Modelo de obstrucción ureteral unilateral para la investigación de la fibrosis intersticial renal

Este protocolo describe un método para inducir la obstrucción ureteral unilateral (UUO) en ratones para estudiar la progresión de la fibrosis tisular en la nefropatía obstructiva. Incluye procedimientos quirúrgicos, cuidados postoperatorios y métodos para la evaluación de la fibrosis.

La fibrosis renal es el resultado patológico final de la enfermedad renal crónica (ERC) progresiva. El modelo de obstrucción ureteral unilateral (UUO) es ampliamente utilizado para dilucidar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la fibrosis intersticial renal y para identificar posibles dianas terapéuticas. Este modelo se establece en ratones a través de la ligadura quirúrgica de un uréter unilateral, un procedimiento relativamente sencillo y fácil de realizar. Sin embargo, se sabe que el modelo de ratón UUO exhibe una variabilidad e inconsistencia significativas, influenciadas por factores como la tensión del ratón, la edad, el sexo, el tipo de anestesia, la duración de la cirugía, la temperatura corporal durante el procedimiento, las habilidades quirúrgicas del operador, las condiciones de alimentación y el estado de salud general de los ratones. Las variaciones en las técnicas quirúrgicas, la colocación de las suturas y la duración de la obstrucción contribuyen a la variabilidad de los resultados. Además, el muestreo inconsistente de riñones obstruidos aumenta aún más la variabilidad en la evaluación de la fibrosis renal. Este estudio describe el proceso de desarrollo del modelo de ratón UUO y la evaluación de la fibrosis intersticial, discute los desafíos técnicos que contribuyen a la imprevisibilidad del modelo y propone posibles soluciones. Estos conocimientos tienen como objetivo establecer un enfoque más estandarizado y universalmente aplicable para investigar la fibrosis renal.

La enfermedad renal crónica (ERC) afecta a más del 10% de la población mundial y su prevalencia está aumentando¹. Diversas afecciones del tracto urinario, como anomalías anatómicas congénitas, nefrolitiasis, hiperplasia prostática y tumores vesicales, pueden provocar obstrucción ureteral². Como resultado, el modelo de ratón de obstrucción ureteral unilateral (UUO) es una herramienta clave para identificar nuevos mecanismos de fibrosis intersticial renal, comprender la progresión de la enfermedad y evaluar posibles estrategias de tratamiento. Ha sido ampliamente utilizado para investigar el origen de los miofibroblastos, los subgrupos de (mio)fibroblastos, el metabolismo de las células tubulares y la detención del ciclo celular, la transición epitelio-mesénquima parcial y otros procesos relacionados 3,4,5,6,7,8.

Además de la fibrosis intersticial renal inducida por UUO, otros modelos de fibrosis intersticial renal en roedores que se usan comúnmente incluyen modelos inducidos por toxinas, como los que usan ácido aristolóquico, ácido fólico y adenina, así como modelos inducidos quirúrgicamente como la nefrectomía 5/6 y la lesión por isquemia-reperfusión (IRI). El modelo UUO ofrece varias ventajas sobre los modelos alternativos de fibrosis renal. Por ejemplo, la fibrosis renal inducida por toxinas requiere un período de modelado relativamente largo (aproximadamente 1-2 meses), y sus efectos secundarios tóxicos en otros órganos pueden complicar la investigación de los mecanismos de fibrosis ^9,10,11. Los modelos inducidos quirúrgicamente, como la nefrectomía 5/6, pueden provocar una hemorragia renal significativa e infección, lo que aumenta el riesgo de mortalidad postoperatoria. Además, el grado de fibrosis intersticial inducida se correlaciona directamente con el volumen de tejido renal resecado, lo que dificulta la reproducción consistente del mismo grado de fibrosis en^{cada ratón}.

El modelo IRI renal es un método primario para inducir la lesión renal aguda a la ERC y tiene una relevancia clínica significativa. La gravedad de la fibrosis puede modularse ajustando el tiempo isquémico y la temperatura corporal; sin embargo, en comparación con el modelo UUO, es más complejo quirúrgicamente y la inducción de fibrosis intersticial requiere una mayor duración¹³. En comparación con estos modelos, el modelo UUO tiene varias ventajas, incluida una duración de modelado corta, una variabilidad mínima, repetibilidad y un procedimiento quirúrgico relativamente simple. El modelo de ratón UUO, que no involucra toxinas, se crea ligando un uréter, lo que lleva a una nefropatía obstructiva en dos semanas. Esto da lugar a hidronefrosis, dilatación tubular y fibrosis intersticial, muy parecida al proceso patológico observado en los seres humanos¹⁴. La gravedad de la fibrosis (leve, moderada o grave) se puede controlar ajustando la duración del experimento.

Aunque el modelo de ratón UUO es más sencillo de realizar que otros modelos inducidos por insultos para investigar la ERC, varios factores pueden afectar significativamente su estabilidad. Estos factores incluyen la tensión del ratón, la edad, el sexo, el tipo de anestesia, la duración de la cirugía, la temperatura corporal durante la cirugía, las habilidades quirúrgicas del operador, y las condiciones de alimentación y el estado de salud de los ratones^15,16.

Minimizar el estrés quirúrgico y la infección mientras se realiza el procedimiento de manera constante y organizada bajo anestesia es esencial para crear un modelo de ratón UUO reproducible. Además, la investigación sobre los mecanismos y las posibles dianas terapéuticas de la ERC puede verse comprometida por operadores inexpertos, lo que conduce a una mayor pérdida de ratones y a una mayor heterogeneidad del modelo. Para abordar estos desafíos, se describen los aspectos técnicos clave del proceso quirúrgico (antes, durante y después del procedimiento), destacando los problemas críticos que requieren atención. Además, se detalla la metodología de evaluación para el modelo de ratón UUO para proporcionar a los investigadores un enfoque coherente y fiable.

Todos los procedimientos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las pautas de la agencia y son aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal de la Universidad Médica de Nanjing. Para eliminar las diferencias de sexo y cepa y garantizar la comparabilidad de los resultados, solo se utilizan ratones machos CD1 de 8 a 10 semanas de edad y con un peso de 22 a 25 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de animales e instrumentos

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía.
2. Pesar y anestesiar a los ratones (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Conecte correctamente el dispositivo de anestesia inhalatoria y coloque los ratones en la cámara de inducción con isoflurano al 2% mezclado con oxígeno a 1-2 L/min. Luego, coloque la nariz del ratón en el cono de la nariz con un suministro constante de anestesia. Confirme el nivel adecuado de sedación evaluando la falta de respuesta a un pinzamiento del dedo del pie.
   NOTA: Comprobar regularmente la frecuencia respiratoria y evaluar el nivel de anestesia utilizando el reflejo pedal de los ratones. Ajuste el isoflurano según corresponda.
3. Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica electrónica en posición supina con la cabeza y el cuello extendidos para mantener abiertas las vías respiratorias. Asegure las patas con cinta adhesiva baja.
4. Utilice un termómetro para controlar la temperatura ambiente y manténgala a 37-38 °C. Inserte una sonda rectal y mantenga la temperatura corporal central de los ratones alrededor de 36,5-37 °C durante el procedimiento.
5. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la lesión de la xerosis corneal.
6. Afeitar el vello sobre la zona quirúrgica con crema depilatoria y desinfectarlo con solución de betadine tres veces.

2. Procedimiento quirúrgico

NOTA: Una vez que la temperatura corporal se estabilice en el punto de ajuste y el reflejo de pellizco del dedo del pie esté ausente, inicie los siguientes procedimientos quirúrgicos.

1. Use una cuchilla quirúrgica para hacer una incisión quirúrgica vertical de aproximadamente 1 a 1.5 centímetros desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas para exponer la cavidad abdominal.
2. Mueva el intestino hacia el lado derecho de la cavidad abdominal usando un hisopo de algodón humedecido con solución salina normal estéril para exponer el riñón izquierdo, ubicado debajo de la parte posterior del bazo y adyacente a la columna vertebral.
3. Use pinzas de iris curvadas para limpiar la grasa y el tejido conectivo que rodea el uréter izquierdo. Después de un aislamiento suave, ligar el uréter izquierdo cerca del polo inferior del riñón con una sutura trenzada de seda 3/0. Realizar una segunda ligadura del uréter izquierdo entre la primera ligadura y la vejiga.
   NOTA: Para minimizar la variabilidad entre los ratones, asegúrese de que la posición de ligadura permanezca constante en todos los sujetos. Utilice las pinzas de la mano izquierda para colocar la sutura en las puntas de las pinzas de la mano derecha y deslice la sutura de nuevo por debajo del uréter¹⁷. Evite incluir exceso de grasa y tejido conectivo en la ligadura, ya que esto puede provocar una obstrucción renal incompleta. Para ello, acaricia suavemente el uréter con bastoncillos de algodón secos.
4. Vuelva a colocar cuidadosamente los intestinos en la cavidad peritoneal. Sutura las capas de músculo y piel por separado con una sutura trenzada de seda 3/0.
   NOTA: Suturar la piel y las capas musculares juntas puede causar la ruptura de la herida de sutura y daño a las vísceras abdominales.
5. Cuando opere en varios ratones, limpie los instrumentos quirúrgicos con agua corriente y etanol al 75% antes de pasar al siguiente ratón.

3. Cuidados y seguimiento postquirúrgico

1. Inyecte 0,5 mL de solución salina normal tibia por vía intraperitoneal para prevenir la deshidratación.
2. Vuelva a colocar a los ratones en una jaula limpia hasta que recuperen la conciencia completa.
3. Administrar buprenorfina (50 μg/kg) por inyección subcutánea durante 3 días. Monitoree a los ratones diariamente para detectar signos de falta de aseo, disminución de la alimentación y postura anormal.

4. Evaluaciones postoperatorias

1. Histología
   1. Eutanasia a los ratones con una sobredosis de isoflurano (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Extraer los riñones obstruidos y contralaterales no obstruidos¹⁸ después de la eutanasia.
   2. Utilice el área de la sección transversal más grande de la sección renal para el examen histológico.
   3. Fijar los tejidos renales en paraformaldehído al 4% y cortar las muestras obtenidas en secciones de 4 μm.
   4. Teñir secciones de riñón con ácido peryódico-Schiff (PAS), tinción tricrómica de Masson (MTS) o tinción roja de Sirius para detectar lesión tubular renal y fibrosis renal.
   5. Seleccione diez campos aleatorios de las secciones de riñón bajo un microscopio óptico con un aumento de 200×.
   6. Calcule la proporción del área azul con colágeno positivo utilizando el software ImageJ.
2. Western blot
   1. Extraiga aproximadamente 20 mg de tejido renal del mismo polo de riñones UUO utilizando tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)¹⁸.
   2. Cuantificar la concentración de proteínas mediante un ensayo de ácido bicincónico¹⁹.
   3. Cargue cantidades iguales de muestras de proteínas en geles Bis-Tris al 4%-10% para la electroforesis y transfiéralas a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
   4. Bloquee las membranas de PVDF con leche al 5% en Tris-Buffered Saline Tween (TBST) e incube con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
   5. Lavar las membranas de PVDF con TBST e incubarlas con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 h.
   6. Detecte los niveles de proteínas utilizando un método de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y analícelos utilizando el software ImageJ, con gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control de carga.
3. Función renal
   1. Anestesiar a los ratones con isoflurano inhalado (ver paso 1.2).
   2. Recolectar muestras de sangre retroorbitalmente después de la anestesia.
   3. Centrifugar las muestras de sangre a 3.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   4. Mida la creatinina sérica y el nitrógeno ureico en sangre (BUN) utilizando un analizador químico seco automático para controlar la función renal.

Histología
La tinción con ácido peryódico-Schiff (PAS) reveló dilatación tubular, pérdida de los bordes en cepillo, formación de yesos e hinchazón epitelial tubular. La tinción tricrómática de Masson y rojo de Sirius mostró fibrosis intersticial después de UUO, en contraste con los túbulos compactos normales con lúmenes discernibles observados en el grupo simulado. El grado de fibrosis intersticial renal, indicado por áreas azules en la tinción tricrómica de Masson y áreas rojas en la tinción roja de Sirius, aumentó de manera dependiente del tiempo (Figura 1A).

Western blot
La fibronectina (FN), el colágeno I (Col-1) y la actina del músculo liso α (α-SMA) son marcadores comúnmente utilizados para evaluar la fibrosis renal. En comparación con el grupo simulado, los niveles de expresión de estas proteínas fibróticas se elevaron significativamente después de la UUO y se correlacionaron positivamente con la duración de la obstrucción (Figura 1B).

PCR en tiempo real
En comparación con el grupo simulado, los niveles de ARNm de los marcadores fibróticos (FN, Col-1a1, α-SMA y del factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1)), junto con citocinas inflamatorias como la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y el ligando 1 de quimiocinas con motivo C-X-C (CXCL-1), aumentaron significativamente en el grupo UUO (Figura 1C).

Influencia de los factores biológicos y quirúrgicos en los resultados de la UUO
La cepa, la edad y el sexo de los ratones influyen significativamente en los resultados de los estudios de UUO. Un estudio estableció un modelo de ratón UUO reversible que consistía en seis días de obstrucción seguidos de siete días de reversión. Mientras que los ratones BALB/c mostraron una recuperación casi completa de la función renal a niveles comparables a los controles operados simuladamente, los ratones C57BL/6 experimentaron una pérdida irreversible de la función renal. Para más detalles sobre la función renal, consultar Puri et ^al.20.

Las diferencias sexuales también juegan un papel fundamental en los modelos UUO. En una comparación de ratones machos y hembras C57BL/6J después de dos semanas de UUO, los machos mostraron niveles significativamente más altos de fibrosis intersticial renal y un aumento de la deposición de proteínas de colágeno IV en el intersticio tubular. La edad es otro factor clave que afecta el daño intersticial después de una obstrucción. Los ratones más viejos (50 semanas) mostraron una dilatación tubular y atrofia más severas en comparación con sus contrapartes más jóvenes (16 semanas)²¹.

Además de las variaciones biológicas entre los ratones, los parámetros quirúrgicos también influyen en los resultados de la UUO. En particular, la expresión de la proteína TGF-β1 y del ARNm se suprimió significativamente en los ratones anestesiados con propofol en comparación con los que recibieron sevoflurano durante el procedimiento UUO²². Además, la duración de la obstrucción se correlaciona directamente con el deterioro de la función renal. Los ratones sometidos a UUO durante uno o dos días experimentaron una recuperación completa tras la eliminación de la obstrucción, mientras que los obstruidos durante tres días o más desarrollaron insuficiencia renal dependiente del tiempo²⁰.

Figura 1: Fibrosis intersticial renal inducida por obstrucción ureteral unilateral (OUD) a los 3, 7 y 14 días. (A) Ácido peryódico-Schiff (PAS), tinción tricrómica de Masson (MTS) y tinción roja de Sirius de secciones renales de riñones simulados y UUO. Barras de escala = 100 μm. (B) Análisis de Western blot de fibronectina (FN), colágeno I (Col-1) y actina de músculo liso α (α-SMA) en riñones simulados y UUO. (C) Análisis de PCR en tiempo real de marcadores relacionados con la fibrosis y citoquinas inflamatorias en riñones simulados y UUO. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de un factor y prueba t de Student. La significación estadística se indica de la siguiente manera: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Abreviaturas: UUO, obstrucción ureteral unilateral; PAS: ácido peryódico-Schiff; MTS, tinción tricrómica de Masson; FN: fibronectina; Col-1, colágeno I; α-SMA, actina α del músculo liso; GAPDH: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; TGF-β1, factor de crecimiento transformante-β1; MCP-1: proteína quimioatrayente de monocitos-1; TNF-α, factor de necrosis tumoral-α; CXCL-1, ligando de quimiocina 1 con motivo C-X-C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se proporciona un procedimiento integral para establecer el modelo UUO, un enfoque ampliamente utilizado para investigar la fibrosis intersticial renal. Además, se demuestra la identificación y evaluación del modelo, incluyendo evaluaciones de la función renal y alteraciones histológicas. Se discuten las variables que contribuyen a la heterogeneidad del modelo y los factores técnicos modificables.

La susceptibilidad a la UUO varía significativamente según la edad, el sexo y la cepa del ratón. En comparación con los ratones C57BL/6, los ratones BALB/c son menos susceptibles o incluso resistentes a UUO²⁰. En estudios con ratones machos y hembras C57BL/6, los ratones machos mostraron una mayor tinción y puntuación de los tricrómicos de Masson, así como una mayor expresión de colágeno IV, después de UUO²³. Además, los efectos de las diferencias sexuales sobre la fibrosis renal en la UUO varían entre los modelos de ratón transgénicos y knockout²⁴. La edad es otro factor crítico que influye en los resultados de UUO; Los ratones más viejos (50 semanas) muestran una atrofia tubulointersticial más severa en comparación con los ratones más jóvenes (16 semanas)²¹. Se han observado efectos similares relacionados con la edad en los resultados de la UUO en el modelo de UUO de rata Sprague-Dawley²⁵.

La anestesia prolongada durante la cirugía se asocia con un aumento de la mortalidad animal²⁶. La inducción rápida de la anestesia quirúrgica se logró utilizando isoflurano, un anestésico inhalado, que resultó en el inicio de la anestesia en 5-10 min. Este método permite al cirujano iniciar, mantener y finalizar la anestesia más fácilmente en comparación con la inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100-200 mg/kg). En el modelo UUO, los diferentes anestésicos tienen efectos variables sobre la gravedad de la fibrosis renal. Por ejemplo, se ha demostrado que el propofol ejerce efectos protectores contra la lesión renal al regular a la baja la expresión de óxido nítrico sintasa inducible en el modelo de ratón UUO²²; por lo tanto, se debe evitar su uso en el modelado UUO.

La exposición del riñón y el uréter es esencial para el éxito del experimento. Una consideración clave es asegurar la ligadura completa del uréter. Un aspecto crucial de este paso consiste en diseccionar cuidadosamente el tejido adiposo que rodea el hilio renal. La selección de ratones con menor peso corporal puede ser ventajosa, ya que normalmente tienen menos tejido adiposo alrededor del riñón, lo que facilita la exposición del riñón y el uréter y minimiza el riesgo de desgarrar el tejido circundante. Este enfoque no solo acorta la duración del procedimiento, sino que también reduce la cantidad de anestesia requerida, disminuyendo así el trauma y la dificultad técnica.

Durante la exposición renal, la evaporación puede hacer que los vasos sanguíneos se adhieran a las pinzas quirúrgicas, lo que puede provocar daño ureteral o incluso fístulas ureterales. Por lo tanto, es esencial mantener un campo operatorio húmedo mediante la aplicación continua de solución salina normal estéril. Para minimizar el desorden, es aconsejable cortar la sutura para la ligadura a una longitud razonable (aproximadamente 10 cm) antes del procedimiento, lo que permite al operador manejar los extremos de manera más efectiva¹⁴. Además, la segunda ligadura no debe colocarse directamente encima de la primera, ya que esto puede evitar una obstrucción adecuada del uréter.

La recuperación de la función renal en el modelo UUO está influenciada por la duración de la obstrucción²⁷. La gravedad de la fibrosis se correlaciona directamente con la duración de la obstrucción²⁸. En el modelo clásico de UUO descrito en este documento, los puntos de tiempo apropiados para la evaluación son los días 3, 7 y 14¹⁵. En el día 3, se pueden observar cambios tempranos en la lesión celular, incluido el aumento de la infiltración de macrófagos intersticiales. Hacia el día 7, el daño se intensifica, presentando un patrón más diferenciado caracterizado por los signos iniciales de fibrosis intersticial y áreas de atrofia tubular. El día 14 representa el momento óptimo para evaluar el fenotipo completo, que incluye hidronefrosis significativa y pérdida del parénquima renal. Los estudios en ratas han demostrado que el daño permanente ocurre después de 72 h de obstrucción, mientras que 24 h de obstrucción permite la recuperación completa de la tasa de filtración glomerular dentro de los 14 días posteriores a la reversión de la obstrucción²⁷.

Los cuidados postquirúrgicos son cruciales para minimizar la pérdida de animales. Inmediatamente después de la cirugía, se administra solución salina normal tibia mediante inyección intraperitoneal para prevenir la deshidratación en el ratón. Una vez que el ratón regresa a su jaula, es esencial proporcionarle agua y comida de fácil acceso. El procedimiento quirúrgico puede afectar la movilidad del animal; Por lo tanto, si la comida y el agua se colocan en posiciones elevadas, la comida triturada debe mantenerse en el suelo de la jaula para facilitar el acceso. Al monitorear la condición postoperatoria de los ratones, la dosis de medicamento analgésico debe aumentarse adecuadamente para aquellos que presentan un aseo deficiente, una alimentación disminuida o una postura anormal.

Cabe señalar varias limitaciones potenciales del modelo UUO. En primer lugar, este modelo no rastrea con precisión los cambios en la función renal. Los marcadores de filtración endógenos, como la creatinina y el nitrógeno ureico en sangre, se utilizan habitualmente para evaluar la función renal; Sin embargo, sus niveles a menudo permanecen estables porque el riñón no obstruido compensa la función perdida en el riñón obstruido. En segundo lugar, el modelo UUO no es adecuado para estudiar la regeneración celular y tisular, así como la posterior remodelación tisular tras la liberación de la obstrucción, debido a la ausencia de reparación tubular. Por último, el modelo de ratón UUO tiene limitaciones a la hora de trasladar los resultados del estudio del laboratorio a la cabecera del paciente, ya que la mayoría de los casos clínicos de UUO implican una obstrucción parcial en lugar de una obstrucción completa.

En conclusión, el modelo UUO en ratones se emplea ampliamente para la investigación sobre la fibrosis intersticial renal. Tiene aplicaciones potenciales en estudios destinados a identificar y caracterizar marcadores de fibrosis renal, examinar mecanismos patogénicos y explorar posibles enfoques de tratamiento para la ERC. Aunque la variabilidad en el modelo de ratón puede surgir de numerosos factores, el procedimiento detallado descrito en este estudio puede ayudar a los investigadores a desarrollar un modelo UUO altamente reproducible. Por lo tanto, un operador competente y hábil puede producir un modelo UUO consistente si se adhiere a las técnicas descritas y presta mucha atención a los detalles técnicos.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Este trabajo contó con el apoyo de las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias de China (82370686/2024YFA1107704), la beca del profesor especialmente designado de Jiangsu, el Proyecto de Innovación Científica y Tecnológica de Nanjing, el Programa de Cultivo de Talento de Alto Nivel del Hospital de la Provincia de Jiangsu (Fase I) (CZ0121002010037), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20240055) y el Equipo de Innovación Médica de Jiangsu para JR; Proyecto de Mejora de la Capacidad Clínica del Hospital de la Provincia de Jiangsu (el primer hospital afiliado a la Universidad Médica de Nanjing) (JSPH-MA-2023-4), Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (China) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81970639/82151320) a HM.