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Method Article
El calostro bovino es tanto una fuente principal de nutrientes como un apoyo inmunológico para el ternero recién nacido. La comprensión del nivel de proteínas terapéuticas (lactoferrina e IgG) es importante para la dosificación y estandarización del calostro bovino para el consumo humano.
El calostro es un fluido biológico complejo producido por los mamíferos inmediatamente después del parto. Cumple con todos los requisitos nutricionales para los neonatos como una buena fuente de macro y micronutrientes, péptidos bioactivos y factores de crecimiento. El calostro bovino también es una fuente potencial de nutrición y bioactivo debido a su rico contenido de proteínas que incluye inmunoglobulina G (IgG) y lactoferrina. Sin embargo, el nivel de lactoferrina e IgG en el calostro bovino cambia notablemente durante el período de lactancia. Por lo tanto, el monitoreo de la concentración de IgG y lactoferrina para el uso del calostro bovino como fuente de proteínas es una cuestión importante a estudiar. Los métodos de este artículo describen cómo determinar el contenido de proteínas, así como las concentraciones específicas de lactoferrina e IgG. Estos métodos incluyen los siguientes pasos: Aislamiento de proteínas de calostro bovino, Determinación de la concentración de proteínas mediante ensayo de ácido bicinconínico (BCA), Visualización de proteínas mediante SDS-PAGE, Determinación de lactoferrina y concentración de IgG mediante un ensayo ELISA.
El calostro es la secreción inicial de la glándula mamaria producida por los mamíferos poco después del parto. El calostro es rico en macro y micronutrientes, péptidos antimicrobianos y factores de crecimiento 1,2,3,4. La composición varía gradualmente a lo largo del tiempo a lo largo de la transición a la leche madura 5,6,7, pero de manera más significativa dentro de las 24 horas posteriores al parto8. La composición del calostro también está influenciada por factores maternos, como la edad, la paridad, la raza, la salud y el estado nutricional, así como por factores extrínsecos, como la estación, el parto prematuro, la lactancia prematura, los factores de manipulación del calostro (acumulación de calostro y temperatura de almacenamiento) y la inducción del parto 9,10,11. En comparación con la leche madura, el calostro contiene menos lactosa y más grasa, proteínas, péptidos, nitrógeno no proteico, cenizas, hormonas,factores de crecimiento, citocinas, nucleótidos, vitaminas y minerales. El calostro bovino contiene una amplia gama de proteínas, incluyendo inmunoglobulinas, lactoferrina, α-lactoalbúmina (α-LA), β-lactoglobulina (β-Lg), lactoperoxidasa y varios factores de crecimiento13. La concentración proteica total del calostro bovino oscila entre 11,26 mg/mL y 169,55 mg/mL14. El contenido de proteína comprende suero y caseína a una concentración promedio de 124,00 mg/mL y 26,00 mg/mL, respectivamente15. La porción de suero contiene tres tipos principales de inmunoglobulinas (Igs) como IgG (85%-90%), IgM (7%) e IgA (5%)16. La principal Ig en el calostro bovino es la IgG, que proporciona inmunidad pasiva y modula los sistemas inmunitarios adaptativos e innatos en el ternero17. La concentración inicial de Ig del primer calostro bovino en ordeño puede oscilar entre 20 y 200 mg/mL y disminuir a alrededor de 0,4-1,0 mg/mL18. La concentración media de IgG es de aproximadamente 60 mg/mL y disminuye constantemente hasta niveles inferiores a 1 mg/mL a lo largo de la transición a la leche madura19.
Otra proteína bioactiva importante en el calostro es la lactoferrina, una glicoproteína que se une al hierro con una concentración de 1,5-5 mg/mL. Las propiedades de la lactoferrina incluyen la mejora de la absorción de hierro, así como la posesión de actividad antimicrobiana20,21, la unión a lipopolisacáridos, la inmunomodulación y la estimulación del crecimiento de células epiteliales intestinales y fibroblastos22. El calostro bovino también contiene α-lactoalbúmina y β-lactoglobulina. Estas proteínas son fuentes de aminoácidos esenciales y también tienen actividad bactericida 23,24,25. Las concentraciones medias de α-LA y β-Lg en el calostro promediaron 2,77 mg/mL2 y 11,5 mg/mL26, respectivamente. A partir de entonces, estas concentraciones disminuyen a 1-1,5 mg/mL27 y a 4,8 mg/mL26 en la leche madura. El calostro también contiene una cantidad significativa de lactoperoxidasa (media 22,8 μg/mL) y lisozima (media 0,40 μg/mL)26. La lactoperoxidasa es una glicoproteína que posee actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas y negativas28 mediante la producción de especies reactivas de oxígeno. La lisozima funciona como un agente antimicrobiano al escindir el componente peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas, lo que conduce a la muerte celular29,30.
Debido a sus propiedades, la IgG y la lactoferrina se procesan en diferentes productos alimenticios para fortificar fórmulas infantiles, suplementos alimenticios, preparaciones ricas en proteínas para convalecientes y deportistas, así como en farmacología y cosmetología 31,32,33. El calostro bovino representa una fuente importante de IgG y lactoferrina. Sin embargo, la composición de estas proteínas bioactivas en el calostro bovino cambia notablemente durante el período de lactancia. Por lo tanto, es fundamental monitorear los cambios en la concentración de estas proteínas bioactivas en muestras de calostro utilizadas para la investigación y el procesamiento de alimentos. Este estudio tiene como objetivo describir los métodos para monitorear la concentración y composición de la proteína total, lactoferrina e IgG en calostro bovino durante los 6 días posteriores al parto.
Se recolectaron muestras de calostro durante 6 días después del parto al mediodía durante el período julio-agosto, de 28 vacas lecheras Holstein de Uluova Milk Trading Company en Çanakkale, Turquía, y se congelaron. Las muestras recolectadas el mismo día se agruparon de acuerdo con el día de cada muestra y se analizaron sus concentraciones totales de proteína, lactoferrina e IgG. Todas las muestras se analizaron por duplicado.
1. Preparación de la muestra
2. Determine la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas BCA
Tabla 1: Esquema de dilución de las normas BSA.
Vial | Volumen de diluyente (μL) | Volumen y fuente de BSA (μL) | Concentración final de BSA (μg/mL) |
Un | 0 | 300 μl de caldo | 2000 |
B | 125 | 375 μL de caldo | 1500 |
C | 325 | 325 μL de caldo | 1000 |
D | 175 | 175 de diluido en vial B | 750 |
E | 325 | 325 de dilución en vial C | 500 |
F | 325 | 325 de dilución en vial E | 250 |
G | 325 | 325 de dilución de vial F | 125 |
H | 400 | 100 de dilución de vial G | 25 |
Yo | 400 | 0 | 0 = En blanco |
3. Visualización de proteínas mediante el ensayo SDS-PAGE
4. Concentración de lactoferrina utilizando un ELISA de lactoferrina bovina
Tabla 2: Esquema de dilución de patrones de lactoferrina bovina.
Vial | Volumen de diluyente (μL) | Volumen y fuente de Lf (μL) | Concentración final de Lf (ng/mL) |
D1 | 0 | 500 μL de caldo | 100 |
D2 | 250 | 250 de dilución en vial D1 | 50 |
D3 | 250 | 250 de dilución en vial D2 | 25 |
D4 | 250 | 250 de dilución en vial D3 | 12.5 |
D5 | 250 | 250 de dilución en vial D4 | 6.25 |
D6 | 250 | 250 de dilución en vial D5 | 3,125 |
D7 | 250 | 250 de dilución en vial D6 | 1,563 |
D8 | 250 | 0 | 0 = En blanco |
5. Determinación de la concentración de IgG de muestras mediante ELISA de IgG bovina
Tabla 3: Esquema de dilución de patrones de IgG bovina.
Vial | Volumen de diluyente (μL) | Volumen y fuente de IgG (μL) | Concentración final de IgG (ng/mL) |
D1 | 900 | 100 μL de caldo | 12300 |
D2 | 900 | 100 de dilución en vial D1 | 1230 |
D3 | 178 | 122 de dilución en vial D2 | 500 |
D4 | 150 | 50 de dilución en vial D3 | 250 |
D5 | 150 | 150 de dilución en vial D4 | 125 |
D6 | 100 | 100 de dilución en vial D5 | 62.5 |
D7 | 100 | 100 de dilución en vial D6 | 31.25 |
D8 | 100 | 100 de dilución en vial D7 | 15,625 |
D9 | 100 | 100 de dilución en vial D8 | 7,813 |
D10 | 100 | 0 | 0 = En blanco |
Siguiendo el protocolo, se analizaron las muestras de calostro bovino para determinar la concentración de proteína, lactoferrina e IgG. Los resultados de los análisis de proteínas, lactoferrina e IgG del calostro bovino se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Concentración de proteína, lactoferrina e IgG del calostro bovino.
Este estudio proporciona información sobre cambios considerables en las concentraciones de proteína, lactoferrina e IgG en el calostro a lo largo de la transición a la leche madura. La detección de cambios en la concentración de lactoferrina e IgG se llevó a cabo mediante ELISA sándwich, y la concentración total de proteínas se analizó mediante el ensayo BCA. Los resultados indican que el calostro temprano tiene la mayor concentración de proteínas, lactoferrina e IgG, que pos...
Los autores no tienen nada que revelar.
Este estudio cuenta con el apoyo de Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.). RMD y BMH son empleados de Evolve BioSystems, una empresa centrada en restaurar el microbioma infantil.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10X Running Buffer (Tris-Glycine-SDS) | ClearBand | TGS10 | SDS-Page analysis |
2-mercaptoethanol | gibco | 31350-010 | SDS-Page analysis |
Acetic Acid GLACIAL | Isolab | 901,013,2500 | SDS-Page analysis |
Bovine IgG ELISA Kit | Aviva Systems Biology | OKIA00005 | Determination of IgG concentration |
Bovine LF / LTF / Lactoferrin ELISA Kit | LSBio Lifespan Biosciences | LS-F4884 | Determinaton of lactoferrin concentration |
Coomassie Brillant Blue R 250 | amresco | 0472-25G | SDS-Page analysis |
Hydrochloric Acid Fuming 37% | Isolab | 932,103,2501 | SDS-Page analysis |
Isopropanol | Isolab | 961,023,2500 | SDS-Page analysis |
Laemmli Sample Buffer (2X) | ClearBand | LSB-2x | SDS-Page analysis |
Methanol | Isolab | 947,046,2500 | SDS-Page analysis |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder 10 to 250 | Thermo Scientific | 26619 | SDS-Page analysis |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Determination of protein concentration |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioShop | SDS001.500 | SDS-Page analysis |
SureCast Acrylamide Solution 40% (w/v) | Invitrogen | HC2040 | SDS-Page analysis |
SureCast Ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | SDS-Page analysis |
SureCast Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | HC2006 | SDS-Page analysis |
TECAN Infinite M200 Plate Reader | Tecan | 30035094 | Measurement of absorbance |
Tris base | BioShop | TRS001.1 | SDS-Page analysis |
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