用于调查肾间质纤维化的单侧输尿管梗阻模型

该方案描述了一种在小鼠中诱导单侧输尿管阻塞 （UUO） 以研究阻塞性肾病中组织纤维化进展的方法。它包括外科手术、术后护理和纤维化评估方法。

肾纤维化是进行性慢性肾脏病 （CKD） 的最终病理结果。单侧输尿管阻塞 （UUO） 模型广泛用于阐明肾间质纤维化的分子和细胞机制，并确定潜在的治疗靶点。该模型是通过手术结扎单侧输尿管在小鼠中建立的，这种手术相对简单且易于执行。然而，已知 UUO 小鼠模型表现出显着的可变性和不一致性，受小鼠品系、年龄、性别、麻醉类型、手术持续时间、手术过程中的体温、作者的手术技能、喂养条件和小鼠的整体健康状况等因素的影响。手术技术、缝合位置和梗阻持续时间的变化会导致结果的可变性。此外，梗阻肾脏的采样不一致进一步增加了肾纤维化评估的可变性。本研究概述了开发 UUO 小鼠模型和评估间质纤维化的过程，讨论了导致模型不可预测的技术挑战，并提出了可能的解决方案。这些见解旨在为研究肾纤维化建立一种更加标准化和普遍适用的方法。

慢性肾病 （CKD） 影响着全球 10% 以上的人口，其患病率还在增加¹。各种尿路疾病，包括先天性解剖异常、肾结石、前列腺增生和膀胱肿瘤，都可能导致输尿管梗阻²。因此，单侧输尿管阻塞 （UUO） 小鼠模型是确定肾间质纤维化新机制、了解疾病进展和评估潜在治疗策略的关键工具。它已被广泛用于研究肌成纤维细胞、（肌）成纤维细胞亚簇、肾小管细胞代谢和细胞周期停滞、部分上皮-间充质转化和其他相关过程的起源 3,4,5,6,7,8。

除了 UUO 诱导的肾间质纤维化外，其他常用的肾间质纤维化啮齿动物模型包括毒素诱导的模型，例如使用马兜铃酸、叶酸和腺嘌呤的模型，以及手术诱导的模型，如 5/6 肾切除术和缺血再灌注损伤 （IRI）。与其他肾纤维化模型相比，UUO 模型具有多项优势。例如，毒素诱导的肾纤维化需要相对较长的建模期（大约 1-2 个月），并且其对其他器官的毒副作用会使纤维化机制的研究复杂化 ^9,10,11。手术诱导模型，例如 5/6 肾切除术，可导致严重的肾出血和感染，增加术后死亡的风险。此外，诱导的间质纤维化的程度与切除的肾组织体积直接相关，这使得在每只小鼠中始终如一地再现相同程度的纤维化具有挑战性¹²。

肾脏 IRI 模型是诱导急性肾损伤 CKD 的主要方法，具有重要的临床意义。纤维化的严重程度可以通过调整缺血时间和体温来调节;然而，与 UUO 模型相比，它的手术更加复杂，并且间质纤维化的诱导需要更长的持续时间¹³。与这些模型相比，UUO 模型具有几个优点，包括建模持续时间短、可变性最小、可重复性和相对简单的外科手术。不涉及毒素的 UUO 小鼠模型是通过结扎一根输尿管而创建的，在两周内导致阻塞性肾病。这导致肾积水、肾小管扩张和间质纤维化，与在人类中观察到的病理过程非常相似¹⁴。纤维化的严重程度 - 轻度、中度或重度 - 可以通过调整实验的持续时间来控制。

尽管 UUO 小鼠模型比其他损伤诱导模型更容易执行来研究 CKD，但有几个因素会显着影响其稳定性。这些因素包括小鼠应变、年龄、性别、麻醉类型、手术持续时间、手术期间的体温、作者的手术技能以及小鼠的摄食条件和健康状况^15,16。

在麻醉下以稳定和有组织的方式进行手术时，最大限度地减少手术压力和感染对于创建可重复的 UUO 小鼠模型至关重要。此外，缺乏经验的作员可能会损害对 CKD 机制和潜在治疗靶点的研究，从而导致小鼠损失增加和模型异质性增加。为了应对这些挑战，概述了手术过程的关键技术方面——手术前、手术中和手术后——突出了需要关注的关键问题。此外，详细介绍了 UUO 小鼠模型的评估方法，为研究人员提供了一种一致且可靠的方法。

所有动物程序均按照机构指南进行，并经南京医科大学机构动物伦理委员会批准。为了消除性别和品系差异并确保结果的可比性，仅使用年龄为8-10周且体重为22-25g的雄性CD1小鼠。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 动物和器械的准备

1. 手术前对所有手术器械进行高压灭菌。
2. 对小鼠进行称重和麻醉（遵循机构批准的方案）。正确连接吸入麻醉装置，将小鼠放入 2% 异氟醚与氧气混合的诱导室中，以 1-2 L/min 的速度混合。然后，将小鼠鼻子放入鼻锥中，持续供应麻醉。通过评估对脚趾捏伤没有反应来确认适当的镇静水平。
   注意：定期检查呼吸频率并使用小鼠的踏板反射评估麻醉水平。适当调整异氟醚。
3. 将鼠标仰卧放在电子加热垫上，头部和颈部伸展，以保持气道畅通。用低粘性胶带固定爪子。
4. 使用温度计监测环境温度并将其保持在 37-38 °C。 插入直肠探针，并在手术过程中将小鼠的核心体温保持在 36.5-37 °C 左右。
5. 将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止角膜干燥损伤。
6. 用脱毛霜剃掉手术区域的毛发，并用优碘溶液消毒 3 次。

2. 外科手术

注意： 一旦体温稳定在设定点并且没有脚趾捏反射，开始以下外科手术。

1. 使用手术刀片从膀胱到肋骨左下缘做一个大约 1-1.5 厘米的垂直手术切口，以露出腹腔。
2. 使用蘸有无菌生理盐水的棉签将肠道移至腹腔右侧，露出位于脾脏后部下方且与脊柱相邻的左肾。
3. 使用弯曲的虹膜镊子清除左输尿管周围的脂肪和结缔组织。温和隔离后，使用 3/0 丝编织缝合线将左输尿管结扎在靠近肾脏下杆的位置。在第一次结扎和膀胱之间对左输尿管进行第二次结扎。
   注意：为了最大限度地减少小鼠之间的差异，请确保所有受试者的结扎位置保持一致。使用左侧镊子将缝合线放入右侧镊子的尖端，然后将缝合线滑回输尿管¹⁷ 下方。避免在结扎中加入过多的脂肪和结缔组织，因为这可能导致不完全的肾梗阻。通过用干棉签轻轻抚摸输尿管来实现这一点。
4. 小心地将肠道重新定位到腹膜腔中。使用 3/0 丝编织缝合线分别缝合肌肉层和皮肤层。
   注意：将皮肤和肌肉层缝合在一起可能会导致缝合伤口破裂和腹部内脏损伤。
5. 对多只小鼠进行手术时，在进行下一只小鼠之前，用流水和 75% 乙醇清洁手术器械。

3. 术后护理和监测

1. 腹膜内注射 0.5 mL 温热的生理盐水以防止脱水。
2. 将小鼠放回干净的笼子中，直到它们恢复完全意识。
3. 通过皮下注射施用丁丙诺啡 （50 μg/kg），持续 3 天。每天监测小鼠是否有缺乏梳理、进食减少和姿势异常的迹象。

4. 术后评估

1. 组织学
   1. 用过量的异氟醚对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。安乐死后收获阻塞和对侧非阻塞的肾脏¹⁸ 。
   2. 使用肾脏切片的最大横截面积进行组织学检查。
   3. 将肾组织固定在 4% 多聚甲醛中，并将获得的样品切成 4 μm 切片。
   4. 使用高碘酸-希夫 （PAS）、Masson 三色染色 （MTS） 或天狼星红染色对肾切片进行染色，以检测肾小管损伤和肾纤维化。
   5. 在光学显微镜下以 200× 的放大倍率选择肾切片的十个随机区域。
   6. 使用 ImageJ 软件计算胶原蛋白阳性蓝色区域的比例。
2. 蛋白质印迹
   1. 使用放射免疫沉淀测定 （RIPA） 缓冲液¹⁸ 从 UUO 肾脏的同一极提取约 20 mg 肾组织。
   2. 使用二辛可宁酸测定法¹⁹ 定量蛋白质浓度。
   3. 将等量的蛋白质样品上样到 4%-10% Bis-Tris 凝胶上进行电泳，并将其转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上。
   4. 在 Tris 缓冲盐水吐温 （TBST） 中用 5% 牛奶封闭 PVDF 膜，并在 4 °C 下与一抗孵育过夜。
   5. 用 TBST 洗涤 PVDF 膜，并在室温下与二抗孵育 1 小时。
   6. 使用增强化学发光 （ECL） 方法检测蛋白质水平，并使用 ImageJ 软件对其进行分析，以 3-磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 作为上样对照。
3. 肾功能
   1. 用吸入的异氟醚麻醉小鼠（参见步骤 1.2）。
   2. 麻醉后在眶后采集血样。
   3. 在室温下以 3,000 x g 离心血液样品 15 分钟。
   4. 使用自动干化学分析仪测量血清肌酐和血尿素氮 （BUN），以监测肾功能。

组织学
高碘酸-希夫 （PAS） 染色显示肾小管扩张、刷状边界缺失、石膏形成和肾小管上皮肿胀。Masson 的三色和天狼星红染色显示 UUO 后间质纤维化，与假手术组中观察到的正常致密小管形成鲜明管腔形成鲜明对比。肾间质纤维化的程度，由 Masson 三色染色中的蓝色区域和 Sirius 红染色中的红色区域表示，以时间依赖性方式增加（图 1A）。

蛋白质印迹
纤连蛋白 （FN）、胶原 I （Col-1） 和 α-平滑肌肌动蛋白 （α-SMA） 是评估肾纤维化的常用标志物。与假手术组相比，UUO 后这些纤维化蛋白的表达水平显着升高，并且与阻塞持续时间呈正相关（图 1B）。

实时 PCR
与假手术组相比，纤维化标志物 （FN、Col-1a1、α-SMA 和转化生长因子-β1 （TGF-β1）） 以及炎性细胞因子如单核细胞趋化蛋白-1 （MCP-1）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α） 和 C-X-C 基序趋化因子配体 1 （CXCL-1） 的 mRNA 水平在 UUO 组中显著增加（图 1C）。

生物和手术因素对 UUO 结局的影响
小鼠的品系、年龄和性别显着影响 UUO 研究的结果。一项研究建立了一个可逆的 UUO 小鼠模型，包括 6 天的梗阻和 7 天的逆转。虽然 BALB/c 小鼠的肾功能几乎完全恢复到与假手术对照相当的水平，但 C57BL/6 小鼠的肾功能出现不可逆的丧失。有关肾功能的更多详细信息，请参阅 Puri 等人 ²⁰。

性别差异在 UUO 模型中也起着关键作用。在 UUO 两周后雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠的比较中，雄性表现出更高水平的肾间质纤维化和肾小管间质中胶原蛋白 IV 蛋白沉积的增加。年龄是影响梗阻后间质损伤的另一个关键因素。与年轻的小鼠（16 周）相比，老年小鼠（50 周）表现出更严重的肾小管扩张和萎缩²¹。

除了小鼠之间的生物学差异外，手术参数也会影响 UUO 结果。值得注意的是，与在 UUO 手术期间接受七氟烷的小鼠相比，用异丙酚麻醉的小鼠的 TGF-β1 蛋白和 mRNA 表达受到显着抑制²²。此外，梗阻的持续时间与肾功能下降直接相关。接受 UUO 一到两天的小鼠在去除梗阻后完全恢复，而梗阻三天或更长时间的小鼠出现时间依赖性肾功能衰竭²⁰。

图 1：第 3 天、第 7 天和第 14 天单侧输尿管梗阻 （UUO） 诱导的肾间质纤维化。 （A） 假肾和 UUO 肾切片的高碘酸-希夫 （PAS）、马森三色染色 （MTS） 和天狼星红染色。比例尺 = 100 μm。（B） 假肾和 UUO 肾中纤连蛋白 （FN）、胶原蛋白 I （Col-1） 和α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA） 的蛋白质印迹分析。（C） 假肾和 UUO 肾中纤维化相关标志物和炎性细胞因子的实时 PCR 分析。数据以平均值±平均值的标准误差 （SEM） 表示。使用单因素方差分析和学生 t 检验进行统计分析。统计显着性表示如下： *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。缩写：UUO，单侧输尿管梗阻;PAS，高碘酸-希夫;MTS，Masson 三色染色;FN，纤连蛋白;Col-1，胶原蛋白 I;α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白;GAPDH，甘油醛 3-磷酸脱氢酶;TGF-β1，转化生长因子-β1;MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1;TNF-α，肿瘤坏死因子-α;CXCL-1，C-X-C 基序趋化因子配体 1。请单击此处查看此图的较大版本。

提供了建立 UUO 模型的综合程序，这是一种广泛用于调查肾间质纤维化的方法。此外，还展示了模型的识别和评估，包括肾功能和组织学改变的评估。讨论了导致模型异质性的变量和可修改的技术因素。

对 UUO 的易感性因年龄、性别和小鼠品系而异。与 C57BL/6 小鼠相比，BALB/c 小鼠对 UUO²⁰ 的敏感性较低，甚至耐药性较低。在涉及雄性和雌性 C57BL/6 小鼠的研究中，雄性小鼠在 UUO²³ 后表现出更大的 Masson 三色染色和评分，以及胶原蛋白 IV 表达增加。此外，性别差异对 UUO 肾纤维化的影响因转基因和敲除小鼠模型而异²⁴。年龄是影响 UUO 结果的另一个关键因素;与年轻小鼠 （16 周） 相比，老年小鼠 （50 周） 表现出更严重的肾小管间质萎缩²¹。在 Sprague-Dawley 大鼠 UUO 模型²⁵ 中观察到类似的年龄相关影响对 UUO 结果的影响。

手术期间的延长麻醉与动物死亡率增加有关²⁶。使用吸入麻醉剂异氟醚实现手术麻醉的快速诱导，导致麻醉在 5-10 分钟内起效。与腹膜内注射戊巴比妥钠 （100-200 mg/kg） 相比，这种方法使外科医生更容易启动、维持和终止麻醉。在 UUO 模型中，不同的麻醉剂对肾纤维化的严重程度有不同的影响。例如，异丙酚已被证明通过下调 UUO 小鼠模型中的诱导型一氧化氮合酶表达²² 对肾损伤发挥保护作用;因此，在 UUO 建模中应避免使用它。

肾脏和输尿管的暴露对于实验的成功至关重要。一个关键的考虑因素是确保输尿管完全结扎。此步骤的一个关键方面涉及仔细解剖肾门周围的脂肪组织。选择体重较轻的小鼠可能是有利的，因为它们通常肾脏周围的脂肪组织较少，有利于更容易暴露肾脏和输尿管，同时最大限度地降低撕裂周围组织的风险。这种方法不仅缩短了手术时间，还减少了所需的麻醉量，从而减少了创伤和技术难度。

在肾脏暴露期间，蒸发可能导致血管粘附在手术镊子上，可能导致输尿管损伤甚至输尿管瘘。因此，通过持续使用无菌生理盐水来保持手术区域湿润是必不可少的。为了尽量减少杂乱，建议在手术前将用于结扎的缝合线剪成合理的长度（约 10 厘米），以便作者更有效地管理末端¹⁴。此外，第二次结扎不应直接放在第一次结扎的顶部，因为这可能会阻止输尿管充分堵塞。

UUO 模型中肾功能的恢复受梗阻持续时间的影响²⁷。纤维化的严重程度与梗阻的持续时间直接相关²⁸。在此描述的经典 UUO 模型中，评估的合适时间点是第 3 天、第 7 天和第 14 天¹⁵ 天。第 3 天，可以观察到细胞损伤的早期变化，包括间质巨噬细胞浸润增加。到第 7 天，损伤升级，呈现出更差异化的模式，其特征是间质纤维化的初始体征和肾小管萎缩区域。第 14 天是评估完整表型的最佳时间点，其中包括显着的肾积水和肾实质缺失。大鼠研究表明，梗阻 72 小时后会发生永久性损伤，而梗阻 24 小时允许在梗阻逆转后 14 天内完全恢复肾小球滤过率²⁷。

术后护理对于最大限度地减少动物损失至关重要。手术后立即 通过 腹膜内注射温盐水以防止小鼠脱水。一旦老鼠被送回笼子，提供易于获取的水和食物就是必不可少的。外科手术可能会损害动物的活动能力;因此，如果食物和水放在较高的位置，捣碎的食物应放在笼子的地板上，以便于取用。在监测小鼠术后状况时，对于梳理不良、喂养减少或姿势异常的小鼠，应适当增加镇痛药的剂量。

应注意 UUO 模型的几个潜在局限性。首先，该模型不能准确跟踪肾功能的变化。内源性滤过标志物，如肌酐和血尿素氮，常用于评估肾功能;然而，它们的水平通常保持稳定，因为非梗阻的肾脏可以补偿梗阻肾脏中失去的功能。其次，由于没有肾小管修复，UUO 模型不适合研究细胞和组织再生，以及阻塞释放后随后的组织重塑。最后，UUO 小鼠模型在将研究结果从实验室转化为床边方面存在局限性，因为大多数 UUO 临床病例涉及部分梗阻而不是完全梗阻。

总之，小鼠的 UUO 模型被广泛用于肾间质纤维化的研究。它在旨在识别和表征肾纤维化标志物、检查致病机制和探索 CKD 潜在治疗方法的研究中具有潜在应用。尽管小鼠模型的可变性可能由许多因素引起，但本研究中概述的详细程序可能有助于研究人员开发高度可重复的 UUO 模型。因此，熟练的作员可以通过坚持所描述的技术并密切关注技术细节来生成一致的 UUO 模型。

作者声明没有利益冲突。

这项工作得到了中国国家自然科学基金资助 （82370686/2024YFA1107704）、江苏省特聘教授资助、南京市科技创新工程、江苏省医院高层次人才培养计划（第一阶段）（CZ0121002010037）、江苏省自然科学基金 （BK20240055） 和江苏省医学创新团队的支持;江苏省医院（南京医科大学第一附属医院）临床能力提升项目 （JSPH-MA-2023-4），江苏省高等院校优先学术项目发展（中国）和中国国家自然科学基金 （81970639/82151320） 给 HM。