高品質ウィスパリングギャラリーモードマイクロバブル共振器の作製

ここでは、精密ガラス加工機(PGP)を使用して、高品質ファクター(Qファクター)ウィスパリングギャラリーモード(WGM)マイクロバブル共振器(MBR)を製造するための堅牢で標準化されたプロトコルを実証します。

私たちは、精密ガラス加工機(PGP)を使用して、高品質ファクター(Qファクター)ウィスパリングギャラリーモード(WGM)マイクロバブル共振器(MBR)を製造するための堅牢で標準化された方法を実証します。マイクロバブル共振器は、流路が統合されたWGMデバイスのユニークなクラスであり、多様なセンシングアプリケーションに最適です。ここでは、Qファクターや肉厚などの主要な性能指標の最適化を通じて、高Qマイクロバブル共振器を製造するための標準化されたプロトコルを示します。また、フッ化水素酸(HF)ウェットエッチングを通じて、屈折率の変化やその他のセンシングターゲットに対するプラットフォームの感度を向上させる方法も示しています。最後に、流体の流れに対するマイクロバブルの抵抗性に関する簡単な分析について説明し、直径の小さいマイクロバブルは分析物の送達に対してより大きな抵抗を示すことを示し、これは分析物の送達で考慮すべき要素です。この洗練された製造プロトコルの実装は、デバイス製造の成功率を高めるだけでなく、製造時間も短縮します。さらに、このプロトコルは、CO₂ レーザーベースの方法など、MBRの作成に使用される他の技術に拡張できます。

WGM(Whispering Gallery Mode)マイクロ共振器は、単一分子やナノ粒子1,2,3,4,5,6の検出だけでなく、磁気7や電場⁸、温度9、超音波¹⁰などの幅広い物理現象の検出にも大きな可能性を示した光学センサの一種である^。11.光共鳴条件下では、光はデバイス内に閉じ込められ、大きなパワー増幅^12,13につながります。共振器の局所的な変化(生体分子の結合や周囲の媒体の屈折率の変化など)は、局所的な光学環境の変化を誘発し、共振周波数または波長をシフトさせます。共鳴波長または周波数のシフトを監視することにより、分析物をリアルタイムで検出し、特性評価することができます。

WGMマイクロ共振器は、さまざまな形状で設計できます。一般的な形状には、限定するものではないが、マイクロトロイド¹⁴、マイクロリング¹⁵、およびマイクロバブル¹⁶共振器(MBR)が含まれる。ここでは、光流体センシングアプリケーションにおけるMBRの大きな可能性に焦点を当てます。MBRの主な利点は、マイクロキャピラリーからのデバイスの製造によって可能になる流体統合17,18,19,20です。この設計では、インラインキャピラリーにより、図1に示すように、外部の流体チャネルを必要とせずに、溶液中の少量(マイクロリットル)の分析物をセンシングエリアに簡単に送達できます。MBRは、独自の流体ハンドリング機能により、他のWGMプラットフォームでは容易に達成できない幅広いセンシングアプリケーションに適しています。例えば、MBRは磁性流体で満たされており、それによって外部磁界²¹に対する感度が注入されている。さらに、MBRは、光学トルク²²を通じて溶液中の金ナノロッドの特定の配向を制御するためにも使用されてきた。

MBRの製造は次のように要約できます:空圧はキャピラリーの内部に加えられ、キャピラリーの小さな領域は局所的に加熱されます。局所的な加熱と内圧の組み合わせにより、図2に示すように、加熱されたセクションが膨らみ、高Q WGMをサポートできる球形になります。毛細管の局所的な加熱を達成するために、_CO2^{レーザー23}、光ファイバースプライ^サー24、水素火炎源²⁵、および精密ガラス加工機(PGP)を使用するなど、さまざまな方法を採用することができる。ここで紹介する方法は、CO₂レーザーなどの他の加熱源に拡張できます。PGPは、光ファイバスプライサーと似ているが、加熱時間、電力設定、およびファイバまたはキャピ^ラリー26の位置決めに対する強化された制御を提供する。PGPには、発熱体に隣接して顕微鏡が組み込まれていることが多く、製造プロセスのリアルタイム監視が可能です。通常、波長可変半導体レーザーからの光は、MBRの赤道に接触しているテーパー光ファイバーを介してMBRに結合されます。ファイバーはテーパー状 (~1 μm まで) されており、MBR に出入りする光の効率的な結合を可能にします。MBRから得られた透過スペクトルは、光ファイバーを介して光検出器によって捕捉され、オシロスコープで視覚化されます。

WGM MBRによるセンシングは、WGMフィールドとターゲット分析種との相互作用に依存します。この相互作用の強度は、液相または気相のサンプルが²⁷を流れることができるMBRの中空キャビティを貫通するWGMフィールドの割合に正比例します。 図3に示すように、COMSOLシミュレーションは、WGMフィールドの内部キャビティへの浸透がMBRの肉厚によってどのように変化するかを示しています。WGMフィールドの最大電界浸透は、壁の厚さが1μm未満に減少すると発生し、これらのシミュレーションは780nm帯の光を使用して行われます。このような肉厚の減少を、標準的な加熱膨張法だけで実現することは困難です。MBRの壁をさらに薄くし、デバイスの感度を高めるために、フッ化水素(HF)酸を使用した追加のウェットエッチングステップを組み込んでいます。

PGPを用いて、シリカキャピラリーに沿ったMBRの作製に着目します。また、ウェットエッチングによる屈折率変化に対する感度を高めるための作製プロセスと方法について詳しく説明します。

1. マイクロバブルの作製

1. まず、ポリマーコーティングされたシリカガラスキャピラリー(内径250μm、外径360μm)で、長さは~75cmです。キャピラリーの長さは、ユーザーのニーズによって異なります。以下で説明する圧力が、より長い毛細管長で到達していることを確認してください。
2. キャピラリーの一端にあるポリマーコーティングの~2.5cmをブタントーチで焼き払い、デリケートなタスクワイプとイソプロピルアルコール(IPA)で端を清掃します。
3. キャピラリーのクリーンな端をPGPに配置し、ソフトウェアの スプライスのみ ボタンをクリックして180Wで5秒間加熱し、キャピラリーの端をシールします。ス プライスのみ のボタンを右クリックして、加熱時間と時間を設定します。
4. 適切にシールされていることを確認するために、シールされたキャピラリーエンドを調べます( 図1B)。
5. 密封された端から~25 cm(または密封された端から毛細管の長さの1/3)で、毛細管から~2.5 cmの長さのポリマーコーティングのストリップを焼き払い、得られた領域をIPAで洗浄します。
   注:圧力は毛細管の長さに沿って均等に分散されるため、上記の位置は重要ではありません。ユーザーの実験セットアップでMBRの異なる配置が保証されている場合、これは手順の残りの部分に影響を与えないはずです。
6. イメージングシステムの下にポリマーが見えなくなるまでこの手順を繰り返し、サブミクロンの解像度でキャピラリー画像を表示します。
7. この新しく洗浄されたキャピラリーの部分をガラス処理装置の発熱体上および前述の顕微鏡の下に置きます。
8. 気密シリンジとシリンジポンプを使用して、内圧が10バールに達するようにキャピラリーに空気を注入します(つまり、シリンジ内の容量を5 mLから0.5 mLに減らし、対応する圧力をボイルの法則で計算します)。キャピラリーを360μmアダプターへのルアーロック付きのシリンジに取り付けます。または、圧力調整器と圧縮空気/不活性ガスを介して圧力を加えます。
9. キャピラリーをPGPで100~110Wのフィラメント電力で1.5〜2秒間加熱します。
10. フィラメントを90-100 Wおよび0.1-1 sの焼成で追加の加熱ステップを行います。この方法では、MBRの直径をゆっくりと制御可能に拡大します。ただし、このプロセスにより、MBRが非対称になる可能性があります。非対称MBRが観察された場合(球が毛細管軸に対して対称でない)、連続する加熱ステップ間で毛細管軸を中心に回転させて対称性を促進します。
11. 品質管理のために顕微鏡でMBRを検査し、ほこり、亀裂、変形などを探します。さらに、ここで顕微鏡を使用してMBRの肉厚を推定します。

2.フッ化水素酸によるウェットエッチング

注意:フッ化水素酸は非常に危険で、毒性があり、腐食性があります。グルコン酸カルシウムは、この化学物質がフッ化水素酸を中和する可能性があるため、近くに置いておく必要があります。適切な個人用保護具を着用し、製品安全データシート(MSDS)のすべての安全上の注意に従ってください。

1. キャピラリーの密閉された端を、密閉された端から2cm下に切り込んで取り外します。
2. キャピラリーの端をルアーロックアダプターの鈍い先端の内側に置きます。鈍い先端の内径がキャピラリーの外径にできるだけ近いことを確認しながら、キャピラリーがまだ内側に収まることを確認します。
   注意: アダプターの材料はHF酸と反応してはなりません。
3. 鈍い先端の端にUV硬化型エポキシを塗布し、キャピラリーを内側にして2つを接合し、UV光(50〜100 W UV光源、ワット数が高いほど硬化が速くなります)で硬化させます。
   注意: UV光源²⁸を操作するときは、適切な目の保護具を着用する必要があります。
4. エポキシ樹脂が硬化したら、HFに対して不活性な25 mLシリンジにルアーロックチップを取り付けます。
5. シリンジを吸引速度50μL / minのシリンジポンプに入れます。
6. キャピラリーの一方の端をシリンジに接続した状態で、キャピラリーのもう一方の端を脱イオン(DI)水に入れます。
7. シリンジポンプをキャピラリーからシリンジに水を引き込むようにセットして、適切な流れが確立されていることを確認します(つまり、キャピラリーを一貫して液体が流れる気泡がシステムにありません)。
8. 適切な流れが確立されたら、毛細管端をDI水からHF酸の容器に移します。
9. 12%(w/v)のフッ化水素酸で測定されたエッチング速度が8.18 μm/hであることを考慮して、エッチング前のMBR壁の厚さに基づいておおよそのエッチング時間を計算します。壁の厚さは、サブミクロンの解像度でMBRを表示するイメージングシステムの下で測定できます。
   注:他の濃度の酸のエッチング速度は、経験的に決定できます。これは、設定されたエッチング時間の前後の毛細管壁の厚さを測定することで行うことができます。
10. シリンジポンプを50 μL/minで、計算されたエッチング時間で運転します。
11. エッチング時間が経過した後、キャピラリーをDI水で10〜15分間すすぎ、キャピラリーからすべての酸を取り除きます。すすぎ時間を計算して、キャピラリーボリューム全体を3〜5回すすぎます。
12. エッチング後のMBR肉厚を測定します。この情報を使用して、酸のエッチング速度を更新します。
13. このプロセスを繰り返して、目的の肉厚が達成されるまで繰り返すことができます。

PGPマシンで作製した代表的なMBRを図1Cに示します。開始キャピラリーの外径(OD)が360μmであることから、製造工程ではキャピラリーを~2倍に拡大します。キャピラリーを~700 μmに拡張すると、壁の厚さは5 μmから15 μmになります。MBRによるバイオセンシングの最適な肉厚は、WGM²⁷を励起するために使用される光の波長のオーダーであることが示されています。MBRは理論的には1 x 10⁹の品質係数を達成できるが、ほとんどのバイオセンシングアプリケーションには1 x 10⁶で十分である29,30,31。

図3のシミュレーション結果を検証するために、さまざまな濃度の塩化ナトリウム溶液に対するさまざまな壁の厚さのMBRの応答を評価しました。図4は、MBRの肉厚が約1μmのときに屈折率感度が有意に向上したことを示すシミュレーション結果を確認したものです。3つの「厚肉」MBR(すなわち、壁厚9.4μm、7.4μm、および5.0μm)は、予想通り、壁厚が増加するにつれて屈折率変化に対する応答が減少することを示しました。図5は、MBRの一般的な送信スペクトルを示しています。広いスキャン範囲にわたって、スペクトルは高いモード密度を示します。40 pmの狭いスキャン範囲内で、レーザーは複数の共鳴をスキャンします。共振シフトを追跡することにより、この微細なスキャン範囲内で検出するための1つのHigh-Qモードを選択できます。MBR製造の品質管理指標は、バイオセンシング性能を最適化するために、物理的特性と光学的特性の両方を定性的に評価するために使用できます。2つの重要な指標には、共振器の品質係数(≥1 x 10⁶)と、WGMとターゲット分析物との間の相互作用を最大化するための小さな肉厚(<1 μm)が含まれます。

前述のように、統合された光学的および流体ハンドリングはMBRの固有の強みであり、センシングアプリケーションにとって魅力的です。そこで、私たちは毛細血管の流体特性を探ろうとしました。20 cm、40 cm、または80 cmのさまざまな長さのキャピラリーで実験し、キャピラリーの長さごとに100 μL/min、250 μL/min、500 μL/minのさまざまな流量をテストすることにより、MBRの内径(ID)が流体輸送効率に大きく影響することがわかりました(表1)。具体的には、MBR IDが75μmから250μmに増加すると、これらのマイクロキャピラリーを介した液体輸送効率が大幅に向上し、設定量の液体の95〜100%をマイクロキャピラリーを介して引き込むことができます。この強化された機能により、大口径のMBRは流体処理の最適化に利用できる可能性が浮き彫りになり、流体力学が重要な多様なセンシングアプリケーションに特に適しています。

図1:実験セットアップの概要。 (A)導波管結合WGM MBRセンサシステムの概略図。WGMはチューナブルダイオードレーザーによって励起され、テーパー光ファイバー導波路を介して光検出器で監視されます。その後、分析対象物はインライン流路を介して送達され、そこでWGMフィールドと相互作用します。(B)PGPで密封された360μmのキャピラリーの顕微鏡写真。(C)作製後のMBRの顕微鏡写真。矢印は、2 つの顕微鏡写真がマージされた場所を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:オプションのHFエッチングステップを含むMBRの製造プロセスの概略図( 1)石英ガラスキャピラリー(外径360μm)から開始します。(2)ポリマーコーティングを小さな炎で取り除き、イソプロピルアルコール(IPA)で表面を清掃します。(3)内圧を高めるためには、キャピラリーの一端を密閉する必要があります。この手順は PGP を使用して行います。(4)空気で内圧を上げ、PGPフィラメントを燃焼させて毛細管を局所的に加熱し、MBRを球状に膨らませます。(5) オプション。キャピラリーの内部をHF酸でエッチングして壁を薄くし、バイオセンシングの感度を高めます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:WGMのフィールドペネトレーションシミュレーション。 (A)肉厚がサブミクロンの範囲にある場合のMBRへのWGM浸透のシミュレーション。(B-D)さまざまな壁の厚さに対するMBR内の電界強度は、<1μmの厚さの壁の共振器のコアへのエバネッセントフィールドのより大きな浸透を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:RIの変化に対するMBRの応答。 NaCl溶液の濃度が異なる場合、壁の厚さが異なるMBRの応答は、キャピラリー構造の流体チャネルに接続された共振器の内部を流れる液体へのWGMの浸透が大きいため、壁が1μm領域に入るときに顕著な改善を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:MBRの一般的なWGMスペクトル。 (A)1つの自由スペクトル範囲にわたる広いスキャン範囲。(B)いくつかのWGMにわたるファインスキャン(C)B)のWGMのズームインビューと、ローレンツ線形状を示すそのカーブフィッティング。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:2つの異なるサイズのシリカキャピラリーから引き出されたDI水の割合。

ここでは、精密ガラスプロセッサを使用して高品質のウィスパリングギャラリーモード(WGM)マイクロバブル共振器(MBR)を製造するためのプロトコルについて説明しました。熱ステップや膨張ステップなど、製造プロトコルの重要なステップを示します。ここでは、過熱、加熱が長すぎる、または内部空気圧を注入しすぎることが組み合わさって、製造が失敗する可能性があります。これらの問題に対処するには、PGPマシンのソフトウェアユーザーインターフェースで加熱電力や加熱時間を下げるなどの調整が役立ちます。ただし、MBRの製造に使用される方法はこれだけではありません。文献には他にもいくつかのプロトコルが存在しますが、ほとんどの方法は、加熱と膨張という同じ基本的な手順を共有しています。他の製造方法では、融着接続機やCO₂ レーザーシステムからのアーク放電など、さまざまな加熱源を利用しますが、精密ガラスプロセッサはグラファイト発熱体を使用します。アーク放電法³² は、両方のアプローチが加熱プロセスを監視するための内蔵顕微鏡を有するという点でPGPと類似している。アーク放電方式の主な欠点の1つは、これらのデバイスがマイクロキャピラリーの位置をほとんど制御できないため、キャピラリーの位置を正確に調整するのが難しいことです。

発熱体としてCO₂^{レーザー33}を使用すると、いくつかの利点があります。この構成では、等しい出力の2つの逆伝播CO₂レーザービームが反対方向からマイクロキャピラリーに収束し、マイクロキャピラリーを均一に加熱します。この均一な加熱と内圧により、製造中にマイクロキャピラリーを回転させることなく、対称的なMBRを作成することができます。しかし、フリースペースの高出力レーザーの操作には独自の安全上の懸念があり、CO₂レーザーの使用に固有の適切なトレーニングと厳格な予防措置を講じて実行する必要があります。

また、HF酸を使用してMBRの肉厚を薄くし、屈折率の変化に対するデバイスの感度を向上させる方法も紹介します。HF酸を使用することは、MBRのシリカ壁を徐々にエッチングして薄くする一般的な方法ですが、このウェットエッチング方法では表面粗さが増加し、その結果、品質係数が低下する可能性があります。他のものは、マイクロキャピラリーを引っ張りながら加熱することにより薄肉MBRを達成し、それによりMBRを製造する前にキャピ^ラリー33 を先細にしている。この方法では酸を使用する必要はありませんが、キャピラリーをテーパーにすると内径が小さくなり、流体の取り扱いに問題が生じます。

MBRによるバイオセンシングには、シラン、特異的抗体、タンパク質、その他の目的のターゲットなど、さまざまな溶液を正確に送達する必要があります。したがって、信頼性の高い流体ハンドリングは非常に重要です。MBRを使用する主な利点の1つは、キャピラリーによって提供される統合された流体チャネルであり、これにより、液相または気相で分析対象物を効率的かつ的確に送達できます。これは、ターゲット分析^物の送達^5,34,35のために追加の外部マイクロ流体チャネルを必要とする他のWGMマイクロ共振器よりも改善されています。統合されたキャピラリーを液体の送達に使用する際の課題の1つは、マイクロキャピラリーの流体抵抗です。式 1 は、流体の流れに対する抵抗 R が半径 r の 4 乗に反比例することを示しています。

(1)

ここで、η は流体の粘度、Lは流体チャネルの長さです。内径75μm(ID)と内径250μmの2つの異なるキャピラリーサイズの流体抵抗を比較しました。内径 75 μm のキャピラリー サイズでは、比較的低い流量 (100 μL/min) で DI 水の目標体積の ~10% しか引き込むことができませんでした。内径250μmのキャピラリーは、同じ流量(100μL/min)で目標量のDI水の90〜100%を引き抜きました。

(2)

式 2 は、粘性抵抗力 F_粘性が流体速度 v_m に正比例することを示しています。ここで、 η は流体の粘度を表し、 L は円筒形チャネルの長さです。この式は、粘性抵抗力が流体の流れとともに増加することを示しています。この傾向は実験的にも観察されています。これは、毛細管の直径を大きくすると、毛細管内の流体抵抗が減少し、デバイスの全体的な流体の取り扱いが改善されるという仮説を裏付けています。

要約すると、PGPを使用して流体チャネルを統合した再現性のあるWGM MBRを製造するための信頼性の高いプロトコル(品質管理指標を含む)を示しました。このプロトコルは、シンプルで再現性があり、費用対効果に優れています。さらに、光ファイバースプライサーや_CO2 レーザーなどの他の加熱方法に拡張できます。その他の改善点としては、_N2 のような不活性ガスを使用する高圧システムを使用して、製造プロセス中にキャピラリーの内部圧力を制御することが含まれるかもしれません。さらに、HFエッチングを通じて生体分子の結合とバルク屈折率の変化に対するMBRの感度を高めるためのプロトコルを導入しました。最後に、キャピラリーのサイズを流動抵抗の観点から研究しました。その結果、キャピラリーの内径を大きくすることで、センシングターゲットの正確な送達を容易にする信頼性の高い流れを確立できることが示されました。

著者は何も開示していません。

このプロジェクトは、R41AI152745によって部分的にサポートされました。AJQは、T32 Cancer Biology Award(NIH CA009547)およびK08EB033409から資金提供を受けました。