Determinación de las concentraciones de proteínas totales y bioactivas en el calostro bovino

El calostro bovino es tanto una fuente principal de nutrientes como un apoyo inmunológico para el ternero recién nacido. La comprensión del nivel de proteínas terapéuticas (lactoferrina e IgG) es importante para la dosificación y estandarización del calostro bovino para el consumo humano.

El calostro es un fluido biológico complejo producido por los mamíferos inmediatamente después del parto. Cumple con todos los requisitos nutricionales para los neonatos como una buena fuente de macro y micronutrientes, péptidos bioactivos y factores de crecimiento. El calostro bovino también es una fuente potencial de nutrición y bioactivo debido a su rico contenido de proteínas que incluye inmunoglobulina G (IgG) y lactoferrina. Sin embargo, el nivel de lactoferrina e IgG en el calostro bovino cambia notablemente durante el período de lactancia. Por lo tanto, el monitoreo de la concentración de IgG y lactoferrina para el uso del calostro bovino como fuente de proteínas es una cuestión importante a estudiar. Los métodos de este artículo describen cómo determinar el contenido de proteínas, así como las concentraciones específicas de lactoferrina e IgG. Estos métodos incluyen los siguientes pasos: Aislamiento de proteínas de calostro bovino, Determinación de la concentración de proteínas mediante ensayo de ácido bicinconínico (BCA), Visualización de proteínas mediante SDS-PAGE, Determinación de lactoferrina y concentración de IgG mediante un ensayo ELISA.

El calostro es la secreción inicial de la glándula mamaria producida por los mamíferos poco después del parto. El calostro es rico en macro y micronutrientes, péptidos antimicrobianos y factores de crecimiento 1,2,3,4. La composición varía gradualmente a lo largo del tiempo a lo largo de la transición a la leche madura ^5,6,7, pero de manera más significativa dentro de las 24 horas posteriores al parto⁸. La composición del calostro también está influenciada por factores maternos, como la edad, la paridad, la raza, la salud y el estado nutricional, así como por factores extrínsecos, como la estación, el parto prematuro, la lactancia prematura, los factores de manipulación del calostro (acumulación de calostro y temperatura de almacenamiento) y la inducción del parto ^9,10,11. En comparación con la leche madura, el calostro contiene menos lactosa y más grasa, proteínas, péptidos, nitrógeno no proteico, cenizas, hormonas,^{factores de crecimiento}, citocinas, nucleótidos, vitaminas y minerales. El calostro bovino contiene una amplia gama de proteínas, incluyendo inmunoglobulinas, lactoferrina, α-lactoalbúmina (α-LA), β-lactoglobulina (β-Lg), lactoperoxidasa y varios factores de crecimiento¹³. La concentración proteica total del calostro bovino oscila entre 11,26 mg/mL y 169,55 mg/mL¹⁴. El contenido de proteína comprende suero y caseína a una concentración promedio de 124,00 mg/mL y 26,00 mg/mL, respectivamente¹⁵. La porción de suero contiene tres tipos principales de inmunoglobulinas (Igs) como IgG (85%-90%), IgM (7%) e IgA (5%)¹⁶. La principal Ig en el calostro bovino es la IgG, que proporciona inmunidad pasiva y modula los sistemas inmunitarios adaptativos e innatos en el ternero¹⁷. La concentración inicial de Ig del primer calostro bovino en ordeño puede oscilar entre 20 y 200 mg/mL y disminuir a alrededor de 0,4-1,0 mg/mL¹⁸. La concentración media de IgG es de aproximadamente 60 mg/mL y disminuye constantemente hasta niveles inferiores a 1 mg/mL a lo largo de la transición a la leche madura¹⁹.

Otra proteína bioactiva importante en el calostro es la lactoferrina, una glicoproteína que se une al hierro con una concentración de 1,5-5 mg/mL. Las propiedades de la lactoferrina incluyen la mejora de la absorción de hierro, así como la posesión de actividad antimicrobiana^20,21, la unión a lipopolisacáridos, la inmunomodulación y la estimulación del crecimiento de células epiteliales intestinales y fibroblastos²². El calostro bovino también contiene α-lactoalbúmina y β-lactoglobulina. Estas proteínas son fuentes de aminoácidos esenciales y también tienen actividad bactericida 23,24,25. Las concentraciones medias de α-LA y β-Lg en el calostro promediaron 2,77 mg/^mL2 y 11,5 mg/mL²⁶, respectivamente. A partir de entonces, estas concentraciones disminuyen a 1-1,5 mg/mL²⁷ y a 4,8 mg/mL²⁶ en la leche madura. El calostro también contiene una cantidad significativa de lactoperoxidasa (media 22,8 μg/mL) y lisozima (media 0,40 μg/mL)²⁶. La lactoperoxidasa es una glicoproteína que posee actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas y negativas²⁸ mediante la producción de especies reactivas de oxígeno. La lisozima funciona como un agente antimicrobiano al escindir el componente peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas, lo que conduce a la muerte celular^29,30.

Debido a sus propiedades, la IgG y la lactoferrina se procesan en diferentes productos alimenticios para fortificar fórmulas infantiles, suplementos alimenticios, preparaciones ricas en proteínas para convalecientes y deportistas, así como en farmacología y cosmetología 31,32,33. El calostro bovino representa una fuente importante de IgG y lactoferrina. Sin embargo, la composición de estas proteínas bioactivas en el calostro bovino cambia notablemente durante el período de lactancia. Por lo tanto, es fundamental monitorear los cambios en la concentración de estas proteínas bioactivas en muestras de calostro utilizadas para la investigación y el procesamiento de alimentos. Este estudio tiene como objetivo describir los métodos para monitorear la concentración y composición de la proteína total, lactoferrina e IgG en calostro bovino durante los 6 días posteriores al parto.

Se recolectaron muestras de calostro durante 6 días después del parto al mediodía durante el período julio-agosto, de 28 vacas lecheras Holstein de Uluova Milk Trading Company en Çanakkale, Turquía, y se congelaron. Las muestras recolectadas el mismo día se agruparon de acuerdo con el día de cada muestra y se analizaron sus concentraciones totales de proteína, lactoferrina e IgG. Todas las muestras se analizaron por duplicado.

1. Preparación de la muestra

1. Mezclar 200 μL de calostro bovino con 400 μL de_dH2O para obtener una muestra diluida para el análisis. Diluya todas las muestras en consecuencia.
2. Centrifugar muestras diluidas y sin diluir a 4 °C, 1000 x g durante 30 min.
3. Separe la fase intermedia en un tubo nuevo debidamente etiquetado. Repita el paso 1.2. para obtener una fase media clara. Almacene toda la fase intermedia y las muestras diluidas a -20 °C, si no se utilizan inmediatamente.
4. Utilice la fase intermedia obtenida a partir de muestras diluidas para los ensayos BCA, SDS-PAGE y Lactoferrin. Recoja la fase intermedia de muestras sin diluir para el ensayo de IgG.
5. Prepare diluciones de muestra para cada muestra para asegurarse de que las lecturas estén dentro del rango de curva estándar. Diluir cada fase intermedia obtenida de las muestras diluidas a 1:300 para el ensayo de BCA y 1:30.000 para el ensayo de lactoferrina, y diluir cada fase intermedia obtenida a partir de muestras sin diluir a 1:400.000 para el ensayo de IgG.
   NOTA: Los factores de dilución se determinan en función del valor de absorbancia y la curva estándar.

2. Determine la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas BCA

1. Preparación de patrones y reactivos
   1. Utilice los reactivos proporcionados en el kit disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) que se utilizarán para el ensayo: reactivo BCA A, que contiene carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, ácido bicinconínico y tartrato de sodio en hidróxido de sodio 0,1 M. El reactivo BCA B contiene un 4% de sulfato cúprico. Estándares de albúmina (BSA), contiene albúmina sérica bovina a 2,0 mg/mL en solución salina al 0,9% y azida sódica al 0,05%.
   2. Equilibre todas las muestras y los patrones de proteínas a temperatura ambiente (RT).
   3. Prepare volúmenes suficientes de reactivo de trabajo (WR) mezclando una proporción de 50:1 de reactivo A:B. Se requieren 200 μL de WR para cada muestra y patrón.
   4. Prepare patrones de albúmina diluida (BSA) de acuerdo con el siguiente esquema de dilución (Tabla 1), que presenta un rango de trabajo entre 20-2,000 μg/mL de concentración final de BSA. Utilice dH₂O como diluyente.

Tabla 1: Esquema de dilución de las normas BSA.

2. Procedimiento de ensayo BCA
   1. Transfiera 25 μL de cada patrón o muestra de BCA a una placa de 96 pocillos. Añada 200 μL de WR a cada patrón o muestra que contenga pocillos. Mezcle bien el plato en un agitador de platos durante 30 s.
   2. Cubra la placa con un sellador de placas e incube a 37 °C durante 30 min. Después de la incubación, deje que las reacciones se equilibren a RT durante unos 10 minutos. Lea cada placa a 562 nm utilizando un lector de microplacas con su software asociado.
3. Generación de curva estándar y determinación de resultados
   1. Registre los valores de absorbancia para los patrones y las muestras. Consulte la Tabla 1 para ver la serie de diluciones. Reste los valores de absorbancia del blanco estándar de cada valor de absorbancia de los patrones y la muestra. Promedie las lecturas duplicadas para cada patrón y muestra para estimar la concentración total de proteína.
   2. Construya una curva estándar trazando la absorbancia media corregida para cada patrón en el eje x y la concentración en el eje y. Dibuje una curva lineal con el software adecuado capaz de ajustar la curva de cuatro parámetros.
   3. Utilice la curva estándar para determinar la concentración de cada muestra interpolando su respuesta a la concentración. Multiplique por el factor de dilución (paso 1.5) para obtener la concentración real de la muestra.

3. Visualización de proteínas mediante el ensayo SDS-PAGE

1. Preparación de muestras y soluciones
   1. Preparar soluciones de stock
      1. Prepare la SDS al 10% (p/v), 1,5 M de Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8, 10% (p/v) de solución de persulfato de amonio (APS) (preparar fresca).
      2. (s/v) SDS: Pesar 1 g de SDS y añadir 10 mL de_dH2O.
      3. M Tris-HCl pH 8.8: Pesar 18.15 g de Tris y disolver con ~60 mL de dH₂O. Ajustar a pH 8.8 con HCl. Agregue dH₂O para llevar el volumen a 100 mL.
      4. M Tris-HCl pH 6.8: Pesar 6.00 g de Tris y disolver con ~60 mL de dH₂O. Ajustar a pH 6.8 con HCl. Agregue dH₂O para llevar el volumen a 100 mL.
      5. APS: Pesar 15 mg de APS y añadir 150 μL de_dH2O.
         PRECAUCIÓN: La acrilamida y el SDS son tóxicos y dañinos. Use guantes protectores y trabaje debajo de una capucha.
   2. Prepare el tampón de muestra añadiendo 50 μL de β-Mercaptoetanol en 950 μL de tampón de muestra 2x SDS-PAGE.
      PRECAUCIÓN: El β-mercaptoetanol es tóxico si se inhala. Use guantes protectores y trabaje debajo de una capucha.
   3. Prepare el tampón de funcionamiento mezclando 100 ml de tampón de funcionamiento SDS de tris-glicina 10x con 900 ml de dH₂O.
   4. Prepare la solución de tinción (45% dH₂O, 45% metanol, 10% ácido acético glacial, 2 g de Coomassie Brilliant Blue R).
   5. Prepare la solución decolorante (50% dH₂O, 40% metanol, 10% ácido acético glacial).
2. Preparación del gel
   1. Prepare el equipo de la unidad de electroforesis, incluido el casete de gel, las fuentes de alimentación, los electrodos y los cables para el ensayo. Limpie las placas de vidrio con etanol y ensamble el sándwich. Asegúrese de que los bordes inferiores de las placas de vidrio y los espaciadores estén bien alineados.
   2. Prepare la mezcla de gel separador que contiene 3,5 mL de dH₂O, 2,4 mL de acrilamida al 40 %, 2 mL de Tris-HCl 1,5 M, 100 μL de SDS al 10 % (p/v), 80 μL de APS al 10 %, 8 μL de N,N,N',N',N'-tetrametilendiamina (TEMED).
      PRECAUCIÓN: TEMED es tóxico y/o irritante. Use guantes protectores y trabaje debajo de una capucha.
   3. Vierta la mezcla de gel separador en las placas de gel hasta un nivel aproximadamente 1-1,5 cm por debajo de la parte superior de la placa más corta.
   4. Cubra la parte superior del gel separador con isopropanol para eliminar las burbujas en la parte superior del gel y evitar que el gel polimerizado se seque.
   5. Vierta isopropanol sobre el gel separador después de que el gel separador se haya polimerizado durante al menos 15 minutos.
   6. Prepare la mezcla de gel de apilamiento que contiene 1,92 mL de_dH2O, 300 μL de acrilamida al 40 %, 750 μL de Tris-HCl 0,5 M, 100 μL de SDS al 10 % (p/v), 30 μL de APS al 10 % y 3 μL de TEMED.
   7. Vierta la solución de gel apilable encima del gel separador para que las placas de gel se llenen. Inserte el peine en la parte superior de los espaciadores.
   8. Deje que el gel apilador polimerice a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos.
3. Correr el gel
   1. Conecte el gel al conjunto de electrodos. Agregue 1x Tampón de carrera Tris-glycine SDS recién preparado a ambas cámaras del aparato.
   2. Retira el peine.
   3. Cargue 5 μL de la escalera (10-250 kDa) y 8 μL de la fase media de las muestras diluidas en los pocillos del gel. Pasa el gel a 80 V hasta que el tinte migre al gel separador y aumenta a 120 V hasta que el tinte llegue al fondo del gel. Apaga la potencia aplicada después de que el tinte llegue al fondo del gel.
4. Manchar y decolorar el gel
   1. Retire el gel del aparato una vez que se complete la ejecución y retire los espaciadores y las placas de vidrio. Coloque el gel en una bandeja pequeña.
   2. Teñir el gel añadiendo solución de tinción (paso 3.1.4) durante 30 min agitando suavemente a 55 rpm.
   3. Vierte la solución tintante del gel. Enjuaga el gel con un poco de solución decolorante y desecha el tinte.
   4. Agregue un volumen suficiente de solución decolorante para cubrir el gel y agite suavemente durante ~ 1 h hasta que las bandas sean visibles.

4. Concentración de lactoferrina utilizando un ELISA de lactoferrina bovina

1. Preparación de patrones y reactivos
   1. Utilice el kit ELISA de LF/LTF/lactoferrina bovina disponible en el mercado para este ensayo.
   2. Equilibre todas las muestras y estándares a RT.
   3. Prepare volúmenes suficientes de solución de trabajo de los reactivos de detección A y B que se encarguen de unirse al antígeno capturado.
   4. Diluir los reactivos de detección A y B en una proporción de 1:100 utilizando diluyentes de ensayo A y B, respectivamente.
   5. Prepare un tampón de lavado 1x diluyendo el concentrado de tampón de lavado 30x con dH₂O.
   6. Coloque una cantidad suficiente de solución de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en un microtubo estéril.
   7. Vuelva a suspender un tubo de patrón liofilizado (100 ng/mL) con 0,5 mL del diluyente de muestra e incube a RT durante 10 min con agitación suave. Gire el vial para asegurarse de que todo el ánpel liofilizado se recoja en la parte inferior.
   8. Prepare una serie de diluciones estándar de acuerdo con el siguiente esquema de dilución (Tabla 2).

Tabla 2: Esquema de dilución de patrones de lactoferrina bovina.

2. Medición de la concentración de lactoferrina bovina
   1. Pipetear 100 μL de cada patrón o muestra de lactoferrina en la placa de tiras de 96 pocillos recubierta. Cubra la placa con un sellador de placas para evitar la evaporación. Incubar a 37 °C durante 1 h.
   2. Aspira el líquido de cada pocillo. Añada 100 μl del reactivo de detección Una solución de trabajo a cada pocillo. Cubra con un sellador de placas y agite suavemente para asegurar una mezcla completa. Incubar a 37 °C durante 1 h.
   3. Lave tres veces agregando aproximadamente 350 μL de tampón de lavado 1x después de aspirar el líquido de cada pocillo. Deje reposar cada lavado durante 1-2 minutos antes de aspirar por completo. Después del último lavado, aspire para eliminar cualquier resto de tampón de lavado, luego invierta la placa y golpee contra un papel absorbente limpio.
   4. Añada 100 μL de la solución de trabajo del reactivo de detección B a cada pocillo. Cubra con un nuevo sellador de placas. Incubar a 37 °C durante 30 min. Aspire el líquido de cada pocillo y lávelo cinco veces como se describe en el paso 4.2.3. Ponga 90 μL de solución de sustrato TMB en cada pocillo y cúbralo con un nuevo sellador de placas.
   5. Incubar a 37 °C durante 10-20 min lejos de la luz. Verifique el color óptimo monitoreando periódicamente. Observe que el color azul intenso en el pozo incluye lactoferrina de alta concentración.
   6. Agregue 50 μL de solución de parada a cada pocillo. El color cambiará de azul a amarillo. Mida la absorbancia de cada pocillo inmediatamente a 450 nm utilizando un lector de microplacas con su software asociado.
      NOTA: Golpee suavemente la placa para asegurar una mezcla completa hasta que el cambio de color sea uniforme.
3. Generación de curva estándar y determinación de resultados
   1. Siga el paso 2.3.1 para la generación de datos para estimar la concentración de lactoferrina.
   2. Construya una curva estándar trazando la absorbancia media corregida para cada patrón, como se describe en el paso 2.3.2, pero dibujando una curva polinómica con el software adecuado capaz de ajustar la curva de cuatro parámetros.
   3. Calcule el contenido de lactoferrina de cada muestra interpolando el valor de absorción en la ecuación generada, tal como se describe en el paso 2.3.3.

5. Determinación de la concentración de IgG de muestras mediante ELISA de IgG bovina

1. Preparación de patrones y reactivos
   1. Utilice los elementos requeridos de los provistos en el Kit ELISA de IgG Bovina.
   2. Equilibre todas las muestras y estándares a RT.
   3. Prepare volúmenes suficientes de solución funcional de conjugado enzima-anticuerpo diluyendo 10 μL de concentrado de peroxidasa de rábano picante (HRP)-avidina (100x) con 990 μL de diluyente de conjugado enzima-anticuerpo.
   4. Prepare volúmenes suficientes de 1x tampón de lavado diluyendo 20x concentrado de tampón de lavado con dH₂O.
   5. Prepare volúmenes suficientes de la solución de diluyente 1x diluyendo 20x concentrado de diluyente con dH₂O.
   6. Añadir 1,0 mL de dH₂O al calibrador de IgG bovina y mezclar suavemente hasta que se disuelva. La concentración final del calibrador es de 123.000 ng/mL.
   7. Prepare la serie de dilución estándar de acuerdo con el esquema de dilución descrito en la Tabla 3.

Tabla 3: Esquema de dilución de patrones de IgG bovina.

2. Procedimiento de ensayo ELISA de IgG bovina
   1. Pipetee 100 μL de cada patrón o muestra de IgG en la placa de tiras de 96 pocillos recubierta. Cubra la placa con un sellador de placas e incube a RT durante 30 min. Aspire el líquido de cada pocillo.
   2. Lave cuatro veces llenando los pocillos con 1 tampón de lavado y aspire. Después del último lavado, aspire para eliminar cualquier tampón de lavado residual, luego invierta la placa y golpee contra el papel absorbente limpio. Agregue 100 μL de conjugado enzima-anticuerpo adecuadamente diluido a cada pocillo. Cubra con un sellador de placas y agite suavemente para asegurar una mezcla completa.
   3. Incubar en RT durante 10 min. Lave y elimine el tampón de lavado residual de los pocillos como se describe en el paso 5.2.2. Añadir 100 μL de sustrato TMB a cada pocillo; Cubra con un nuevo sellador de placas.
   4. Incubar en RT durante exactamente 10 minutos lejos de la luz. Detenga la reacción añadiendo 100 μL de solución de parada a cada pocillo. Lea cada placa a 450 nm utilizando un lector de microplacas con su software asociado.
3. Generación de curva estándar y determinación de resultados
   1. Siga el paso 2.3.1 para la edición de datos para estimar la concentración de IgG.
   2. Construya una curva estándar trazando la concentración en el eje x y la absorbancia media corregida para cada estándar en el eje y. Dibuje una curva polinómica con el software adecuado capaz de ajustar la curva de cuatro parámetros.
   3. Calcule el contenido de IgG de cada muestra interpolando el valor de absorción en la ecuación generada, como se describe en el paso 2.3.3.

Siguiendo el protocolo, se analizaron las muestras de calostro bovino para determinar la concentración de proteína, lactoferrina e IgG. Los resultados de los análisis de proteínas, lactoferrina e IgG del calostro bovino se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Concentración de proteína, lactoferrina e IgG del calostro bovino.

Este estudio proporciona información sobre cambios considerables en las concentraciones de proteína, lactoferrina e IgG en el calostro a lo largo de la transición a la leche madura. La detección de cambios en la concentración de lactoferrina e IgG se llevó a cabo mediante ELISA sándwich, y la concentración total de proteínas se analizó mediante el ensayo BCA. Los resultados indican que el calostro temprano tiene la mayor concentración de proteínas, lactoferrina e IgG, que pos...

Los autores no tienen nada que revelar.

Este estudio cuenta con el apoyo de Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.). RMD y BMH son empleados de Evolve BioSystems, una empresa centrada en restaurar el microbioma infantil.