Esecuzione ruota e complessità ambientale come un intervento terapeutico in un modello animale di FASD

Esercizio cardiovascolare ed esperienze stimolanti in un ambiente complesso hanno effetti positivi su più misure di neuroplasticità nel cervello dei roditori. Questo articolo discuterà l'attuazione di tali interventi come "superintervention", che combina in esecuzione ruota e complessità ambientale e affronterà i limiti di questi interventi.

L'esercizio aerobico (per esempio, ruote in esecuzione (WR) ampiamente utilizzato nella ricerca animale) impatto positivo molte misure di potenziale neuroplastico nel cervello, come i tassi di neurogenesi adulta, l'angiogenesi, e l'espressione di fattori neurotrofici nei roditori. Questo intervento è stato dimostrato anche per mitigare gli aspetti comportamentali e neuroanatomici degli impatti negativi del teratogeni (cioè, l'esposizione dello sviluppo di alcool) e neurodegenerazione legata all'età nei roditori. complessità ambientale (CE) ha dimostrato di produrre numerosi benefici neuroplastici nelle strutture corticali e subcorticali e può essere accoppiato con ruota in esecuzione per aumentare la proliferazione e la sopravvivenza di nuove cellule nell'ippocampo adulto. La combinazione di questi due interventi fornisce un robusto "superintervention" (WR-EC) che può essere implementata in una varietà di modelli di roditori di disturbi neurologici. Discuteremo l'attuazione della WR / CE e la sua costituenteinterven- per l'uso come più potente intervento terapeutico nei ratti utilizzando il modello animale di esposizione prenatale ad alcol negli esseri umani. Discuteremo anche quali elementi delle procedure sono assolutamente necessari per gli interventi e quali possono essere modificate a seconda domanda o strutture dello sperimentatore.

Allevamento in ambienti diversi è nota da tempo per causare cambiamenti in varie misure di benessere neurologico. Molti studi guardano gli effetti benefici di allevamento in un ambiente complesso (CE) che iniziano con una ricerca innovativa da Diamond e Rosenzweig (ad esempio, ^{1, 2)} e Greenough (Ad esempio, ^{3, 4).} CE ha dimostrato di avere un effetto positivo sulla innegabili cambiamenti sinaptici e cellulari nel cervello ^{5, 6, 7.} CE può interessare una molteplicità di regioni cerebrali tra cui l'ippocampo ^{8, 9} e corteccia visiva ^{10, 11,} striato ventrale ^{12, 13,} nonchécome la funzione neuroimmune a livello cerebrale (rivisto in ^14). Particolare interesse si è sviluppato dagli studi su ippocampo quando è stato dimostrato che CE può aumentare il tasso di sopravvivenza delle cellule granulari adulti nati del giro dentato attraverso la plasticità dendritiche ^{9, 13.} Questo ultimo punto ha raccolto molto interesse a causa della crescente corpo di letteratura che indica che l'esercizio cardiovascolare promuove la neurogenesi adulta sia in buona salute e danneggiato il cervello ^{15, 16, 17, 18.} In esecuzione della rotella (WR) è un facile da implementare forma di attività cardiovascolare volontariato che ha dimostrato di essere utile in modelli di roditori di disturbi neurologici o invecchiamento ^{17, 19, 20.} WR influenza l'espressione dei fattori di crescita sia nel sistema nervoso centrale e periferico ^{21, 22, 23.}

Combinando (successivamente) WR e EC in un "superintervention" (WR-CE) (cioè, 12 giorni di WR seguiti da 30 giorni in EC) prevede un aumento robusta ippocampali neurogenesi adulta e un aumento della sopravvivenza delle cellule neo proliferato ^8, la effetto che nel modello animale di FASD non è raggiunto da singoli componenti (vedi sotto). Dal momento che entrambe le componenti del WR-CE riguardano una gamma diversificata di strutture all'interno del cervello ¹³ (WR rivisto in ^22, CE recensione in ^24), l'attuazione di questo intervento può essere facilmente applicato ai modelli di roditori di entrambi i modelli insorgenza di vita di sviluppo e successive di neurologico impairment (per esempio, l'esposizione di alcol neonatale, l'invecchiamento, presto lo stress della vita).

Etica Dichiarazione: Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Delaware.

1. L'esposizione dello sviluppo (o modello di binge-come l'etanolo esposizione)

1. Su PD3, determinare il sesso di ogni animale e cross-promuovere tutti gli animali, se necessario, per mantenere le dimensioni lettiera (8 animali) e la distribuzione del sesso (4 maschi: 4 femmine) coerente all'interno di ogni cucciolata.
   NOTA: E 'importante mantenere le dimensioni lettiera e la distribuzione del sesso più coerente possibile per evitare confonde sperimentali. Anche se questo protocollo utilizza 8 cuccioli (4 maschi e 4 femmine) per figliata, dimensioni dei cuccioli alternativi o distribuzioni sessuali possono essere adattati alle esigenze del disegno sperimentale.
2. Per via sottocutanea iniettare una piccola quantità di inchiostro di china nero nelle zampe per identificare gli animali all'interno di ogni cucciolata.
3. Pseudo-casuale assegnare cucciolate come sperimentali (che contengono il controllo sham-intubati alcool-esposti (AE) e il 50% al 50% (SI) pups) o succhiare il controllo (SC) (animali che non sono sottoposti ad alcuna intubazione, la coda di ritaglio, o protocolli di separazione dal PD 4-9, tranne per la pesatura quotidiana e l'orecchio-punzonatura).
   1. Per mantenere la dimensione del gruppo coerente, assegnare il doppio delle cucciolate sperimentali come cucciolate SC.
4. Pesare ogni animale per poi tornare alla sua gabbia casa. Pesatura di animali dovrebbe avvenire ogni giorno durante il periodo di intubazione (PD 4-9).
   1. Rimuovere l'intera cucciolata dalla diga.
   2. Posizionare cuccioli su tappetino riscaldato.
   3. Registrare il peso di ogni singolo cucciolo.
5. In PD4, dopo aver valutato ogni animale calcolare la quantità di alcol necessario per un totale di 5,25 g / kg / giorno per ciascun animale (in base al peso dei cuccioli dal punto 1.4) ^8.
   1. Somministrare alcol come 11,9% di etanolo-in-latte sostitutivo (vol / vol).
6. A partire da 09:00, rimuovere uno cuccioli di lettiera dalla madre alla volta.
7. Somministrare l'etanolo-in-latte per ogni cucciolo AE 34.
8. Sham-intubare ogni cucciolo SI ^8.
9. Ripetere i punti 1.5. attraverso 1.8. per ogni cucciolata sperimentale.
10. Due ore dopo la prima dose, ripetere la procedura di dosaggio (punti 1.5 tramite 1.8) per una seconda dose di alcol.
11. Un'ora e mezza dopo la seconda dose di alcol (il punto in cui viene raggiunto picco contenuti al giorno di alcol nel sangue), la raccolta e il sangue centrifuga dalla cuccioli AE e SI tramite la coda di ritaglio per il futuro di alcol nel sangue analisi del contenuto ^35.
    1. Raccogliere 60 ml di sangue.
    2. Mettere il sangue in una provetta 1 ml. sangue centrifugare a 1,5 g per 25 min.
    3. Raccogliere accuratamente il siero surnatante dalla provetta e salvare per le future analisi del contenuto di alcol nel sangue.
12. Ripetere la procedura di dosaggio (punti 1.5 tramite 1.8) con latte al posto di etanolo-in-latte per evitare deficit nutrizionali dalla incapacità di cura in AEcuccioli.
    1. Eseguire un totale di 2 dosi di latte supplementari 2 h a parte il PD 4.
13. Ripetere i passaggi 1.4 tramite 1.12 (tranne che per il punto 1.11) il PD 5-9.
14. Dopo la dose di latte supplementare finale sul PD9, orecchio pugno tutti i cuccioli per l'identificazione nella gabbia CE.
    1. Coordinate orecchio perforato con un certo grado di numero di strame o identificativo (ad esempio, cucciolate dispari all'interno di una coorte otterrebbe loro orecchio sinistro pugno mentre gli animali provenienti da cucciolate numero pari otterrebbe loro orecchio destro perforato). In questo modo sarà più facile identificare gli animali in gabbia CE dovrebbero più animali provenienti da diverse cucciolate avere lo stesso modello pawmark.

2. Lo svezzamento

1. Su PD 23, casa di tutti gli animali in gabbie di 2 - 3.
   1. Assicurarsi che tutti gli animali alloggiati nella stessa gabbia sono dello stesso sesso.
   2. Include una SC, un SI, e uno AE animali per gabbia, quando possibile.
   3. Ridurre al minimo il numero di compagni di gabbia °a sono dalla stessa cucciolata.
   4. Assicurarsi che tutti gli animali sono in grado di accedere a cibo e acqua.

Esecuzione 3. Wheel

1. Su PD30, destinare la metà delle gabbie con gli animali a WR. Casa questi animali in gabbie con un accesso gratuito a ruota in esecuzione in acciaio inox in allegato.
   1. Assicurarsi che le ruote hanno un contatore per calcolare il numero totale di giri.
2. Pesare tutti gli animali sul PD 30 e PD 36.
3. Controllare il numero di giri di ciascuna ruota alle 9 ogni giorno.
4. Lasciare animali nel loro rispettiva condizione custodia per 12 giorni.

4. complessità ambientale

1. Preparare la gabbia CE prima 09:00 nel giorno che corrisponde al PD 42 per animali da esperimento.
   1. Ottenere un 30 "x 18" x 36 "gabbia d'acciaio zincato.
      NOTA: La gabbia dovrebbe avere più livelli, sia in grado di sostenere il peso di molteplici ratti, essere riempito con il campionebiancheria da letto, e hanno più sedi per fissare bottiglie d'acqua e distributori di cibo.
   2. Mettere romanzo, oggetti colorati di dimensioni variabili e forme nella gabbia.
      1. Mettere 6 grandi giocattoli nella gabbia CE. Assicurarsi che ogni giocattolo è abbastanza grande per 3 o più ratti per interagire con contemporaneamente.
      2. Mettere 6 giocattoli di media nella gabbia CE. Assicurarsi che ogni giocattolo è abbastanza grande per 3 - 4 ratti di interagire con contemporaneamente.
      3. Collocare un sacco (almeno 20) di giocattoli piccoli nella gabbia CE.
      4. Utilizzare i giocattoli di diversi colori, forme, dimensioni, ecc novità è fondamentale per questo intervento (vedi la discussione).
   3. Inserire due piatti di alimento alle estremità opposte della gabbia.
   4. Inserire due bottiglie di acqua in corrispondenza di estremità opposte della gabbia.
2. Alle 9 del mattino del PD 42, pesare tutti gli animali e riposizionare gli animali WR alla gabbia CE. Ogni gabbia CE deve contenere 9 - 12 animali.
   1. Assicurarsi che nessun animali hanno entrambi lo stesso pawmark e l'orecchio-gioco di parolemodelli ch.
3. Controllare tutto il cibo e acqua al giorno.
4. Ogni due giorni, togliere i giocattoli dalla gabbia CE e sostituirli (secondo passo 4.1.2.).
5. Ogni tre giorni, pulire la gabbia CE.
   1. Rimuovere gli animali dalla gabbia CE e metterli in gabbie di permanenza temporanea di 2 - 3 animali.
   2. Rimuovere tutti i letti dal fondo della gabbia.
   3. Restituire lo stesso giocattoli alla gabbia a meno che questo giorno coincide con il programma di giocattolo di sostituzione (in base al punto 4.4.).
   4. Sostituire tutto il cibo e l'acqua.
   5. Sostituire i topi nella gabbia CE.

5. Tessuto Collect

NOTA: raccolta Tissue (ad esempio, perfusione con paraformaldeide) e stoccaggio (ad esempio, gelati, paraffina) può essere eseguita con una varietà di metodi. Quanto segue spiegherà il processo di perfusione con 4% paraformaldeide in 0,1 M tampone fosfato (4% paraformaldeide in PBS) Soluzione ^8.

Attenzione: Paraformaldeide è cancerogeno e può anche causare irritazioni cutanee, reazioni allergiche della pelle, o di danni agli occhi. Utilizzare adeguata protezione per gli occhi / pelle.

1. Esporre un ratto alla volta per isoflurano per anestetizzare leggermente l'animale.
2. Intraperitoneale iniettare il ratto con 2 ml / kg di miscela ketamina / xilazina (1,5 ml xylazina mescolato con 10 ml di ketamina).
   NOTA: ketamina e xilazina sono entrambi a concentrazioni archivi di 100 mg / mL prima della combinazione per la miscela di iniezione.
3. Una volta ratto non è più reattivo, profumato l'animale con 0,1 M tampone fosfato salino (PBS, pH = 7,2) seguito da 4% paraformaldeide in PBS (pH = 7,2).
4. Rimuovere cervello e conservare in 4% paraformaldeide in PBS a 4 ° C per 48 h.
5. Dopo 2 giorni, trasferimento di soluzione al 30% di saccarosio aggiunto al 4% paraformaldeide in PBS a 4 ° C.

Al fine di valutare l'effetto dell'intervento super, dobbiamo guardare gli effetti di ciascuno dei suoi elementi costitutivi - WR e CE - sulle nostre misure di interesse. Le figure da 1 a 3 (di seguito) è apparso in una precedente pubblicazione che utilizza questo paradigma ^8. Figura 4 è apparso in una tesi di dottorato ^36. Questi dati dimostrano l'impatto di ...

Nel protocollo di cui sopra, abbiamo dimostrato un intervento espediente per salvare i deficit neuroanatomiche seguenti l'esposizione di alcol neonatale. Questo intervento può essere utilizzato come terapeutico in altri modelli animali a causa della robustezza di ciascuno dei componenti dell'intervento. Volontario attività cardiovascolare in forma di WR ha dimostrato di beneficiare diversi risultati comportamentali ^{38, 39} e indurre alterazioni plastica...

The authors have nothing to disclose.

We would like to dedicate this work to the memory of late Dr. William T. Greenough, a great mentor, a colleague and a friend. This work was supported by NIH/NIAAA grant number AA009838 and NIH/NIGMS COBRE: The Delaware Center for Neuroscience research grant 1P20GM103653 to AYK. We are grateful to the former and current members of Klintsova lab.