Détermination des concentrations en protéines totales et en protéines bioactives dans le colostrum bovin

Le colostrum bovin est à la fois une source primaire de nutriments et un soutien immunologique pour le veau nouveau-né. La compréhension du niveau des protéines thérapeutiques (lactoferrine et IgG) est importante pour le dosage et la normalisation du colostrum bovin pour la consommation humaine.

Le colostrum est un liquide biologique complexe produit par les mammifères immédiatement après la parturition. Il répond à tous les besoins nutritionnels des nouveau-nés en tant que bonne source de macro et micronutriments, de peptides bioactifs et de facteurs de croissance. Le colostrum bovin est également une source potentielle de nutrition et bioactif en raison de sa riche teneur en protéines qui comprend des immunoglobulines G (IgG) et de la lactoferrine. Cependant, le taux de lactoferrine et d’IgG dans le colostrum bovin change nettement pendant la période de lactation. Par conséquent, la surveillance de la concentration d’IgG et de lactoferrine pour l’utilisation du colostrum bovin comme source de protéines est une question importante à étudier. Les méthodes décrites dans cet article décrivent comment déterminer la teneur en protéines, ainsi que les concentrations spécifiques de lactoferrine et d’IgG. Ces méthodes comprennent les étapes suivantes : Isolement des protéines de colostrum bovin, Détermination de la concentration en protéines par dosage de l’acide bicchoninique (BCA), Visualisation des protéines par SDS-PAGE, Détermination de la lactoferrine et de la concentration en IgG à l’aide d’un test ELISA.

Le colostrum est la sécrétion initiale de la glande mammaire produite par les mammifères peu de temps après la parturition. Le colostrum est riche en macro et micronutriments, en peptides antimicrobiens et en facteurs^{de croissance 1,2,3,4}. La composition varie progressivement au fil du temps tout au long de la transition vers le lait mature ^5,6,7 mais surtout dans les 24 heures suivant la parturition⁸. La composition du colostrum est également influencée par des facteurs maternels, notamment l’âge, la parité, la race, la santé et l’état nutritionnel, ainsi que par des facteurs extrinsèques, notamment la saison, la parturition prématurée, la lactation prématurée, les facteurs de manipulation du colostrum (colostrum de mise en commun et température de stockage) et l’induction de la parturition ^9,10,11. Par rapport au lait mature, le colostrum contient moins de lactose et plus de matières grasses, de protéines, de peptides, d’azote non protéique, de cendres, d’hormones, de facteurs de croissance, de cytokines, de nucléotides, de vitamines et de minéraux¹². Le colostrum bovin contient un large éventail de protéines, notamment des immunoglobulines, de la lactoferrine, de la α-lactalbumine (α-LA), de la β-lactoglobuline (β-Lg), de la lactoperoxydase et de plusieurs facteurs de croissance¹³. La concentration en protéines totales du colostrum bovin varie entre 11,26 mg/mL et 169,55 mg/mL¹⁴. La teneur en protéines comprend le lactosérum et la caséine à une concentration moyenne de 124,00 mg/mL et 26,00 mg/mL, respectivement¹⁵. La portion lactosérum contient trois principaux types d’immunoglobulines (Ig) : les IgG (85 % à 90 %), les IgM (7 %) et les IgA (5 %)¹⁶. Les principales Ig du colostrum bovin sont les IgG, qui fournissent une immunité passive et modulent les systèmes immunitaires adaptatif et inné chez le veau¹⁷. La concentration initiale en Ig du premier colostrum bovin en lactation peut varier de 20 à 200 mg/mL et diminuer à environ 0,4-1,0 mg/mL¹⁸. La concentration moyenne d’IgG est d’environ 60 mg/mL et diminue régulièrement jusqu’à des niveaux inférieurs à 1 mg/mL tout au long de la transition vers le lait mature¹⁹.

Une autre protéine bioactive importante dans le colostrum est la lactoferrine, une glycoprotéine liant le fer avec une concentration de 1,5 à 5 mg / mL. Les propriétés de la lactoferrine comprennent l’amélioration de l’absorption du fer ainsi que la possession d’une activité antimicrobienne^20,21, la liaison des lipopolysaccharides, la modulation immunitaire et la stimulation de la croissance des cellules épithéliales intestinales et des fibroblastes²². Le colostrum bovin contient également de la α-lactalbumine et de la β-lactoglobuline. Ces protéines sont des sources d’acides aminés essentiels et ont également une activité bactéricide 23,24,25. Les concentrations moyennes de α-LA et de β-Lg dans le colostrum sont en moyenne de 2,77 mg/mL² et de 11,5 mg/mL²⁶, respectivement. Par la suite, ces concentrations diminuent à 1-1,5 mg/mL²⁷ et à 4,8 mg/mL²⁶ dans le lait mature. Le colostrum contient également une quantité importante de lactoperoxydase (moyenne de 22,8 μg/mL) et de lysozyme (moyenne de 0,40 μg/mL)²⁶. La lactoperoxydase est une glycoprotéine qui possède une activité antimicrobienne contre les bactéries à Gram positif et négatif²⁸ en produisant des espèces réactives de l’oxygène. Le lysozyme fonctionne comme un agent antimicrobien en clivant le composant peptidoglycane des parois cellulaires bactériennes, entraînant ainsi la mort cellulaire^29,30.

En raison de leurs propriétés, les IgG et la lactoferrine sont transformées en différents produits alimentaires pour enrichir les préparations pour nourrissons, les compléments alimentaires, les préparations riches en protéines pour les convalescents et les sportifs ainsi qu’en pharmacologie et en cosmétologie 31,32,33. Le colostrum bovin représente une source importante d’IgG et de lactoferrine. Cependant, la composition de ces protéines bioactives dans le colostrum bovin change nettement au cours de la période de lactation. Par conséquent, il est essentiel de surveiller les changements dans la concentration de ces protéines bioactives dans les échantillons de colostrum utilisés pour la recherche et la transformation des aliments. Cette étude vise à décrire les méthodes de suivi de la concentration et de la composition des protéines totales, de la lactoferrine et des IgG dans le colostrum bovin pendant les 6 jours suivant le vêlage.

Des échantillons de colostrum ont été prélevés pendant 6 jours après le vêlage à midi sur la période juillet-août, sur 28 vaches laitières Holstein de la société de négoce de lait Uluova à Çanakkale, en Turquie, et surgelées. Les échantillons prélevés le même jour ont été regroupés en fonction du jour de chaque échantillon et analysés pour leurs concentrations totales en protéines, en lactoferrine et en IgG. Tous les échantillons ont été analysés en double.

1. Préparation de l’échantillon

1. Mélanger 200 μL de colostrum bovin avec 400 μL de dH₂O pour obtenir un échantillon dilué pour l’analyse. Diluez tous les échantillons en conséquence.
2. Centrifugeuse d’échantillons dilués et non dilués à 4 °C, 1000 x g pendant 30 min.
3. Séparez la phase intermédiaire dans un nouveau tube étiqueté de manière appropriée. Répétez l’étape 1.2. pour obtenir une phase médiane claire. Conservez l’ensemble de la phase intermédiaire et des échantillons dilués à -20 °C, s’ils ne sont pas utilisés immédiatement.
4. Utilisez la phase intermédiaire obtenue à partir d’échantillons dilués pour les dosages BCA, SDS-PAGE et Lactoferrin. Prélever la phase intermédiaire à partir d’échantillons non dilués pour le dosage des IgG.
5. Préparez des dilutions d’échantillon pour chaque échantillon afin de vous assurer que les lectures se situent dans la plage de la courbe standard. Diluer chaque phase intermédiaire obtenue à partir des échantillons dilués à 1:300 pour le dosage BCA et 1:30 000 pour le dosage de la lactoferrine, et diluer chaque phase intermédiaire obtenue à partir d’échantillons non dilués à 1:400 000 pour le dosage des IgG.
   REMARQUE : Les facteurs de dilution sont déterminés en fonction de la valeur d’absorbance et de la courbe standard.

2. Déterminez la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA

1. Préparation des étalons et réactifs
   1. Utilisez les réactifs fournis dans la trousse disponible dans le commerce (voir la table des matériaux) à utiliser pour le dosage : le réactif BCA A, contenant du carbonate de sodium, du bicarbonate de sodium, de l’acide bicinchoninique et du tartrate de sodium dans de l’hydroxyde de sodium 0,1 M. Le réactif BCA B contient 4 % de sulfate cuivrique. Les étalons d’albumine (BSA) contiennent de l’albumine sérique bovine à 2,0 mg/mL dans une solution saline à 0,9 % et de l’azoture de sodium à 0,05 %.
   2. Équilibrez tous les échantillons et les étalons de protéines à température ambiante (RT).
   3. Préparez des volumes suffisants de réactif de travail (WR) en mélangeant un rapport de 50:1 du réactif A :B. 200 μL de WR sont nécessaires pour chaque échantillon et étalon.
   4. Préparer les étalons d’albumine diluée (BSA) selon le schéma de dilution suivant (tableau 1), qui présente une plage de travail entre 20 et 2 000 μg/mL de concentration finale de BSA. Utilisez le dH₂O comme diluant.

Tableau 1 : Système de dilution des normes BSA.

2. Procédure de dosage de l’ACF
   1. Transvaser 25 μL de chaque étalon ou échantillon de BCA dans une plaque à 96 puits. Ajouter 200 μL de WR à chaque étalon ou échantillon contenant un puits. Bien mélanger la plaque sur un agitateur pendant 30 s.
   2. Couvrir la plaque avec une scelleuse pour plaques et incuber à 37 °C pendant 30 min. Après l’incubation, laissez les réactions s’équilibrer à la RT pendant environ 10 min. Lire chaque plaque à 562 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques avec son logiciel associé.
3. Génération de la courbe standard et détermination des résultats
   1. Enregistrer les valeurs d’absorbance des étalons et des échantillons. Veuillez consulter le tableau 1 pour la série de dilution. Soustrayez les valeurs d’absorbance du blanc de l’étalon de chaque valeur d’absorbance des étalons et de l’échantillon. Faites la moyenne des lectures en double pour chaque étalon et échantillon afin d’estimer la concentration totale en protéines.
   2. Construisez une courbe standard en traçant l’absorbance moyenne corrigée pour chaque étalon sur l’axe des x et la concentration sur l’axe des y. Dessinez une courbe linéaire à l’aide d’un logiciel approprié capable d’ajuster la courbe à quatre paramètres.
   3. Utilisez la courbe standard pour déterminer la concentration de chaque échantillon en interpolant sa réponse à la concentration. Multipliez par le facteur de dilution (étape 1.5) pour obtenir la concentration réelle de l’échantillon.

3. Visualisation de la protéine à l’aide du test SDS-PAGE

1. Préparation de l’échantillon et des solutions
   1. Préparer des solutions mères
      1. Préparez une solution de persulfate d’ammonium (APS) à 10 % (p/v), Tris-HCl 1,5 M pH 8,3, Tris-HCl à 10 % (p/v) (APS) (préparez fraîche).
      2. (p/v) FDS : Peser 1 g de FDS et ajouter 10 mL de dH₂O.
      3. M Tris-HCl pH 8,8 : Peser 18,15 g de Tris et dissoudre avec ~60 mL de dH₂O. Ajuster à pH 8,8 avec HCl. Ajouter dH₂O pour porter le volume à 100 mL.
      4. M Tris-HCl pH 6,8 : Peser 6,00 g de Tris et dissoudre avec ~60 mL de dH₂O. Ajuster à pH 6,8 avec HCl. Ajouter dH₂O pour porter le volume à 100 mL.
      5. APS : Peser 15 mg d’APS et ajouter 150 μL de dH₂O.
         ATTENTION : L’acrylamide et le SDS sont toxiques et nocifs. Portez des gants de protection et travaillez sous une cagoule.
   2. Préparez le tampon d’échantillon en ajoutant 50 μL de β-Mercaptoéthanol dans 950 μL de 2 tampons d’échantillon SDS-PAGE.
      ATTENTION : Le β-mercaptoéthanol est toxique s’il est inhalé. Portez des gants de protection et travaillez sous une cagoule.
   3. Préparez le tampon de coulée en mélangeant 100 mL de 10x Tris-glycine SDS Running Buffer avec 900 mL de dH₂O.
   4. Préparez la solution de coloration (45 % dH₂O, 45 % de méthanol, 10 % d’acide acétique glacial, 2 g de Coomassie Brilliant Blue R).
   5. Préparez la solution de décoloration (50 % dH₂O, 40 % Méthanol, 10 % d’acide acétique glacial).
2. Préparation du gel
   1. Préparez l’équipement de l’unité d’électrophorèse, y compris la cassette de gel, les alimentations, les électrodes et les câbles pour le dosage. Nettoyez les plaques de verre avec de l’éthanol et assemblez le sandwich. Assurez-vous que les bords inférieurs des plaques de verre et des entretoises sont bien alignés.
   2. Préparez le mélange de gel de séparation contenant 3,5 mL de dH₂O, 2,4 mL d’acrylamide/méthylène bis acrylamide à 40 %, 2 mL de Tris-HCl 1,5 M, 100 μL de FDS à 10 % (p/v), 80 μL de 10 % APS, 8 μL de N,N,N′,N′-Tetramethyl ethylenediamine (TEMED).
      ATTENTION : TEMED est toxique et/ou irritant. Portez des gants de protection et travaillez sous une cagoule.
   3. Versez le mélange de gel de séparation dans les plaques de gel à un niveau d’environ 1 à 1,5 cm sous le haut de la plaque la plus courte.
   4. Superposez le haut du gel de séparation avec de l’isopropanol pour éliminer les bulles au sommet du gel et empêcher le gel polymérisé de se dessécher.
   5. Versez l’isopropanol sur le gel de séparation après que le gel de séparation ait polymérisé pendant au moins 15 min.
   6. Préparez le mélange de gel d’empilage contenant 1,92 mL de dH₂O, 300 μL d’acrylamide/méthylène bis acrylamide à 40 %, 750 μL de Tris-HCl 0,5 M, 100 μL de SDS à 10 % (p/v), 30 μL d’APS à 10 % et 3 μL de TEMED.
   7. Versez la solution de gel d’empilage sur le gel de séparation afin que les plaques de gel soient remplies. Insérez le peigne en haut des entretoises.
   8. Laissez le gel d’empilage polymériser à température ambiante pendant environ 15 min.
3. Faire fonctionner le gel
   1. Fixez le gel à l’ensemble d’électrodes. Ajoutez 1x Tris-glycine SDS Running Buffer fraîchement préparé dans les deux chambres de l’appareil.
   2. Retirez le peigne.
   3. Chargez 5 μL de l’échelle (10-250 kDa) et 8 μL de la phase intermédiaire des échantillons dilués dans les puits du gel. Faites fonctionner le gel à 80 V jusqu’à ce que le colorant migre dans le gel de séparation et augmentez à 120 V jusqu’à ce que le colorant atteigne le fond du gel. Éteignez l’alimentation appliquée une fois que le colorant a atteint le bas du gel.
4. Coloration et décoloration du gel
   1. Retirez le gel de l’appareil une fois le passage terminé et retirez les entretoises et les plaques de verre. Placez le gel dans un petit plateau.
   2. Teindre le gel en ajoutant une solution de coloration (étape 3.1.4) pendant 30 minutes en secouant doucement à 55 tr/min.
   3. Videz la solution de coloration du gel. Rincez le gel avec une petite quantité de solution décolorante et jetez le colorant.
   4. Ajouter un volume suffisant de solution de décoloration pour couvrir le gel et décolorer en secouant doucement pendant ~1 h jusqu’à ce que les bandes soient visibles.

4. Concentration de lactoferrine à l’aide d’un ELISA de lactoferrine bovine

1. Préparation des étalons et réactifs
   1. Utilisez le kit ELISA LF/LTF/lactoferrine bovin disponible dans le commerce pour ce test.
   2. Equilibérez tous les échantillons et étalons selon RT.
   3. Préparez des volumes suffisants de réactifs de détection A et B de solution de travail qui sont responsables de la liaison à l’antigène capturé.
   4. Diluer les réactifs de détection A et B dans un rapport de 1:100 en utilisant les diluants de dosage A et B, respectivement.
   5. Préparez un tampon de lavage 1x fonctionnel en diluant le concentré de tampon de lavage 30x avec dH₂O.
   6. Mettez une quantité suffisante de solution de substrat de 3,3',5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) dans un microtube stérile.
   7. Remettre en suspension un tube d’étalon lyophilisé (100 ng/mL) avec 0,5 mL de diluant de l’échantillon et incuber à RT pendant 10 min en agitant doucement. Faites tourner le flacon pour vous assurer que tout le sanple lyophilisé est recueilli au fond.
   8. Préparez une série de dilutions standard selon le schéma de dilution suivant (Tableau 2).

Tableau 2 : Schéma de dilution des étalons de lactoferrine bovine.

2. Mesure de la concentration de lactoferrine bovine
   1. Pipeter 100 μL de chaque étalon ou échantillon de lactoferrine dans la plaque de bande de 96 puits revêtue. Couvrez la plaque avec une scelleuse de plaque pour éviter l’évaporation. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
   2. Aspirez le liquide de chaque puits. Ajouter 100 μL de la solution de travail du réactif de détection A dans chaque puits. Couvrir avec une scelleuse à plaques et agiter doucement pour assurer un mélange complet. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
   3. Laver trois fois en ajoutant environ 350 μL de 1x tampon de lavage après avoir aspiré le liquide de chaque puits. Laissez chaque lavage reposer pendant 1 à 2 minutes avant d’aspirer complètement. Après le dernier lavage, aspirez pour enlever tout tampon de lavage restant, puis retournez la plaque et tapotez contre un papier absorbant propre.
   4. Ajouter 100 μL de la solution de travail du réactif de détection B dans chaque puits. Couvrir avec une nouvelle scelleuse de plaques. Incuber à 37 °C pendant 30 min. Aspirez le liquide de chaque puits et lavez-le cinq fois comme décrit à l’étape 4.2.3. Mettez 90 μL de solution de substrat TMB dans chaque puits et couvrez avec une nouvelle scelleuse de plaques.
   5. Incuber à 37 °C pendant 10 à 20 min à l’abri de la lumière. Vérifiez la couleur optimale en la surveillant périodiquement. Observez que la couleur bleue intense du puits comprend de la lactoferrine à haute concentration.
   6. Ajouter 50 μL de solution d’arrêt dans chaque puits. La couleur passera du bleu au jaune. Mesurez l’absorbance de chaque puits immédiatement à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques avec son logiciel associé.
      REMARQUE : Tapotez doucement la plaque pour assurer un mélange complet jusqu’à ce que le changement de couleur soit uniforme.
3. Génération de la courbe standard et détermination des résultats
   1. Suivez l’étape 2.3.1 pour la génération de données afin d’estimer la concentration de lactoferrine.
   2. Construisez une courbe standard en traçant l’absorbance moyenne corrigée pour chaque étalon comme décrit à l’étape 2.3.2, mais en traçant une courbe polynomiale avec un logiciel approprié capable d’ajuster la courbe à quatre paramètres.
   3. Calculer la teneur en lactoferrine de chaque échantillon en interpolant la valeur d’absorption sur l’équation générée, comme décrit à l’étape 2.3.3.

5. Détermination de la concentration en IgG d’échantillons à l’aide d’un test ELISA d’IgG bovin

1. Préparation des étalons et réactifs
   1. Utilisez les articles requis parmi ceux fournis dans le kit ELISA IgG bovin.
   2. Equilibérez tous les échantillons et étalons selon RT.
   3. Préparez des volumes suffisants de solution de conjugué enzyme-anticorps en diluant 10 μL de concentré de peroxydase de raifort (HRP)-avidine (100x) avec 990 μL de diluant conjugué enzyme-anticorps.
   4. Préparez des volumes suffisants de 1 tampon de lavage en diluant 20 fois le concentré de tampon de lavage avec du dH₂O.
   5. Préparez des volumes suffisants de la solution de diluant 1x en diluant 20x concentré de diluant avec du dH₂O.
   6. Ajouter 1,0 mL de dH₂O dans le calibrateur IgG bovin et mélanger doucement jusqu’à dissolution. La concentration finale du calibrateur est de 123.000 ng/mL.
   7. Préparer des séries de dilution standard conformément au schéma de dilution décrit au tableau 3.

Tableau 3 : Schéma de dilution des étalons IgG bovins.

2. Procédure d’essai ELISA IgG bovin
   1. Pipeter 100 μL de chaque étalon ou échantillon d’IgG dans la plaque de bande revêtue à 96 puits. Couvrir la plaque avec une scelleuse pour plaques et incuber à RT pendant 30 min. Aspirez le liquide de chaque puits.
   2. Lavez quatre fois en remplissant les puits avec 1x tampon de lavage et aspirez. Après le dernier lavage, aspirez pour éliminer tout résidu de tampon de lavage, puis retournez la plaque et tapotez contre du papier absorbant propre. Ajouter 100 μL de conjugué enzyme-anticorps correctement dilué dans chaque puits. Couvrir avec une scelleuse à plaques et agiter doucement pour assurer un mélange complet.
   3. Incuber à RT pendant 10 min. Lavez et retirez le tampon de lavage résiduel des puits comme décrit à l’étape 5.2.2. Ajouter 100 μL de substrat TMB dans chaque puits ; Couvrir avec une nouvelle scelleuse de plaques.
   4. Incuber à RT pendant précisément 10 min à l’abri de la lumière. Arrêtez la réaction en ajoutant 100 μL de solution d’arrêt dans chaque puits. Lisez chaque plaque à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques avec son logiciel associé.
3. Génération de la courbe standard et détermination des résultats
   1. Suivez l’étape 2.3.1 pour l’édition des données afin d’estimer la concentration en IgG.
   2. Construisez une courbe standard en traçant la concentration sur l’axe des x et l’absorbance moyenne corrigée pour chaque étalon sur l’axe des y. Tracez une courbe polynomiale à l’aide d’un logiciel approprié capable d’ajuster la courbe à quatre paramètres.
   3. Calculer la teneur en IgG de chaque échantillon en interpolant la valeur d’absorption sur l’équation générée, comme décrit à l’étape 2.3.3.

Conformément au protocole, les échantillons de colostrum bovin ont été analysés pour déterminer la concentration en protéines, en lactoferrine et en IgG. Les résultats des analyses des protéines, de la lactoferrine et des IgG du colostrum bovin sont présentés dans le tableau 4.

Tableau 4 : Concentration de protéines, de lactoferrine et d’IgG de colostrum bovin.

Cette étude fournit des informations sur les changements considérables dans les concentrations de protéines, de lactoferrine et d’IgG dans le colostrum tout au long de la transition vers le lait mature. La détection des changements dans la concentration de lactoferrine et d’IgG a été effectuée par ELISA sandwich, et la concentration totale en protéines a été analysée par le test BCA. Les résultats indiquent que le colostrum précoce a la concentration la plus élevée de ...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette étude est soutenue par Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.). RMD et BMH sont des employés d’Evolve BioSystems, une entreprise axée sur la restauration du microbiome infantile.