FASD의 동물 모델에서 치료 개입으로 휠 실행 환경의 복잡성

심장 혈관 운동과 복잡한 환경에서 자극의 경험은 쥐의 뇌에서 신경 가소성의 여러 조치에 긍정적 인 효과를 가지고있다. 이 문서에서는 휠 실행 환경의 복잡성을 결합하여 이러한 개입의 한계를 해결할 것 "superintervention"이러한 개입의 구현에 대해 설명합니다.

(광범위 동물 연구에서 사용 된 예를 들면, 휠 실행 (WR)) 유산소 운동 등 성인 신경, 혈관 신생 및 설치류에 신경 영양 인자의 발현 속도와 같은 뇌의 neuroplastic 가능성에 긍정적 인 영향을 많은 조치. 이 개입은 설치류에서 기형 (알코올 즉, 발달 노출) 및 연령과 관련된 신경 퇴행의 부정적 영향의 행동 및 신경 해부학 적 측면을 완화하는 것으로 나타났다. 환경의 복잡성 (EC)은 피질과 피질 하 구조에 수많은 neuroplastic 이익을 생성하는 것으로 나타났다 및 성인 해마의 증식 및 새로운 세포의 생존을 증가시키는 차륜 주행과 결합 될 수있다. 두 개입의 조합은 신경 질환의 설치류 모델의 범위에서 구현 될 수있는 강력한 "superintervention"(WR-EC)를 제공한다. 우리는 WR / EC의 구현과에서 그 구성에 대해 설명합니다인간 태아 알콜에 노출되는 동물 모델을 사용하여 래트에서 더 강력한 치료 개입로서 사용 terventions. 우리는 또한 절차의 요소가 개입을 위해 절대적으로 필요하고 어떤 사람은 실험자의 질문이나 시설에 따라 변경 될 수있는 설명합니다.

다른 환경에서 사육하는 것은 긴 신경 건강의 다양한 방법의 변화를 일으키는 것으로 알려져있다. 많은 연구는, 예를 들어 다이아몬드와 Rosenzweig (에 의해 획기적인 연구를 시작하여 복잡한 환경에서 양육의 유익한 효과 (EC)를 보면 ^{1, 2)과} Greenough (예를 들어, ^{3, 4).} EC 뇌 ^{5, 6, 7} 및 시냅스 세포 변화에 명백한 긍정적 인 효과를 입증하고있다. EC뿐만 아니라 해마 ^{8, 9,} 시각 피질 ^{10, 11,} 복부 선조체 ^{(12, 13)을} 포함한 뇌 영역의 다양성에 영향을 미칠 수있다뇌 전체 신경 면역 기능으로 ^(14에서 검토). 이 EC 수지상 소성 ^{구 (13)를} 통해 치아 이랑 성인 태생 과립 세포의 생존율을 증가시킬 수 있음을 입증 할 때 특히 관심은 해마의 연구로부터 발전되었다. 이 마지막 점으로 인해 심장 혈관 운동이 모두 건강하고 손상된 뇌 ^{15, 16, 17, 18} 성인 신경을 촉진 나타내는 문학의 성장 몸에 많은 관심을 모아왔다. 휠 실행 (WR)은 신경 학적 장애 또는 ^{17, 19, 20 노화의} 쥐 모델에서 도움이 될 것으로 나타났다 자발적인 심장 혈관 활동의 형태를 구현하기 쉽습니다. WR은 성장 인자의 발현에 영향을 미친다 중추 및 말초 신경계 ^{21, 22, 이십삼인치}

는 "superintervention"(WR-EC)에 (이후) WR 및 EC 결합 (즉, EC 30 일까지 다음 WR 12 일)는 해마 성인 신경의 강력한 증가와 새로 증식 된 세포 ^(8)의 증가 생존의 제공 FASD의 동물 모델에 개별 구성 요소에 의해 달성되지 않은 효과 (아래 참조). WR-EC의 두 성분은 뇌 ⁽¹³⁾ 내의 구조물의 다양한 배열을 영향 때문에 간섭의 구현은 용이 신경계 모두의 발달과 나중에 개시 모델 쥐 모델에 적용 할 수있다 ⁽²² 평가 WR, EC ^(24)에서 검토) 손상 (예를 들어, 신생아 알코올 노출, 노화, 생애 초기 스트레스).

윤리 정책 : 다음 프로토콜은 델라웨어 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 발달 노출 (또는 진탕 같은 에탄올 노출의 모델)

1. PD3에서 각 동물의 성별을 결정하고 쓰레기 크기 (8 동물) 및 성별 분포 (4 남성 : 4 여성) 유지하기 위해 필요한 경우 모든 동물을 교차 육성 각각의 쓰레기 내에서 일관성을.
   참고 : 그것은 실험 교란을 방지하기 위해 가능한 한 일관성있는 쓰레기 크기와 성별 분포를 유지하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 쓰레기 당 8 새끼 (4 남성과 4 명의 여성)를 사용하지만, 다른 쓰레기의 크기 나 성별 분포는 실험 설계의 요구에 맞출 수있다.
2. 피하 각 쓰레기 내에 동물을 식별하는 발에 검은 인도 소량의 잉크를 주입.
3. 의사가-무작위로 50 %의 알코올 노출 AE () 50 % 가짜 삽관 제어를 포함하는 등의 실험 새끼를 (지정 (SI) 강아지들) 또는 빨고 제어 (SC) (PD 4에서 모든 삽관, 꼬리 자르기, 또는 분리 프로토콜을받지 않는 동물 - 일) 무게 및 귀 펀치를 제외하고 9.
   1. 일관성 그룹 크기를 유지하려면, SC의 새끼 두 배 많은 실험 새끼를 할당합니다.
4. 다음 홈 케이지에 반환 각 동물의 무게. 동물은 삽관 기간 (- 9 PD 4) 동안 매일 발생합니다 무게.
   1. 댐에서 전체 쓰레기를 제거합니다.
   2. 가열 패드에 새끼를 놓습니다.
   3. 각 강아지의 중량을 기록한다.
5. PD4에서, 각각의 동물을 중량 측정 후, 각 동물 당 5.25 g / kg / 일의 총 필요한 알콜 양을 계산한다 (단계 1.4에서 강아지 중량 기준) ^8.
   1. 11.9 % 에탄올에 우유 대체 (부피 / 부피)로 알코올을 관리 할 수 ​​있습니다.
6. 오전 9시에 시작, 한 번에 어머니로부터 한 쓰레기의 새끼를 제거합니다.
7. 각 AE 강아지에 에탄올에 우유를 관리 (34)입니다.
8. 각 SI 강아지 ⁸ 가짜 삽관.
9. 반복 1.5 단계를 반복합니다. 1.8을 통해. 각 실험 쓰레기합니다.
10. 제 도즈 다음 두 시간 동안은 제 2 알코올 투여 용 투여 절차 (180 내지 150 단계) 반복한다.
11. 1.5 시간 초 알코올 도즈 (피크 매일 혈중 알코올 농도가 달성되는 지점) 후, 수집하고 미래 혈중 알코올 농도 분석 ³⁵ 패스 꼬리 통해 AE 및 SI 새끼로부터 원심 피.
    1. 혈액의 60 μL를 수집합니다.
    2. 1 ML의 microcentrifuge 관에서 혈액을 놓습니다. 25 분 1.5 XG에 원심 분리기 혈액입니다.
    3. 조심스럽게 원심 분리 튜브로부터의 상징액 혈청을 수집하고 미래 혈중 알코올 농도 분석을 위해 저장한다.
12. AE의 간호 무능력에서 영양 결핍을 방지하기 위해 에탄올에 우유 대신 우유를 사용하여 투약 절차 (1.8 단계 1.5) 반복새끼.
    1. PD 사에 2 시간 간격이 보충 우유 용량의 총을 수행합니다.
13. 9 - 반복 PD 5 1.4 (단계 1.11 제외) 1.12을 통해 단계를 반복합니다.
14. PD9에 대한 최종 보충 우유 량에 따라, 귀는 EC 케이지의 식별을 위해 모든 새끼 펀치.
    1. 쓰레기 번호 또는 식별자의 일부 측정 값 천공 귀 좌표 (짝수 새끼에서 동물 권리 귀 펀치 얻을 것 동안 예를 들면, 집단 내에서 홀수 새끼가 자신의 왼쪽 귀를 얻을 것입니다 것은 천공). 이렇게하면, 다른 담가 여러 동물 동일한 pawmark 패턴을 가져야 EC 장에 동물을 식별 할 것이다.

2. 이유 용

1. PD (23)에, 집 2의 새장에있는 모든 동물 - 3.
   1. 같은 케이지에 보관 모든 동물이 동성인지 확인합니다.
   2. 하나 SC, 하나의 SI 및 케이지 당 하나의 AE 동물 수를 포함합니다.
   3. 케이지 동료의 수 일 최소화에서 같은 쓰레기에서 있습니다.
   4. 모든 동물은 음식과 물에 액세스 할 수 있는지 확인합니다.

3. 휠 실행

1. PD30에서 WR에 동물 케이지의 절반을 할당합니다. 하우스 부착 된 스테인레스 스틸 실행 휠에 무료로 액세스 할 수있는 새장에 동물.
   1. 바퀴 회전 수를 평가하는 카운터가 있는지 확인합니다.
2. PD (30)와 PD (36)에 모든 동물의 무게를.
3. 오전 9시 매일 각 바퀴의 회전 수를 확인합니다.
4. 12 일 기준 해당 주택 상태에서 동물을 둡니다.

4. 환경 복잡성

1. 실험 동물에 대한 PD (42)에 해당하는 일 오전 9 전에 EC 케이지를 준비합니다.
   1. 30 "X 18"X 36 "아연 도금 강판 케이지를 가져옵니다.
      주 : 케이지는, 복수의 수치가 여러 쥐의 무게를 지탱할 수 있어야 표준 채워질침구, 물 병 및 식품 디스펜서를 연결하는 여러 위치에 있습니다.
   2. 소설, 케이지의 변수 크기와 모양의 화려한 개체를 배치합니다.
      1. EC의 케이지 6 큰 장난감을 놓습니다. 각 장난감 동시에 상호 작용하는 3 인 이상 쥐 충분히 큰 있는지 확인하십시오.
      2. EC의 케이지 6 매체 장난감을 놓습니다. 4 쥐가 동시에와 상호 작용 - 3 각 장난감이 충분한 크기를 확인합니다.
      3. EC의 케이지에 작은 장난감을 많이 (최소 20)를 배치합니다.
      4. (설명 참조) 참신이 개입에 중요하다 등 다양한 색상, 모양, 크기의 장난감을 사용합니다.
   3. 케이지의 양단에서 음식이 요리를 놓습니다.
   4. 케이지의 양단에 물 두 병을 놓습니다.
2. PD (42)에 오전 9시, 모든 동물의 무게와 EC 케이지에 WR 동물 위치를 변경합니다. (12) 동물 - 각 EC 케이지 (9)를 포함해야합니다.
   1. 어떤 동물이 같은 pawmark과 귀 말장난 모두가 없는지 확인채널 패턴입니다.
3. 모든 음식과 물을 매일 확인합니다.
4. 이틀는 EC 케이지에서 장난감을 제거하고 교체 (단계 4.1.2에 따라.).
5. 3 일의 EC 케이지를 청소합니다.
   1. EC의 케이지에서 동물을 제거하고 2의 임시 보유 케이지에 넣어 - 3 동물.
   2. 케이지의 바닥에서 침구를 모두 제거합니다.
   3. 이 날은 장난감 교체 일정과 일치하지 않는 케이지에 같은 장난감을 돌려줍니다 (4.4 단계에 따라.).
   4. 음식과 물을 모두 교체합니다.
   5. EC의 케이지에 쥐를 교체합니다.

5. 수집 조직

주 : 조직 수집 (예를 들어, 파라 포름 알데히드 관류) 및 저장 (예를 들어, 동결 파라핀 매립)은 다양한 방법으로 수행 될 수있다. 다음 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 4 % 파라 포름 알데히드 관류하는 과정을 설명 할 것이다) 용액 ^(8).

주의 : 파라 포름 알데히드는 발암 성이며, 또한 피부 자극, 알레르기 성 피부 반응, 또는 눈에 손상을 일으킬 수 있습니다. 적절한 눈 / 피부 보호를 사용합니다.

1. 가볍게 동물을 이소 플루 란 마취 한 번에 하나의 쥐를 노출.
2. 복강 내 케타민 / 자일 라진 혼합물 (케타민 10 ㎖의 혼합 용액 1.5의 자일 라진)을 2 ㎖ / kg으로 래트를 주입.
   참고 : 케타민과 자일 라진 사출 혼합물에 대한 결합하기 전에 100 ㎎ / ㎖의 재고 농도에서 모두 있습니다.
3. (하여 pH = 7.2 PBS) PBS로 4 % 파라 포름 알데히드 하였다 (PH = 7.2) 쥐가 더 이상 응답되면 0.1 M 인산염 완충 식염수 동물 관류 없다.
4. 48 시간 동안 4 ° C에서 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 두뇌와 저장소를 제거합니다.
5. 이일 후, 30 % 수크로오스 용액을 이송 4 ℃에서 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드에 첨가 하였다.

WR 및 EC - - 수퍼 간섭의 효과를 평가하기 위해, 우리는 그 구성 요소들 각각의 효과를 살펴보아야 관심 우리의 방법에. 3 (아래)를 통해 1이이 패러다임 ^{(8)을 이용하여} 이전 책에서 등장 인물. 그림 4는 박사 학위 논문 ^(36)에 출연했다. 이러한 데이터는 치아 이랑에서 해마 성인 신경에서 ...

위의 프로토콜에서, 우리는 신생아 알코올 노출 다음과 신경 해부학 적자를 구출하는 편법 개입을 보여 주었다. 이 개입 인한 간섭의 각 성분의 견고성 다른 동물 모델에서 치료 적으로 사용될 수있다. WR의 형태로 자발 심혈관 활성은 여러 행동 결과 ^{38,39 이점} 및 ^((40)에 검토) 해마 같은 뇌 영역에 기능성 플라스틱 변형을 유도하는 것?...

The authors have nothing to disclose.

We would like to dedicate this work to the memory of late Dr. William T. Greenough, a great mentor, a colleague and a friend. This work was supported by NIH/NIAAA grant number AA009838 and NIH/NIGMS COBRE: The Delaware Center for Neuroscience research grant 1P20GM103653 to AYK. We are grateful to the former and current members of Klintsova lab.