Определение концентрации общего белка и биологически активного белка в молозиве крупного рогатого скота

Бычье молозиво является как основным источником питательных веществ, так и иммунологической поддержкой для новорожденного теленка. Понимание уровня терапевтических белков (лактоферрина и IgG) важно для дозирования бычьего молозива и стандартизации для потребления человеком.

Молозиво – это сложная биологическая жидкость, вырабатываемая млекопитающими сразу после родов. Он удовлетворяет все потребности новорожденных в питательных веществах как хороший источник макро- и микроэлементов, биоактивных пептидов и факторов роста. Бычье молозиво также является потенциальным источником питательных веществ и биологически активным из-за богатого содержания белка, который включает иммуноглобулин G (IgG) и лактоферрин. Однако уровень лактоферрина и IgG в коровьем молозиве заметно меняется в период лактации. Поэтому контроль концентрации IgG и лактоферрина для использования бычьего молозива в качестве источника белка является важным вопросом для изучения. Методы, описанные в данной статье, описывают, как определить содержание белка, а также удельные концентрации лактоферрина и IgG. Эти методы включают в себя следующие этапы: выделение белков молозива крупного рогатого скота, определение концентрации белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA), визуализация белков с помощью SDS-PAGE, определение лактоферрина и концентрации IgG с помощью анализа ELISA.

Молозиво – это начальная секреция молочной железы, вырабатываемая млекопитающими вскоре после родов. Молозиво богато макро- и микроэлементами, антимикробными пептидами и факторами роста 1,2,3,4. Состав постепенно меняется с течением времени при переходе на зрелое молоко ^5,6,7, но наиболее значительно в течение 24 ч после родов⁸. На состав молозива также влияют материнские факторы, включая возраст, паритет, породу, здоровье и состояние питания, а также внешние факторы, включая сезон, преждевременные роды, преждевременную лактацию, факторы обработки молозива (скопление молозива и температура хранения) и индукцию родов ^9,10,11. По сравнению со зрелым молоком, молозиво содержит меньше лактозы и больше жира, белка, пептидов, небелкового азота, золы, гормонов, факторов роста, цитокинов, нуклеотидов, витаминов и минералов¹². Бычье молозиво содержит широкий спектр белков, включая иммуноглобулины, лактоферрин, α-лактальбумин (α-LA), β-лактоглобулин (β-Lg), лактопероксидазу и несколько факторов роста¹³. Общая концентрация белка в коровьем молозиве колеблется от 11,26 мг/мл до 169,55 мг/мл¹⁴. Содержание белка состоит из сыворотки и казеина в средней концентрации 124,00 мг/мл и 26,00 мг/мл соответственно¹⁵. Сывороточная часть содержит три основных типа иммуноглобулинов (Igs): IgG (85%-90%), IgM (7%) и IgA (5%)¹⁶. Основным Ig в коровьем молозиве является IgG, который обеспечивает пассивный иммунитет и модулирует адаптивную и врожденную иммунную системы у теленка¹⁷. Исходная концентрация Ig в молозиве крупного рогатого скота первого раза может колебаться от 20 до 200 мг/мл и снижаться примерно до 0,4-1,0 мг/^мл18. Средняя концентрация IgG составляет примерно 60 мг/мл и неуклонно снижается до уровня ниже 1 мг/мл на протяжении всего перехода к зрелому^{молоку19}.

Другим важным биологически активным белком в молозиве является лактоферрин, железосвязывающий гликопротеин с концентрацией 1,5-5 мг/мл. К свойствам лактоферрина относятся повышение абсорбции железа, а также обладание антимикробной активностью^20,21, связывание липополисахаридов, иммуномодуляция, стимуляция роста эпителиальных клеток кишечника и фибробластов²². Бычье молозиво также содержит α-лактальбумин и β-лактоглобулин. Эти белки являются источниками незаменимых аминокислот, а также обладают бактерицидной активностью 23,24,25. Средние концентрации α-LA и β-Lg в молозиве составляют в среднем 2,77 мг/^мл2 и 11,5 мг/^мл26 соответственно. В дальнейшем эти концентрации снижаются до 1-1,5 мг/мл²⁷ и 4,8 мг/мл²⁶ в зрелом молоке. Молозиво также содержит значительное количество лактопероксидазы (в среднем 22,8 мкг/мл) и лизоцима (в среднем 0,40 мкг/мл)²⁶. Лактопероксидаза представляет собой гликопротеин, обладающий антимикробной активностью в отношении грамположительных и отрицательных бактерий²⁸ путем продуцирования активных форм кислорода. Лизоцим действует как антимикробное средство, расщепляя пептидогликановый компонент клеточных стенок бактерий, тем самым приводя к гибели клеток^29,30.

Благодаря своим свойствам, IgG и лактоферрин перерабатываются в различные пищевые продукты для обогащения детских смесей, пищевые добавки, высокобелковые препараты для выздоравливающих и спортсменов, а также в фармакологии и косметологии 31,32,33. Бычье молозиво является важным источником IgG и лактоферрина. Однако состав этих биологически активных белков в коровьем молозиве заметно меняется в период лактации. Поэтому мониторинг изменений концентрации этих биологически активных белков в образцах молозива, используемых для исследований и обработки пищевых продуктов, имеет решающее значение. Целью данного исследования является описание методов мониторинга концентрации и состава общего белка, лактоферрина и IgG в коровьем молозиве в течение 6 дней после отела.

Образцы молозива были собраны в течение 6 дней после отела в полдень в период с июля по август у 28 молочных коров голштинской породы из компании Uluova Milk Trading Company в Чанаккале, Турция, и были глубоко заморожены. Образцы, собранные в один и тот же день, были объединены в соответствии с днем каждого образца и проанализированы на общую концентрацию белка, лактоферрина и IgG. Все образцы были проанализированы в двух экземплярах.

1. Подготовка образцов

1. Смешайте 200 μL бычьего молозива с 400 μL dH₂O для получения разбавленного образца для анализа. Разбавьте все образцы соответствующим образом.
2. Центрифугируйте разбавленные и неразбавленные образцы при 4 °C, 1000 x g в течение 30 мин.
3. Отделите среднюю фазу в новую пробирку с соответствующей маркировкой. Повторите шаг 1.2. для получения четкой средней фазы. Храните всю среднюю фазу и разбавленные образцы при температуре -20 °C, если не использовать сразу.
4. Используйте среднюю фазу, полученную из разбавленных образцов, для анализов BCA, SDS-PAGE и лактоферрина. Соберите среднюю фазу из неразбавленных образцов для анализа на IgG.
5. Подготовьте разведение образца для каждого образца, чтобы убедиться, что показания находятся в пределах стандартного диапазона кривой. Разбавьте каждую среднюю фазу, полученную из разведенных образцов, до 1:300 для анализа BCA и 1:30 000 для анализа на лактоферрин, а также разбавьте каждую среднюю фазу, полученную из неразбавленных образцов, до 1:400 000 для анализа IgG.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициенты разбавления определяются на основе значения поглощения и стандартной кривой.

2. Определите концентрацию белка с помощью набора для анализа белка ВСА

1. Подготовка стандартов и реагентов
   1. Используйте реагенты, входящие в коммерчески доступный набор (см. Таблицу материалов), которые будут использоваться для анализа: реагент ВСА А, содержащий карбонат натрия, бикарбонат натрия, бицинхониновую кислоту и тартрат натрия в 0,1 М гидроксиде натрия. Реагент ВСА В содержит 4% сульфата меди. Стандарт альбумина (БСА) содержит бычий сывороточный альбумин в концентрации 2,0 мг/мл в 0,9% физиологическом растворе и 0,05% азиде натрия.
   2. Уравновесьте все образцы и стандарты белка до комнатной температуры (RT).
   3. Приготовьте достаточные объемы рабочего реагента (WR) путем смешивания реагента А:В в соотношении 50:1. На каждый образец и стандарт требуется 200 мкл WR.
   4. Приготовьте стандарты разбавленного альбумина (БСА) в соответствии со следующей схемой разбавления (Таблица 1), которая представляет рабочий диапазон от 20 до 2000 мкг/мл конечной концентрации БСА. Используйте dH₂O в качестве разбавителя.

Таблица 1: Схема разбавления стандартов BSA.

2. Процедура анализа BCA
   1. Перелейте по 25 мкл каждого стандарта BCA или образца в 96-луночный планшет. Добавьте 200 μL WR в каждую лунку, содержащую стандарт или образец. Тщательно перемешайте тарелку в шейкере в течение 30 с.
   2. Накройте тарелку герметиком для планшетов и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 минут. После инкубации дайте реакциям сбалансироваться до RT в течение примерно 10 минут. Считывайте каждую пластину с длиной волны 562 нм с помощью считывателя микропластин с соответствующим программным обеспечением.
3. Построение стандартной кривой и определение результатов
   1. Запишите значения поглощения для стандартов и образцов. Ряды данных о разрежении см. в таблице 1 . Вычтите значения поглощения стандартной заготовки из каждого значения поглощения стандартов и образца. Усредните повторяющиеся показания для каждого стандарта и образца, чтобы оценить общую концентрацию белка.
   2. Постройте стандартную кривую, построив скорректированное среднее поглощение для каждого стандарта по оси x и концентрацию по оси y. Нарисуйте линейную кривую с помощью соответствующего программного обеспечения, способного подгонять кривую по четырем параметрам.
   3. Используйте стандартную кривую для определения концентрации каждого образца путем интерполяции его реакции на концентрацию. Умножьте на коэффициент разбавления (шаг 1,5), чтобы получить фактическую концентрацию пробы.

3. Визуализация белка с помощью анализа SDS-PAGE

1. Подготовка образца и растворов
   1. Готовьте исходные растворы
      1. Приготовьте 10% (w/v) SDS, 1,5 М Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) раствор персульфата аммония (APS) (приготовьте свежий).
      2. (б/в) SDS: Взвесьте 1 г SDS и добавьте 10 мл dH₂O.
      3. M Tris-HCl pH 8,8: Взвесьте 18,15 г Tris и растворите ~60 мл dH₂O. Отрегулируйте до pH 8,8 с помощью HCl. Добавьте dH₂O, чтобы довести объем до 100 мл.
      4. M Tris-HCl pH 6,8: Взвесьте 6,00 г Tris и растворите ~60 мл dH₂O. Отрегулируйте до pH 6,8 с помощью HCl. Добавьте dH₂O, чтобы довести объем до 100 мл.
      5. APS: Взвесьте 15 мг APS и добавьте 150 μL dH₂O.
         ВНИМАНИЕ: Акриламид и паспорт безопасности токсичны и вредны. Надевайте защитные перчатки и работайте под капюшоном.
   2. Подготовьте буфер для проб, добавив 50 мкл β-меркаптоэтанола в 950 мкл 2x буфера для образцов SDS-PAGE.
      ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол токсичен при вдыхании. Надевайте защитные перчатки и работайте под капюшоном.
   3. Приготовьте рабочий буфер, смешав 100 мл 10x трис-глицина SDS Running Buffer с 900 мл dH₂O.
   4. Приготовьте раствор для окрашивания (45% dH₂O, 45% метанол, 10% ледяная уксусная кислота, 2 г Coomassie Brilliant Blue R).
   5. Приготовьте раствор для удаления (50% dH₂O, 40% метанол, 10% ледяная уксусная кислота).
2. Приготовление геля
   1. Подготовьте оборудование установки для электрофореза, включая гелевую кассету, блоки питания, электроды и кабели для проведения анализа. Очистите стеклянные пластины этанолом и соберите бутерброд. Убедитесь, что нижние края стеклянных пластин и распорок хорошо выровнены.
   2. Приготовьте разделительную гелевую смесь, содержащую 3,5 мл dH₂O, 2,4 мл 40% акриламида/метилен-биса акриламида, 2 мл 1,5M Tris-HCl, 100 мкл 10% (мас./об.) SDS, 80 мкл 10% APS, 8 μл N,N,N',N'-ТЕТРАМЕТИЛЭТИЛЕНДИАМИНА (TEMED).
      ВНИМАНИЕ: TEMED токсичен и/или раздражает. Надевайте защитные перчатки и работайте под капюшоном.
   3. Вылейте разделительную гелевую смесь в гелевые пластины до уровня примерно на 1-1,5 см ниже верха более короткой пластины.
   4. Покройте верхнюю часть разделительного геля изопропанолом, чтобы удалить пузырьки в верхней части геля и предотвратить высыхание полимеризованного геля.
   5. Налейте изопропанол поверх разделительного геля после того, как разделительный гель полимеризуется в течение не менее 15 минут.
   6. Приготовьте стекирующую гелевую смесь, содержащую 1,92 мл dH₂O, 300 мкл 40% акриламида/метиленбиса акриламида, 750 мкл 0,5M Tris-HCl, 100 мкл 10% (по мас.) SDS, 30 мкл 10% APS и 3 мкл TEMED.
   7. Налейте раствор укладывающего геля поверх разделительного геля, чтобы гелевые пластины были заполнены. Вставьте расческу в верхнюю часть распорок.
   8. Дайте укладывающему гелю полимеризоваться при комнатной температуре в течение примерно 15 минут.
3. Запуск геля
   1. Присоедините гель к электроду в сборе. Добавьте свежеприготовленный 1x Tris-glycine SDS Running Buffer в обе камеры аппарата.
   2. Снимите расческу.
   3. Загрузите в лунки геля 5 мкл лестницы (10-250 кДа) и 8 мкл средней фазы разбавленных образцов. Запустите гель при напряжении 80 В, пока краситель не мигрирует в разделительный гель, и увеличивайте до 120 В, пока краситель не достигнет дна геля. Выключите подаваемую мощность после того, как краситель достигнет дна геля.
4. Окрашивание и задержание геля
   1. После завершения прогона удалите гель из аппарата и снимите распорки и стеклянные пластины. Поместите гель в небольшую ванночку.
   2. Окрашивайте гель добавлением раствора для окрашивания (шаг 3.1.4) в течение 30 минут с легким встряхиванием при 55 оборотах в минуту.
   3. Слейте красящий раствор с геля. Смойте гель небольшим количеством растворителя и выбросьте краситель.
   4. Добавьте достаточный объем раствора, чтобы покрыть гель, и удалите пятна с помощью легкого встряхивания в течение ~1 часа, пока полосы не станут видимыми.

4. Концентрирование лактоферрина с помощью ИФА на основе бычьего лактоферрина

1. Подготовка стандартов и реагентов
   1. Для этого анализа используйте коммерчески доступный набор ИФА для ИФА крупного рогатого скота.
   2. Уравновесьте все образцы и стандарты по RT.
   3. Приготовьте достаточные объемы детектирующего реагента А и В Рабочего раствора, которые отвечают за связывание с захваченным антигеном.
   4. Разбавляют детектирующие реагенты А и В до соотношения 1:100 с использованием разбавителей анализа А и В соответственно.
   5. Приготовьте рабочий буфер для промывки, разбавив концентрат буфера для промывки 30x с dH₂O.
   6. Поместите достаточное количество субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в стерильную микропробирку.
   7. Ресуспендировать одну пробирку лиофилизированного стандарта (100 нг/мл) с 0,5 мл разбавителя образца и инкубировать при ОТ в течение 10 мин при осторожном перемешивании. Вращайте флакон, чтобы убедиться, что весь лиофилизированный санпл собран на дне.
   8. Приготовьте стандартный ряд разведения по следующей схеме разведения (табл. 2).

Таблица 2: Схема разведения норм бычьего лактоферрина.

2. Измерение концентрации бычьего лактоферрина
   1. Пипетируйте 100 мкл каждого стандарта или образца лактоферрина в 96-луночный полосковый планшет с покрытием. Накройте пластину герметиком для пластин, чтобы избежать испарения. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
   2. Аспирируйте жидкость из каждой лунки. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора реагента А. Накройте пластинчатым запайщиком и аккуратно перемешайте, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
   3. Промойте три раза, добавив примерно 350 мкл 1x промывочного буфера после откачки жидкости из каждой лунки. Дайте каждой стирке постоять 1-2 минуты, прежде чем полностью аспирировать. После последней стирки отсасывайте, чтобы удалить остатки буфера для стирки, затем переверните пластину и постучите по чистой впитывающей бумаге.
   4. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора реагента Б для детектирования. Накройте новым герметиком для пластин. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут. Отасуньте жидкость из каждой лунки и промойте ее пять раз, как описано в пункте 4.2.3. Налейте по 90 μл раствора субстрата TMB в каждую лунку и накройте новым герметиком.
   5. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 10-20 минут вдали от света. Проверяйте оптимальный цвет путем периодического контроля. Обратите внимание, что интенсивный синий цвет в лунке содержит высокий концентрат лактоферрина.
   6. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл раствора остановки. Цвет изменится с синего на желтый. Немедленно измерьте поглощение каждой лунки с длиной волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов с соответствующим программным обеспечением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно постучите по пластине, чтобы обеспечить тщательное перемешивание до равномерного изменения цвета.
3. Построение стандартной кривой и определение результатов
   1. Выполните шаг 2.3.1 для получения данных для оценки концентрации лактоферрина.
   2. Постройте стандартную кривую, построив скорректированное среднее поглощение для каждого стандарта, как описано в шаге 2.3.2, но начертав полиномиальную кривую с помощью соответствующего программного обеспечения, способного аппроксимировать четырехпараметрическую кривую.
   3. Рассчитайте содержание лактоферрина в каждом образце путем интерполяции значения поглощения на сгенерированное уравнение, как описано в шаге 2.3.3.

5. Определение концентрации IgG в образцах с помощью ИФА IgG крупного рогатого скота

1. Подготовка стандартов и реагентов
   1. Используйте необходимые элементы из тех, которые входят в набор ИФА IgG для крупного рогатого скота.
   2. Уравновесьте все образцы и стандарты по RT.
   3. Приготовьте достаточное количество рабочего раствора конъюгата фермент-антитело, разбавив 10 мкл концентрата пероксидазы хрена (HRP)-авидина (100x) 990 мкл конъюгированного фермента-антитела.
   4. Приготовьте достаточное количество 1x промывочного буфера, разбавив 20x концентрат промывочного буфера dH₂O.
   5. Приготовьте достаточное количество раствора разбавителя 1x, разбавив концентрат разбавителя 20x с dH₂O.
   6. Добавьте 1,0 мл dH₂O в калибратор IgG для крупного рогатого скота и аккуратно перемешайте до полного растворения. Конечная концентрация калибратора составляет 123 000 нг/мл.
   7. Готовьте стандартные серии разбавлений в соответствии со схемой разведения, описанной в таблице 3.

Таблица 3: Схема разбавления норм IgG крупного рогатого скота.

2. Процедура иммуноферментного анализа на IgG крупного рогатого скота
   1. Пипетируйте по 100 мкл каждого стандарта или образца IgG в 96-луночный полосковый планшет с покрытием. Накройте тарелку запечатывателем для планшетов и выдерживайте при RT в течение 30 минут. Отсасывайте жидкость из каждой лунки.
   2. Промойте четыре раза, заполнив лунки 1x буфером для промывки, и аспирируйте. После последней стирки отсадите, чтобы удалить остатки буфера для стирки, затем переверните пластину и постучите по чистой впитывающей бумаге. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл правильно разбавленного конъюгата фермент-антитело. Накройте пластинчатым запайщиком и аккуратно перемешайте, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
   3. Инкубировать при RT в течение 10 минут. Промойте и удалите остатки буфера промывки из лунок, как описано в шаге 5.2.2. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл субстрата TMB; Накройте новым запайщиком пластин.
   4. Инкубируйте при RT ровно 10 минут вдали от света. Остановите реакцию, добавив по 100 мкл раствора остановки в каждую лунку. Считывайте данные с каждой пластины на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропластин с соответствующим программным обеспечением.
3. Построение стандартной кривой и определение результатов
   1. Выполните шаг 2.3.1 для редактирования данных для оценки концентрации IgG.
   2. Постройте стандартную кривую, построив концентрацию по оси x и скорректированное среднее поглощение для каждого стандарта по оси y. Нарисуйте полиномиальную кривую с помощью соответствующего программного обеспечения, способного подгонять кривую по четырем параметрам.
   3. Рассчитайте содержание IgG в каждом образце путем интерполяции значения поглощения на сгенерированное уравнение, как описано в шаге 2.3.3.

В соответствии с протоколом образцы коровьего молозива были проанализированы для определения концентрации белка, лактоферрина и IgG. Результаты анализа белка, лактоферрина и IgG коровьего молозива представлены в таблице 4.

Это исследование дает информацию о значительных изменениях концентраций белка, лактоферрина и IgG в молозиве на протяжении всего перехода к зрелому молоку. Определение изменений концентрации лактоферрина и IgG проводили с помощью сэндвич-ИФА, а концентрацию общего бел...

Авторам нечего раскрывать.

Данное исследование проводится при поддержке компании Uluova Süt Ticaret A.Ş. (Uluova Milk Trading Co.). RMD и BMH являются сотрудниками Evolve BioSystems, компании, занимающейся восстановлением микробиома младенцев.