обструкции с последующим семидневным обращением. В то время как у мышей BALB/c наблюдалось почти полное восстановление функции почек до уровней, сравнимых с контрольной группой, у мышей C57BL/6 наблюдалась необратимая потеря функции почек. Для получения более подробной информации о функции почек см. Puri et ^al.20.

Половые различия также играют решающую роль в моделях UUO. При сравнении самцов и самок мышей C57BL/6J после двух недель ННВК у самцов наблюдался значительно более высокий уровень интерстициального фиброза почек и повышенное отложение коллагенового белка IV в канальцевом интерстиции. Возраст является еще одним ключевым фактором, влияющим на интерстициальное повреждение после обструкции. У более старых мышей (50 недель) наблюдалась более выраженная дилатация и атрофия канальцев по сравнению с более молодыми собратьями (16 недель)²¹.

В дополнение к биологическим вариациям у мышей, хирургические параметры также влияют на исходы UUO. Примечательно, что экспрессия белка TGF-β1 и мРНК была значительно подавлена у мышей, получавших анестезию пропофолом, по сравнению с мышами, получавшими севофлуран во время процедуры UUO²². Кроме того, продолжительность обструкции напрямую коррелирует со снижением функции почек. У мышей, подвергшихся обструкции в течение одного-двух дней, наблюдалось полное выздоровление после устранения обструкции, в то время как у мышей, подвергавшихся обструкции в течение трех дней или дольше, развивалась почечная недостаточность, зависящая от времени²⁰.

Рисунок 1: Интерстициальный фиброз почек, вызванный односторонней обструкцией мочеточника (НВО) на 3, 7 и 14 день. (А) Периодическое кислотное окрашивание по Шиффу (PAS), трихромное окрашивание по Массону (MTS) и окрашивание почечных отделов по методу Sirius из фиктивных почек и почек UUO. Масштабные линейки = 100 мкм. (B) Вестерн-блоттинг фибронектина (FN), коллагена I (Col-1) и α-гладкомышечного актина (α-SMA) в фиктивных почках и почках с UUO. (C) ПЦР-анализ маркеров, связанных с фиброзом, и воспалительных цитокинов в фиктивных почках и почках с НРП в реальном времени. Данные представлены в виде среднего ± стандартной погрешности среднего (SEM). Статистический анализ проводили с использованием одностороннего ANOVA и t-критерия Стьюдента. Статистическая значимость указана следующим образом: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Сокращения: UUO, односторонняя обструкция мочеточника; PAS, периодическая кислота-Шиффа; МТС, трихромное окрашивание Массона; FN — фибронектин; Col-1, коллаген I; α-СМА, α-актин гладкой мускулатуры; GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; TGF-β1, трансформирующий фактор роста-β1; MCP-1, моноцитарный хемоаттрактантный белок-1; TNF-α, фактор некроза опухоли-α; CXCL-1, C-X-C мотив хемокиновый лиганд 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Предложена комплексная процедура создания модели UUO, широко используемого подхода к исследованию интерстициального фиброза почек. Кроме того, демонстрируется идентификация и оценка модели, включая оценку функции почек и гистологических изменений. Обсуждаются переменные, влияющие на неоднородность модели, и модифицируемые технические факторы.

Восприимчивость к UUO значительно варьируется в зависимости от возраста, пола и штамма мыши. По сравнению с мышами C57BL/6, мыши BALB/c менее восприимчивы или даже устойчивы к UUO²⁰. В исследованиях с участием самцов и самок мышей C57BL/6 у самцов мышей наблюдалось большее трихромное окрашивание и оценка по шкале Массона, а также повышенная экспрессия коллагена IV после UUO²³. Кроме того, влияние половых различий на фиброз почек при ННЭ варьирует среди трансгенных и нокаутных моделей мышей²⁴. Возраст является еще одним важным фактором, влияющим на результаты UUO; У более старых мышей (50 недель) наблюдается более тяжелая тубулоинтерстициальная атрофия по сравнению с более молодыми мышами (16 недель)²¹. Аналогичное возрастное влияние на исходы UUO наблюдалось у крыс модели²⁵ UUO Спрага-Доули.

Расширенная анестезия во время операции связана с повышенной смертностью животных²⁶. Быстрая индукция хирургической анестезии достигалась с помощью ингаляционного анестетика изофлурана, что приводило к наступлению анестезии в течение 5-10 минут. Этот метод позволяет хирургу легче инициировать, поддерживать и прекращать анестезию по сравнению с внутрибрюшинным введением пентобарбитала натрия (100-200 мг/кг). В модели UUO различные анестетики по-разному влияют на тяжесть фиброза почек. Например, было показано, что пропофол оказывает защитное действие против повреждения почек путем подавления экспрессии индуцируемой синтазы оксида азота в мышиной модели²² UUO; поэтому следует избегать его использования при моделировании UUO.

Обнажение почек и мочеточника имеет важное значение для успеха эксперимента. Ключевым моментом является обеспечение полной лигирования мочеточника. Важным аспектом этого этапа является тщательное рассечение жировой ткани, окружающей почечную шишку. Выбор мышей с более низкой массой тела может быть выгодным, так как у них обычно меньше жировой ткани вокруг почки, что способствует более легкому обнажению почек и мочеточника и сводит к минимуму риск разрыва окружающих тканей. Такой подход не только сокращает продолжительность процедуры, но и уменьшает количество необходимой анестезии, тем самым уменьшая травматизм и технические трудности.

Во время воздействия на почки испарение может привести к прилипанию кровеносных сосудов к хирургическому пинцету, что потенциально может привести к повреждению мочеточника или даже свищу мочеточника. Таким образом, поддержание влажного операционного поля путем постоянного применения стерильного физиологического раствора имеет важное значение. Чтобы свести к минимуму беспорядок, желательно обрезать шов для лигирования до разумной длины (примерно 10 см) перед процедурой, что позволит оператору^{более эффективно управлять} концами. Кроме того, вторая лигация не должна устанавливаться непосредственно поверх первой, так как это может предотвратить адекватную закупорку мочеточника.

На восстановление функции почек в модели UUO влияет продолжительность обструкции²⁷. Тяжесть фиброза напрямую коррелирует с продолжительностью обструкции²⁸. В классической модели UUO, описанной в настоящем документе, подходящими временными точками для оценки являются дни 3, 7 и 14^15. На 3-й день могут наблюдаться ранние изменения в клеточном повреждении, включая повышенную интерстициальную инфильтрацию макрофагов. К 7-му дню повреждение нарастает, представляя собой более дифференцированную картину, характеризующуюся начальными признаками интерстициального фиброза и участками тубулярной атрофии. День 14 представляет собой оптимальный временной момент для оценки полного фенотипа, который включает в себя значительный гидронефроз и потерю почечной паренхимы. Исследования на крысах показали, что необратимое повреждение происходит через 72 ч после обструкции, в то время как 24 ч обструкции позволяют полностью восстановить скорость клубочковой фильтрации в течение 14 дней после устранения обструкции^.

Послеоперационный уход имеет решающее значение для минимизации потерь животных. Сразу после операции вводится теплый физиологический раствор путем внутрибрюшинной инъекции для предотвращения обезвоживания у мыши. После того, как мышь возвращается в клетку, важно обеспечить ее легкодоступной водой и пищей. Хирургическая процедура может нарушить подвижность животного; Поэтому, если еда и вода размещены на возвышенных позициях, протертый корм следует держать на полу клетки для более легкого доступа. При наблюдении за послеоперационным состоянием мышей дозировка обезболивающих препаратов должна быть соответствующим образом увеличена для тех, кто демонстрирует плохой уход, снижение кормления или ненормальную осанку.

Следует отметить несколько потенциальных ограничений модели UUO. Во-первых, эта модель не позволяет точно отслеживать изменения в функции почек. Эндогенные маркеры фильтрации, такие как креатинин и азот мочевины крови, обычно используются для оценки функции почек; Тем не менее, их уровень часто остается стабильным, потому что необструктивная почка компенсирует функцию, утраченную в непроходимой почке. Во-вторых, модель UUO непригодна для изучения клеточной и тканевой регенерации, а также последующего ремоделирования тканей после устранения обструкции из-за отсутствия репарации канальцев. Наконец, мышиная модель UUO имеет ограничения в переносе результатов исследования со стола на кровать, поскольку большинство клинических случаев UUO включают частичную, а не полную обструкцию.

В заключение следует отметить, что модель UUO на мышах широко используется для исследования интерстициального фиброза почек. Он имеет потенциальное применение в исследованиях, направленных на выявление и характеристику маркеров фиброза почек, изучение патогенетических механизмов и изучение потенциальных подходов к лечению ХБП. Несмотря на то, что вариабельность мышиной модели может быть обусловлена многочисленными факторами, подробная процедура, описанная в этом исследовании, может помочь исследователям в разработке высоковоспроизводимой модели UUO. Таким образом, опытный и опытный оператор может создать согласованную модель UUO, придерживаясь описанных методов и уделяя пристальное внимание техническим деталям.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Эта работа была поддержана грантами Национального научного фонда Китая (82370686/2024YFA1107704), грантом специально назначенного профессора Цзянсу, Проектом научно-технических инноваций Нанкина, Программой высокого уровня развития талантов больницы провинции Цзянсу (этап I) (CZ0121002010037), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20240055) и Медицинской инновационной группой Цзянсу JR; Проект по повышению клинического потенциала больницы провинции Цзянсу (первая аффилированная больница Нанкинского медицинского университета) (JSPH-MA-2023-4), приоритетное развитие академических программ высших учебных заведений провинции Цзянсу (Китай) и Национальный фонд естественных наук Китая (81970639/82151320) для Ее Величества.