Изготовление высококачественных микропузырьковых резонаторов с режимом шепчущей галереи

В этой статье мы демонстрируем надежный и стандартизированный протокол для изготовления микропузырьковых резонаторов (MBR) с высоким фактором качества (Q-фактор) в режиме шепчущей галереи (WGM) с помощью прецизионного станка для обработки стекла (PGP).

Мы демонстрируем надежный и стандартизированный метод изготовления микропузырьковых резонаторов (MBR) с высоким коэффициентом качества (Q-фактор) в режиме шепчущей галереи (WGM) с помощью прецизионного станка для обработки стекла (PGP). Микропузырьковые резонаторы — это уникальный класс устройств WGM со встроенными жидкостными каналами, что делает их идеальными для различных областей применения. В данной работе мы демонстрируем стандартизированный протокол изготовления высокодобротных микропузырьковых резонаторов за счет оптимизации ключевых показателей производительности, таких как добротность и толщина стенки. Мы также показываем методы повышения чувствительности платформы к изменениям показателя преломления и другим чувствительным мишеням с помощью влажного травления фтористоводородной кислотой (HF). Наконец, обсуждается краткий анализ сопротивления микропузырьков потоку жидкости, показывающий, что микропузырьки меньшего диаметра проявляют большее сопротивление потоку для доставки аналита - фактор, который следует учитывать при доставке аналита. Внедрение этого усовершенствованного протокола изготовления не только повышает вероятность успешного производства устройств, но и сокращает время изготовления. Кроме того, протокол может быть расширен на другие методы, используемые для производства МБР, такие как методы на основе лазера CO₂ .

Микрорезонаторы Whispering Gallery Mode (WGM) представляют собой класс оптических датчиков, которые продемонстрировали огромный потенциал не только для обнаружения одиночных молекул и наночастиц ^1,2,3,4,5,6, но и для восприятия широкого спектра физических явлений, таких^{как магнитные} 7 и электрические поля⁸, температура⁹ и ультразвуковые волны10^{. 11}. В условиях оптического резонанса свет задерживается внутри устройства, что приводит к значительному увеличению мощности^12,13. Любое локализованное изменение в резонаторе (например, связывание биомолекулы или изменение показателя преломления окружающей среды) вызывает изменения в локальной оптической среде, тем самым смещая резонансную частоту или длину волны. Отслеживая сдвиги в резонансной длине волны или частоте, можно обнаруживать и характеризовать аналиты в режиме реального времени.

Микрорезонаторы WGM могут быть спроектированы в различных геометриях. Общие геометрии включают, помимо прочего, микротороиды¹⁴, микрокольца¹⁵ и микропузырьковые резонаторы (MBR)¹⁶. Здесь мы сосредоточимся на MBR из-за их большого потенциала в приложениях оптофлюидного зондирования. Ключевым преимуществом МБР является их гидродинамическая интеграция 17,18,19,20, которая обеспечивается за счет изготовления устройства из микрокапилляра. В этой конструкции встроенный капилляр облегчает подачу небольших объемов (т. е. микролитров) аналитов в растворе в зону чувствительности без необходимости использования внешних жидкостных каналов, как показано на рисунке 1. Обладая уникальными возможностями работы с жидкостями, MBR хорошо подходят для широкого спектра сенсорных задач, которые нелегко достижимы с помощью других платформ WGM. Например, МБР были заполнены магнитными жидкостями, тем самым усиливая чувствительность к внешним магнитным^полям21. Кроме того, МБР также используются для управления специфической ориентацией золотых наностержней в растворе с помощью оптических крутящих моментов²².

Изготовление МБР можно резюмировать следующим образом: аэростатическое давление прикладывается внутри капилляра, в то время как небольшая область капилляра нагревается локально. Сочетание локального нагрева и внутреннего давления раздувает нагретую секцию до сферической геометрии, способной поддерживать высокодобротные рабочие машины, как показано на рисунке 2. Для достижения локального нагрева капилляра могут быть использованы различные способы, такие как использование лазера²³ CO₂, оптоволоконного сплайсера²⁴, источника водородного пламени²⁵ и прецизионной машины для обработки стекла (PGP). Представленные здесь методы могут быть распространены на другие источники нагрева, в том числе на лазер CO₂. PGP похож на сварочный аппарат для оптического волокна, но обеспечивает улучшенный контроль над временем нагрева, настройкой мощности и расположением волокон или капилляров²⁶. PGP часто включают в себя встроенные микроскопы, расположенные рядом с нагревательными элементами, что позволяет контролировать процесс изготовления в режиме реального времени. Как правило, свет от перестраиваемого диодного лазера подключается к МБР через коническое оптическое волокно, которое находится в контакте с экватором МБР. Волокно сужается (до ~1 мкм) для обеспечения эффективной связи света внутри и из MBR. Полученные спектры пропускания из МБР затем захватываются фотодетектором через оптическое волокно и визуализируются на осциллографе.

Зондирование с помощью МБР WGM основано на взаимодействии поля WGM с анализируемым веществом мишени. Сила этого взаимодействия прямо пропорциональна той доле поля WGM, которая проникает в полую полость МБР, через которую могут протекать образцы жидкой или газообразной фазы²⁷. Как показано на рисунке 3, моделирование в COMSOL показывает, как проникновение поля WGM во внутреннюю полость изменяется в зависимости от толщины стенки MBR. Максимальное проникновение поля WGM происходит при уменьшении толщины стенки до менее чем 1 мкм, при этом моделирование проводится с использованием света в диапазоне 780 нм. Достижение такой уменьшенной толщины стенки только с помощью стандартного протокола изготовления с нагревом и надуванием является сложной задачей. Чтобы еще больше утончить стенки MBR и сделать устройство более чувствительным, мы включаем дополнительные этапы мокрого травления с использованием фтористоводородной (HF) кислоты.

Используя PGP, мы сосредоточимся на изготовлении МБР на линии с кремнеземным капилляром. Также будет представлено подробное описание процесса изготовления и методов повышения чувствительности к изменениям показателя преломления с помощью мокрого травления.

1. Изготовление микропузырьков

1. Начните с капилляра из кварцевого стекла с полимерным покрытием (внутренний диаметр 250 мкм и внешний диаметр 360 мкм) длиной ~75 см. Длина капилляра может варьироваться в зависимости от потребностей пользователя; Убедитесь, что описанное ниже давление достигается при большей длине капилляров.
2. Сожгите ~2,5 см полимерного покрытия на одном конце капилляра бутановой горелкой и очистите конец деликатной рабочей салфеткой и изопропиловым спиртом (IPA).
3. Поместите чистый конец капилляра в PGP и нажмите кнопку «Только сращивание» в программном обеспечении для нагрева в течение 5 с при 180 Вт, чтобы запечатать конец капилляра. Установите время и продолжительность нагрева с помощью щелчка правой кнопкой мыши по кнопке «Только стык».
4. Чтобы убедиться в правильном уплотнении, осмотрите запаянный конец капилляра (рисунок 1B).
5. На расстоянии ~25 см от запаянного конца (или на 1/3 длины капилляра от запаянного конца) сожгите от капилляра полосу полимерного покрытия длиной ~2,5 см и очистите полученный участок с помощью IPA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описанное выше положение не является критичным, так как давление равномерно распределяется по длине капилляра. Если экспериментальная настройка пользователя требует другого расположения MBR, это не должно повлиять на остальную часть процедуры.
6. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока под системой визуализации не будет видно полимера, которая отображает капиллярное изображение с субмикронным разрешением.
7. Поместите этот только что очищенный участок капилляра в стеклопроцессоре над нагревательным элементом и под микроскопом, описанным ранее.
8. С помощью газонепроницаемого шприца и шприцевого насоса нагнетайте воздух в капилляр таким образом, чтобы внутреннее давление достигло 10 бар (т. е. уменьшив объем шприца с 5 мл до 0,5 мл с соответствующим давлением, рассчитанным по закону Бойля). Установите капилляр на шприц с люэровским замком на адаптер 360 мкм. В качестве альтернативы можно подать давление через регулятор давления и сжатый воздух/инертный газ.
9. Нагрейте капилляр с помощью PGP, используя мощность нити ~100-110 Вт в течение 1,5-2 с.
10. Проведите дополнительные этапы нагрева с мощностью 90-100 Вт и 0,1-1 с обжига нити накаливания. Этот метод позволит медленно и контролируемо увеличивать диаметр МБР до нужного диапазона. Однако этот процесс может привести к асимметричным МБР. Если наблюдается асимметричная МБР (сфера не симметрична относительно капиллярной оси), поверните ее вокруг капиллярной оси между последовательными шагами нагрева, чтобы обеспечить симметрию.
11. Осмотрите MBR под микроскопом для контроля качества на наличие пыли, трещин или деформаций. Кроме того, используйте микроскоп для оценки толщины стенки МБР.

2. Мокрое травление фтористоводородной кислотой

ВНИМАНИЕ: Фтористоводородная кислота очень опасна, токсична и вызывает коррозию. Глюконат кальция следует держать поблизости, так как это химическое вещество может нейтрализовать фтористоводородную кислоту. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты и соблюдайте все меры предосторожности, указанные в Паспорте безопасности материала (MSDS).

1. Удалите запечатанный конец капилляра, разрезав на 2 см ниже запаянного конца.
2. Поместите один капиллярный конец внутрь тупого наконечника адаптера замка Люэра. Убедитесь, что внутренний диаметр тупого кончика максимально близок к внешнему диаметру капилляра, при этом убедитесь, что капилляр все еще может поместиться внутри.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Материал адаптера не должен вступать в реакцию с HF-кислотой.
3. Нанесите УФ-отверждаемую эпоксидную смолу на конец тупого кончика капилляром внутри, чтобы соединить их, затем отверждите с помощью ультрафиолетового света (источник ультрафиолетового света 50-100 Вт; более высокая мощность ускорит отверждение).
   ВНИМАНИЕ: При работе с источником ультрафиолетового излучения необходимо носить соответствующие средства защиты глаз²⁸.
4. Как только эпоксидная смола отверждится, прикрепите наконечник замка Люэра к шприцу объемом 25 мл, который инертен к HF.
5. Поместите шприц в шприцевую помпу со скоростью забора 50 мкл/мин.
6. Подсоединив один конец капилляра к шприцу, поместите другой конец капилляра в деионизированную (DI) воду.
7. Настройте шприцевой насос на забор воды через капилляр в шприц, чтобы убедиться, что установлен надлежащий поток (т. е. в системе нет пузырьков воздуха, а жидкость постоянно протекает через капилляр).
8. Переведите капиллярный конец из деионизированной воды в емкость с HF-кислотой, как только настанет надлежащий поток.
9. Рассчитайте приблизительное время травления на основе толщины стенки МБР до травления, учитывая измеренную скорость травления 8,18 мкм/ч с 12% фтористоводородной кислоты. Толщина стенки может быть измерена с помощью системы визуализации, которая отображает МБР с субмикронным разрешением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость травления для кислот других концентраций может быть определена опытным путем. Это можно сделать, измерив толщину стенки капилляра до и после заданного времени травления.
10. Запустите шприцевой насос со скоростью 50 мкл/мин для расчета времени травления.
11. Промойте капилляр деионизированной водой в течение 10-15 минут, чтобы удалить всю кислоту из капилляра по истечении времени травления. Рассчитайте время полоскания, чтобы промыть весь объем капилляра 3-5 раз.
12. Измерьте толщину стенки МБР после травления. Используйте эту информацию для обновления скорости травления для кислоты.
13. Повторять этот процесс можно до тех пор, пока не будет достигнута желаемая толщина стенки.

Репрезентативная МБР, изготовленная с помощью станка PGP, показана на рисунке 1C. Учитывая, что наш начальный внешний диаметр капилляра (OD) составляет 360 мкм, мы расширяем капилляр в ~2 раза в процессе изготовления. Расширение капилляра до ~700 мкм приводит к толщине стенки от 5 мкм до 15 мкм. Было показано, что оптимальная толщина стенки для биозондирования с помощью МБР составляет порядка длины волны света, используемого для возбуждения WGM²⁷. МБР теоретически могут достигать коэффициента качества 1 x 10⁹, но 1 x 10⁶ достаточно для большинства биосенсорных приложений 29,30,31.

Чтобы проверить смоделированные результаты, показанные на рисунке 3, мы оценили реакцию МБР с различной толщиной стенки на различные концентрации растворов хлорида натрия. Рисунок 4 подтверждает смоделированные результаты, демонстрируя значительное увеличение чувствительности показателя преломления при толщине стенки МБР около 1 мкм. Три «толстостенные» МБР (т.е. толщина стенки 9,4 мкм, 7,4 мкм и 5,0 мкм) показали уменьшающуюся реакцию на изменения показателя преломления по мере увеличения толщины стенки, как и ожидалось. На рисунке 5 представлен типичный передаваемый спектр МБР. В широком диапазоне сканирования спектр демонстрирует высокую модальную плотность. В узком диапазоне сканирования 40 пм лазер сканирует в нескольких резонансах. Отслеживая резонансный сдвиг, можно выбрать один режим высокой добротности для измерения в этом тонком диапазоне сканирования. Показатели контроля качества для изготовления МБР могут быть использованы для качественной оценки как физических, так и оптических свойств для оптимизации производительности биозондирования. К двум важным показателям относятся добротность резонатора (≥1 x 10⁶) и малая толщина стенки для максимального взаимодействия между WGM и целевым аналитом (<1 мкм).

Как упоминалось ранее, интегрированная оптическая и жидкостная работа является неотъемлемым преимуществом MBR, что делает их привлекательными для сенсорных приложений. Учитывая это, мы стремились исследовать флюидные свойства капилляров. Экспериментируя с капиллярами различной длины 20 см, 40 см или 80 см и тестируя различные скорости потока, 100 мкл/мин, 250 мкл/мин и 500 мкл/мин, для каждой длины капилляра, мы обнаружили, что внутренний диаметр (ID) МБР существенно влияет на эффективность транспортировки жидкости (Таблица 1). В частности, по мере увеличения ID MBR с 75 мкм до 250 мкм эффективность транспортировки жидкости через эти микрокапилляры значительно улучшается, что позволяет протягивать через микрокапилляры 95-100% заданного объема жидкости. Эти расширенные возможности подчеркивают потенциал MBR большего диаметра для оптимизации работы с жидкостями, что делает их особенно подходящими для различных областей применения датчиков, где динамика жидкости имеет решающее значение.

Рисунок 1: Обзор экспериментальной установки. (A) Схема сенсорной системы WGM MBR с волноводной связью. WGM возбуждается перестраиваемым диодным лазером и контролируется фотодетектором через конический волоконно-оптический волновод. Затем аналит подается по встроенному жидкостному каналу, где он взаимодействует с полем WGM. (B) Микрофотография капилляра размером 360 мкм, запечатанного PGP. (В) Микрофотография МБР после изготовления. Стрелки указывают, где были объединены две микрофотографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Схема процесса изготовления МБР, включая дополнительный этап травления HF. (1) Начните с капилляра из кварцевого стекла (внешний диаметр 360 мкм). (2) Удалите полимерное покрытие с помощью небольшого пламени и очистите поверхность изопропиловым спиртом (IPA). (3) Для создания внутреннего давления один конец капилляра должен быть герметизирован. Этот шаг делается с помощью PGP. (4) Увеличьте внутреннее давление воздухом и обжгите нить PGP, чтобы локально нагреть капилляр и накачать MBR до сферической геометрии. (5) Необязательно. Протравите внутреннюю часть капилляра кислотой HF для истончения стенок и повышения чувствительности при биосенсорике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Моделирование проплавления в полевых условиях. (A) Моделирование проникновения WGM в MBR при толщине стенки в субмикронном диапазоне. (Б-Г) Напряженность электрического поля в МБР для стенок различной толщины, показывающая большее проникновение затухающего поля в ядро резонатора для стен толщиной <1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Реакция МБР на изменение RI. Реакция МБР различной толщины стенки на различные концентрации растворов NaCl, показывающая заметное улучшение при переходе стенки в режим 1 мкм за счет большего проникновения WGM в жидкость, протекающую через внутреннюю часть резонатора, соединенного с жидкостным каналом в капиллярной структуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Типичный спектр WGM для MBR. (A) Большая дальность сканирования в одном свободном спектральном диапазоне. (B) Тонкое сканирование по нескольким WGM. (C) Увеличенный вид WGM в B) и его подгонка кривой, показывающая форму линии Лоренца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Процентное содержание деионизионной воды, проходящей через два капилляра с диоксидом кремния.

В этой статье мы описали протокол изготовления высококачественных микропузырьковых резонаторов (MBR) с использованием прецизионного стеклянного процессора. Мы представляем важнейшие этапы в протоколе изготовления, включая этапы нагрева и расширения. В этом случае сочетание перегрева, слишком длительного нагрева или слишком большого внутреннего давления воздуха может привести к неудачному изготовлению. Для решения этих проблем могут помочь такие корректировки, как снижение мощности нагрева или продолжительности нагрева в программном пользовательском интерфейсе машины PGP. Однако это не единственный метод, используемый для изготовления МБР. В литературе существует несколько других протоколов, но большинство методов имеют одни и те же основные шаги - нагрев и расширение. В других методах изготовления используются различные источники нагрева, такие как дуговой разряд от сварочного аппарата для оптоволокна или лазерной системы CO₂ , в то время как в прецизионном обработчике стекла используется графитовый нагревательный элемент. Способ³² дугового разряда аналогичен PGP в том, что оба подхода имеют встроенные микроскопы для наблюдения за процессом нагрева. Одним из основных недостатков метода дугового разряда является то, что эти устройства практически не обеспечивают контроля над положением микрокапилляра, что затрудняет точную регулировку положения капилляра.

Использование лазера CO₂ ³³ в качестве нагревательного элемента имеет несколько преимуществ. В этой конфигурации два встречно распространяющихся лазерных луча CO₂ одинаковой мощности сходятся на микрокапилляре с противоположных направлений, равномерно нагревая микрокапилляр. Этот равномерный нагрев, наряду с внутренним давлением, позволяет создать симметричную МБР без необходимости вращения микрокапилляра во время изготовления. Но работа с мощным лазером в свободном пространстве имеет свои проблемы с безопасностью и должна выполняться с надлежащей подготовкой и строгими мерами предосторожности, характерными для использования лазера CO₂ .

Также представлены методы уменьшения толщины стенок МБР с помощью HF-кислоты для повышения чувствительности устройств к изменению показателя преломления. Использование HF-кислоты является распространенным методом постепенного травления и истончения стенок МБР с кремнеземом, но этот метод мокрого травления может увеличить шероховатость поверхности и, как следствие, снизить добротность. Другие специалисты добились тонкостенной МБР путем нагревания микрокапилляра во время его вытягивания, тем самым сужая капилляр³³ перед изготовлением МБР. Хотя этот метод не требует использования кислот, внутренний диаметр уменьшается при сужении капилляра, что приводит к проблемам с жидкостной обработкой.

Биосенсорика с помощью МБР требует точной доставки различных растворов, таких как силаны, специфические антитела, белки и другие мишени, представляющие интерес; Поэтому очень важна надежная работа с жидкостями. Одним из основных преимуществ использования MBR является встроенный жидкостный канал, обеспечиваемый капилляром, который обеспечивает эффективную и целенаправленную доставку аналита в жидкой или газообразной фазе. Это представляет собой усовершенствование по сравнению с другими микрорезонаторами WGM, которые требуют дополнительных внешних микрофлюидных каналов для адресной доставки аналита ^5,34,35. Одной из проблем использования интегрированного капилляра для доставки жидкости является жидкостное сопротивление микрокапилляра. Уравнение 1 показывает, что сопротивление R потоку жидкости обратно пропорционально четвертой степени радиуса r.

(1)

Где η — вязкость жидкости, а L — длина жидкостного канала. Мы сравнили жидкостное сопротивление для двух разных размеров капилляров: внутренний диаметр (ID) 75 μm и внутренний диаметр 250 μm. Капилляр с внутренним диаметром 75 мкм может вытягивать только ~10% от целевого объема деионизированной воды при относительно низкой скорости потока (100 мкл/мин). Капилляр с внутренним диаметром 250 мкм вытягивает 90-100% целевого объема деионизированной воды при той же скорости потока (100 мкл/мин).

(2)

Уравнение 2 показывает, что сила вязкого сопротивления F_вязкая прямо пропорциональна скорости жидкости v_m. Здесь η представляет вязкость жидкости, а L — длину цилиндрического канала. Это уравнение показывает, что сила вязкого сопротивления увеличивается с потоком жидкости. Эта тенденция наблюдается и экспериментально. Это подтверждает нашу гипотезу о том, что увеличение диаметра капилляра снизит жидкостное сопротивление в капилляре и улучшит общую обработку жидкости устройством.

Таким образом, мы продемонстрировали надежный протокол для изготовления воспроизводимых WGM MBR со встроенными жидкостными каналами с использованием PGP, включая метрики контроля качества. Этот протокол прост, воспроизводим и экономичен. Он может быть в дальнейшем расширен для других методов нагрева, таких как оптоволоконные сращиватели и лазеры CO₂ . Дополнительные усовершенствования могут включать использование систем высокого давления с инертными газами, такими как N₂ , для контроля внутреннего давления капилляра в процессе изготовления. Кроме того, мы внедрили протоколы для повышения чувствительности МБР к связыванию биомолекул и изменениям объемного показателя преломления с помощью травления HF. Наконец, размер капилляров был изучен с точки зрения сопротивления жидкости потоку. Наши результаты показали, что за счет увеличения внутреннего диаметра капилляра можно установить надежный поток, способствующий точной доставке чувствительных мишеней.

Авторам нечего раскрывать.

Этот проект был частично поддержан компанией R41AI152745. AJQ финансировался премией T32 Cancer Biology Award (NIH CA009547) и K08EB033409.