Колеса Запуск и окружающей среды Сложность в качестве терапевтического вмешательства в животную модель FASD

Сердечно-сосудистые упражнения и стимулирующие опыт в сложной среде имеют положительные результаты на нескольких мер нейропластики в пределах мозга грызуна. В этой статье будут обсуждены вопросы реализации этих мер в качестве "superintervention", который сочетает в себе колесо, идущее и экологической сложности и будут рассмотрены ограничения этих мер.

Аэробные упражнения (например, колесо работает (WR) широко используется в исследованиях на животных) положительно влияет на многие меры neuroplastic потенциала в мозге, такие , как уровень взрослого нейрогенеза, ангиогенез и экспрессии нейротрофических факторов у грызунов. Это вмешательство также было показано , чтобы смягчить поведенческие и нейроанатомических аспекты негативных последствий тератогенами (т.е. воздействия развития к алкоголю) и возрастной нейродегенерации у грызунов. Экологическая сложность (ЕС) было показано, дает многочисленные преимущества neuroplastic в корковых и подкорковых структур и могут быть соединены с колесо, идущее к увеличению пролиферации и выживания новых клеток во взрослом гиппокампе. Сочетание этих двух вмешательств обеспечивает надежную "superintervention" (WR-EC), который может быть реализован в различных моделях грызунов неврологических расстройств. Мы обсудим реализацию WR / EC и ее составляющую ввмешательств для использования в качестве более мощного терапевтического вмешательства у крыс с использованием животной модели пренатального воздействия алкоголя в организме человека. Мы также обсудим, какие элементы процедур абсолютно необходимы для вмешательства и какие из них могут быть изменены в зависимости от вопроса или объектов экспериментатора.

Выращивание в различных средах уже давно известно, вызывают изменения в различных мер неврологического здоровья. Многие исследования смотрят на благотворное влияние выращивания в сложных условиях (EC) , начиная с исследований по новаторским Даймонда и Розенцвейг (например, ^{1, 2)} и Гринаф (Например, ^{3, 4).} EC было продемонстрировано , имеют неоспоримое положительное влияние на синаптических и клеточных изменений в мозге ^{5, 6, 7.} ЕС может повлиять на множество областей мозга , включая гиппокамп ^{8, 9} и зрительной коре ^{10, 11,} вентральном стриатуме ^{12, 13,} а такжев качестве мозга для всей функции нейроиммунных (обзор в ^14). Особый интерес вызывают из исследований по гиппокамп , когда было показано , что ЕС может увеличить коэффициент выживаемости взрослых новорожденных гранулярных клеток зубчатой извилины через дендритной пластичности ^{9, 13.} Этот последний пункт собрал большой интерес из - за растущего объема литературы , указывающей , что сердечно - сосудистые упражнения способствует нейрогенез как в здоровом и поврежденном мозге ^{15, 16, 17, 18.} Колесо работает (WR) легко реализовать форму добровольного сердечно - сосудистой деятельности , что было показано , чтобы быть полезным в моделях грызунов неврологических расстройств или старения ^{17, 19, 20.} WR влияет на экспрессию факторов роста как в центральной и периферической нервной системы , ^{21, 22, 23.}

Объединение (впоследствии) WR и ЕС в "superintervention" (WR-EC) (т.е. 12 дней WR затем 30 дней в ЕС) обеспечивает надежное увеличение гиппокампа взрослого нейрогенеза и увеличение выживаемости вновь пролиферирующих клеток ^8, эффект, что в животной модели FASD не достигается отдельных компонентов (см ниже). Так как оба компонента WR-EC влияют на широкий спектр структур в мозге ¹³ (WR рассмотрен в ^22, EC рассмотрены в ^24), реализация этого вмешательства может быть легко применен к грызунах моделей обоих развития и более поздних этапах жизни протекающими моделей неврологическими нарушения (например, неонатальный спирта экспозиции, старение, ранняя жизнь стресс).

Заявление по этике: Следующий протокол был одобрен по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) Университета штата Делавэр путем.

1. Развивающее экспозиции (или модель Binge-как Этанол Exposure)

1. На ПД3, определить пол каждого животного и кросс-поощрять любых животных, если это необходимо, чтобы сохранить размер помета (8 животных) и распределение по полу (4 мужчин: 4 женщин) последовательно в каждом помете.
   Примечание: Важно, чтобы сохранить размер помета и распределение по полу как можно более последовательными, чтобы избежать экспериментальных путает. Хотя этот протокол использует 8 щенков (4 мужчин и 4 женщины) в каждом помете, альтернативные размеры помета или половых распределения могут быть адаптированы к потребностям экспериментального проектирования.
2. Подкожно вводят небольшое количество черного тушью в лапы, чтобы идентифицировать животных в каждом помете.
3. Псевдо-случайным образом назначить пометов в качестве эксперимента (содержащие 50% спирта, подвергшихся воздействию (AE) и 50% фиктивный-интубированы контроль (SI) щенком) или сосут управления (SC) (животные, которые не претерпевают интубации, хвост, вырезку или протоколы разделения от PD 4 - 9 для ежедневного взвешивания и уха штамповки), за исключением.
   1. Для того, чтобы сохранить последовательный размер группы, назначать в два раза больше экспериментальных пометов как SC пометов.
4. Взвесьте каждое животное затем вернуть его в родную клетку. Взвешивание животных должно происходить ежедневно в период интубации (PD 4 - 9).
   1. Удалите весь мусор от плотины.
   2. Поместите щенков на подогреваемых площадку.
   3. Запишите вес каждого щенка.
5. На PD4, после взвешивания каждого животного рассчитать необходимое количество алкоголя в общей сложности 5,25 г / кг / день на каждого животного ( в зависимости от веса щенка , начиная с шага 1.4) ^8.
   1. Администрируйте спирт в 11,9% этанол-в-заменитель молока (об / об).
6. Начиная с 9 утра, удалите один щенков помета от матери в то время.
7. Администрирование этанол-в-молоко каждому щенку А.Е. 34.
8. Sham-интубации каждый детеныша SI ^8.
9. Повторите шаги 1.5. через 1,8. для каждого экспериментального помета.
10. Через два часа после первой дозы, повторите процедуру дозирования (шаги 1,5 через 1,8) для второй дозы алкоголя.
11. Через полтора часа после второй дозы алкоголя (точка , в которой достигается пик ежедневно содержание алкоголя в крови), собирают и центрифуга кровь из мышат АЕ и СИ через хвост стрижкой для анализа ³⁵ содержания алкоголя в крови будущего.
    1. Сбор 60 мкл крови.
    2. Поместите кровь в пробирку микроцентрифужных 1 мл. Центрифуга крови при 1,5 мкг в течение 25 мин.
    3. Осторожно собрать надосадочную сыворотку из центрифуги трубки и сохраните ее для последующего анализа содержания алкоголя в крови.
12. Повторите процедуру дозирования (шаги 1.5 через 1.8), используя молоко вместо этанола-в-молока, чтобы предотвратить дефицит питательных веществ из медсестер неспособности в АЕщенками.
    1. Выполните в общей сложности 2 дополнительных доз молока 2 ч друг от друга на PD 4.
13. Повторите шаги 1.4 через 1.12 (за исключением стадии 1.11) на PD 5 - 9.
14. После окончательной дополнительной дозы молока на PD9, уха пробивать все щенкам для идентификации в клетке EC.
    1. Координировать пробитое ухо с некоторой мерой количества приплода или идентификатора (например, нечетные пометов в пределах когорты бы получить их левое ухо ударил кулаком в то время как животные из четных пометов получили бы их правые уши кулаками). Это позволит сделать его легче идентифицировать животных в клетке ЕС должен несколько животных из разных пометов имеют один и тот же шаблон pawmark.

2. Отлучение

1. На PD 23, дом все животные в клетках 2 - 3.
   1. Убедитесь в том, что все животные разместились в одной клетке одни и те же секс.
   2. Включите одну SC, один SI и один AE животное в клетку, когда это возможно.
   3. Сведение к минимуму количества клетки товарищей-йна из того же помета.
   4. Убедитесь, что все животные способны доступ к пище и воде.

3. Колесо Running

1. На PD30, выделяют половину клеток с животными к WR. Дом эти животные в клетках со свободным доступом к прикрепленным нержавеющей стали ходовое колесо.
   1. Убедитесь, что колеса имеют счетчик, чтобы оценить общее число оборотов.
2. Взвешивание всех животных на PD 30 и PD 36.
3. Проверьте число оборотов каждого колеса в 9 утра каждый день.
4. Оставьте животных в их соответствующем состоянии жилья в течение 12 дней.

4. Сложность окружающей среды

1. Подготовьте клетку EC до 9 утра в день, что соответствует PD 42 для экспериментальных животных.
   1. Получите 30 "х 18" х 36 "из оцинкованной стали клетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетка должна иметь несколько уровней, быть способны выдержать вес нескольких крыс, заполняется со стандартнымипостельные принадлежности, и есть несколько мест для крепления бутылки с водой и пищевые диспенсеров.
   2. Поместите роман, красочные объекты различных размеров и форм в клетке.
      1. Поместите 6 больших игрушек в клетке EC. Убедитесь в том, что каждая игрушка является достаточно большим для 3-х или более крыс, чтобы взаимодействовать с одновременно.
      2. Поместите 6 средних игрушек в клетке EC. Убедитесь в том, что каждая игрушка является достаточно большим для 3 - 4 крысы взаимодействовать с одновременно.
      3. Поместите много (по крайней мере, 20) мелких игрушек в клетке EC.
      4. Используйте игрушки различных цветов, форм, размеров и т.д. Новинка имеет решающее значение для этого вмешательства (обсуждение см).
   3. Поместите две тарелки еды на противоположных концах клетки.
   4. Поместите две бутылки воды на противоположных концах клетки.
2. В 9 часов утра на PD 42, взвесить все животные и перемещать WR животных в клетке EC. Каждая клетка EC должна содержать 9 - 12 животных.
   1. Убедитесь, что ни одно животное не имеют как один и тот же pawmark и ушной каламбуркан узоры.
3. Проверьте все продукты питания и воды ежедневно.
4. Каждые два дня, удалить игрушки из клетки EC и заменить их (в соответствии со стадией 4.1.2.).
5. Каждые три дня, чистить клетку EC.
   1. Удалить животных из клетки EC и поместить их в временного содержания клеток 2 - 3 животных.
   2. Удалить все подстилки из нижней части клетки.
   3. Возвращение те же игрушки в клетке, если этот день не совпадает с графиком замены игрушка (согласно пункту 4.4.).
   4. Заменить всю пищу и воду.
   5. Заменить крыс в клетку EC.

5. Сбор тканей

Примечание: коллекция тканей (например, перфузия с параформальдегидом) и хранения (например, замораживание, парафин) может быть осуществлено с помощью различных методов. Ниже будет объяснить процесс перфузии 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатно-буферном солевом растворе (4% параформальдегида в PBS) Раствор ^8.

Внимание: параформальдегид является канцерогеном и может вызвать раздражение кожи, аллергические реакции кожи или повреждение глаз. Используйте соответствующие средства защиты глаз / кожи.

1. Expose одна крыса в то время, чтобы Isoflurane слегка обезболить животное.
2. Внутрибрюшинно вводят крысе с 2 мл / кг кетамина / ксилазина смеси (1,5 мл ксилазина смешивают с 10 мл кетамина).
   Примечание: кетамина и ксилазина оба на складе концентрации 100 мг / мл перед соединением для инъекций смеси.
3. После того, как крыса больше не реагирует, не заливать животное с 0,1 М фосфатным буферным раствором (PBS, рН = 7,2), а затем 4% параформальдегидом в PBS (рН = 7,2).
4. Удалить мозг и хранят в 4% параформальдегид в PBS при 4 ° С в течение 48 ч.
5. После 2-х дней, перевод в раствор 30% сахарозы добавляют к 4% параформальдегида в PBS при 4 ° С.

Для того, чтобы оценить эффект супер вмешательства, мы должны смотреть на эффекты каждого из составляющих его элементов - WR и ЕС - на наших мер, представляющих интерес. Цифры от 1 до 3 (ниже) появилась в предыдущей публикации , использующей эту п...

В приведенном выше протоколе мы продемонстрировали целесообразное вмешательство, чтобы спасти нейроанатомических дефицита после неонатального воздействия алкоголя. Это вмешательство может быть использовано в качестве терапевтического средства в других моделях на животных из-за у?...

The authors have nothing to disclose.

We would like to dedicate this work to the memory of late Dr. William T. Greenough, a great mentor, a colleague and a friend. This work was supported by NIH/NIAAA grant number AA009838 and NIH/NIGMS COBRE: The Delaware Center for Neuroscience research grant 1P20GM103653 to AYK. We are grateful to the former and current members of Klintsova lab.