Course de roue et la complexité de l'environnement comme une intervention thérapeutique dans un modèle animal de l'ETCAF

L'exercice cardiovasculaire et des expériences stimulantes dans un environnement complexe ont des effets bénéfiques sur plusieurs mesures de neuroplasticité dans le cerveau des rongeurs. Cet article va discuter de la mise en œuvre de ces interventions comme un "superintervention" qui combine la course roue et la complexité de l'environnement et se penchera sur les limites de ces interventions.

L' exercice aérobie (par exemple, la roue en cours d' exécution (WR) largement utilisé dans la recherche animale) un impact positif sur de nombreuses mesures de potentiel neuroplastique dans le cerveau, comme les taux de neurogenèse adulte, l' angiogenèse, et l' expression de facteurs neurotrophiques chez les rongeurs. Cette intervention a également été montré pour atténuer les aspects comportementaux et neuroanatomiques des impacts négatifs de tératogènes (c. -à- exposition de développement à l' alcool) et la neurodégénérescence liée à l' âge chez les rongeurs. la complexité de l'environnement (CE) a été montré pour produire de nombreux avantages neuroplastiques dans les structures corticales et sous-corticales et peut être couplé avec la roue en marche pour augmenter la prolifération et la survie de nouvelles cellules dans l'hippocampe adulte. La combinaison de ces deux interventions fournit un "superintervention" robuste (WR-CE) qui peuvent être mis en œuvre dans une gamme de modèles de rongeurs de troubles neurologiques. Nous allons discuter de la mise en œuvre de WR / CE et son constituant dansinterventions pour une utilisation comme une intervention thérapeutique plus puissant chez les rats en utilisant le modèle animal de l'exposition prénatale à l'alcool chez l'homme. Nous allons également discuter de quels éléments des procédures sont absolument nécessaires pour les interventions et celles qui peuvent être modifiés en fonction de la question ou des installations de l'expérimentateur.

L'élevage dans des environnements différents a longtemps été connu pour provoquer des changements dans diverses mesures de bien-être neurologique. De nombreuses études portent sur les effets bénéfiques de l' élevage dans un environnement complexe (CE) en commençant par la recherche de pointe par Diamond et Rosenzweig (par exemple, ^{1, 2)} et Greenough (Par exemple, ^{3, 4).} CE a été démontré avoir un effet positif indéniable sur les changements synaptiques et cellulaires dans le cerveau ^{5, 6, 7.} CE peut affecter un grand nombre de régions du cerveau , y compris l'hippocampe ^{8, 9} et le cortex visuel ^{10, 11,} striatum ventral ^{12, 13,} ainsi queen fonction neuroimmunitaire cerveau à l' échelle (revue dans ^14). Un intérêt particulier a mis au point à partir des études sur l' hippocampe quand il a été démontré que la CE peut augmenter le taux de cellules granulaires adultes-né du gyrus denté survie à travers la plasticité dendritique ^{9, 13.} Ce dernier point a recueilli beaucoup d' intérêt en raison de la masse croissante de la littérature indiquant que l' exercice cardiovasculaire favorise la neurogenèse adulte dans le cerveau à la fois sain et endommagé ^{15, 16, 17, 18.} Roue roulement (WR) est un outil facile à mettre en œuvre sous forme d'activité cardiovasculaire volontaire qui a été montré pour être bénéfique dans des modèles de rongeurs de troubles neurologiques ou de vieillissement ^{17, 19, 20.} WR affecte l'expression de facteurs de croissance à la fois dans le système nerveux central et périphérique ^{21, 22, 23.}

La combinaison (suite) WR et CE dans un "superintervention" (WR-CE) (soit 12 jours de WR suivie de 30 jours dans l'affaire CE) prévoit une forte augmentation de la neurogenèse adulte hippocampique et l' augmentation de la survie des cellules nouvellement proliféré ^8, le effet que, dans le modèle animal de l'ETCAF est pas obtenue par des composants individuels (voir ci-dessous). Comme les deux composantes du WR-CE affectent un large éventail de structures dans le cerveau ¹³ (WR examinées dans ^22, EC a examiné en ^24), la mise en œuvre de cette intervention peut facilement être appliquée à des modèles de rongeurs des deux vie modèles d' apparition de développement et ultérieures de neurologique dépréciation (par exemple, l' exposition à l'alcool néonatale, le vieillissement, le stress au début de la vie).

Déclaration d'éthique: Le protocole suivant a été approuvé par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université du Delaware.

1. Exposition de développement (ou modèle de Binge-like Ethanol exposition)

1. Sur PD3, déterminer le sexe de chaque animal et de contre-favoriser les animaux si nécessaire pour maintenir la taille des portées (8 animaux) et le sexe (4 mâles: 4 femelles) cohérente au sein de chaque portée.
   NOTE: Il est important de garder la taille des portées et le sexe aussi cohérente que possible afin d'éviter les facteurs confusionnels expérimentaux. Bien que ce protocole utilise 8 chiots (4 mâles et 4 femelles) par portée, la taille des portées alternatives ou des distributions de sexe peuvent être adaptées aux besoins de la conception expérimentale.
2. Sous-cutanée d'injecter une petite quantité de l'encre de Chine dans les pattes pour identifier les animaux dans chaque portée.
3. Pseudo-aléatoire assigner portées comme expérimentales (contenant 50% de contrôle de sham-intubé alcool exposée (AE) et 50% (SI) chiots) ou téter contrôle (SC) (animaux qui ne subissent aucune intubation, queue écrêtage, ou des protocoles de séparation du PD 4-9, sauf pour les jours de pesée et l'oreille-poinçonnage).
   1. Pour conserver la taille du groupe cohérent, attribuer deux fois plus portées expérimentales que portées SC.
4. Peser chaque animal, puis le retourner à sa cage. pesée des animaux devrait avoir lieu tous les jours pendant la période d'intubation (PD 4-9).
   1. Retirez toute la portée du barrage.
   2. Placez chiots sur pad chauffé.
   3. Noter le poids de chaque chiot individuel.
5. Sur PD4, après avoir pesé chaque animal calculer la quantité d'alcool nécessaire pour un total de 5,25 g / kg / jour par chaque animal (sur la base du poids des petits de l' étape 1.4) ^8.
   1. Administrer l'alcool comme l'éthanol 11,9% en substitut de lait (vol / vol).
6. À partir de 9 heures, retirer un chiots de la litière de la mère à la fois.
7. Administrer l'éthanol en lait pour chaque chiot AE ^34.
8. Sham-intuber chaque chiot SI ^8.
9. Répétez les étapes 1.5. grâce à 1,8. pour chaque portée expérimentale.
10. Deux heures après la première dose, répétez la procédure de dosage (étapes 1.5 à 1.8) pour une deuxième dose d'alcool.
11. Une heure et demie après la dose d'alcool seconde (le point où la teneur en alcool dans le sang quotidien pic est atteint), recueillir et centrifuger le sang des chiots AE et SI via la queue d' écrêtage pour l' avenir de l' alcool dans le sang analyse du contenu ^35.
    1. Recueillir 60 pi de sang.
    2. Placer le sang dans un microtube de 1 ml. sang Centrifugeuse à 1,5 g pendant 25 min.
    3. Recueillir soigneusement le sérum surnageant du tube de centrifugeuse et à épargner pour les futures analyses de teneur en alcool dans le sang.
12. Répétez la procédure de dosage (étapes 1.5 à 1.8) en utilisant du lait au lieu de l'éthanol en lait pour éviter les déficits nutritionnels de l'incapacité des soins infirmiers dans AEchiots.
    1. Effectuer un total de 2 doses de lait supplémentaires 2 h d'intervalle sur PD 4.
13. Répétez les étapes 1.4 à 1.12 (sauf pour l'étape 1.11) sur PD 5-9.
14. Suite à la dose de lait supplémentaire final sur PD9, oreille poinçon tous les chiots pour l'identification dans la cage CE.
    1. Coordonner l' oreille perforé avec un certain nombre ou identifiant déchets (par exemple, les portées impaires au sein d' une cohorte obtiendraient leur oreille gauche poing tandis que les animaux de portées paires obtiendraient leur oreille droite des coups de poing). Ainsi, il sera plus facile d'identifier les animaux dans la cage CE doivent plusieurs animaux de portées différentes ont le même modèle de pawmark.

2. sevrage

1. Sur PD 23, maison tous les animaux dans des cages de 2 - 3.
   1. Veiller à ce que tous les animaux logés dans la même cage sont du même sexe.
   2. Inclure un SC, un SI, et un animal AE par cage lorsque cela est possible.
   3. Minimiser le nombre de compagnons de cage eau sont de la même portée.
   4. Assurez-vous que tous les animaux sont capables d'accéder à la nourriture et de l'eau.

Course 3. Roue

1. Le PD30, allouer la moitié des cages avec des animaux à WR. Maison ces animaux dans des cages avec un accès libre à joint roue de roulement en acier inoxydable.
   1. Veiller à ce que les roues ont un compteur d'évaluer le nombre total de révolutions.
2. Peser tous les animaux sur PD 30 et PD 36.
3. Vérifiez le nombre de tours de chaque roue à 9 heures tous les jours.
4. Laissez les animaux dans leur état de logement respectif pendant 12 jours.

4. Complexité environnementale

1. Préparer la cage CE avant 9 heures le jour qui correspond à PD 42 pour les animaux de laboratoire.
   1. Obtenez un "x 18" x 36 "cage en acier galvanisé 30.
      NOTE: La cage doit avoir de multiples niveaux, être capable de supporter le poids de plusieurs rats, être rempli avec la normeliterie, et ont de multiples endroits pour attacher des bouteilles d'eau et des distributeurs alimentaires.
   2. Placez roman, objets colorés de tailles variables et des formes dans la cage.
      1. Placez 6 gros jouets dans la cage CE. Assurez-vous que chaque jouet est assez grand pour 3 ou plus des rats pour interagir avec en même temps.
      2. Placez 6 jouets moyennes dans la cage CE. Assurez-vous que chaque jouet est assez grand pour 3 - 4 rats d'interagir avec en même temps.
      3. Placez un lot (au moins 20) des petits jouets dans la cage CE.
      4. Utilisez des jouets de différentes couleurs, les formes, la taille, etc. La nouveauté est essentielle à cette intervention (voir la discussion).
   3. Placez deux plats de nourriture aux extrémités opposées de la cage.
   4. Placer deux bouteilles d'eau au niveau des extrémités opposées de la cage.
2. A 9 heures du matin le PD 42, peser tous les animaux et de déplacer les animaux WR à la cage CE. Chaque cage CE doit contenir 9 - 12 animaux.
   1. Assurez-vous qu'aucun animal ont tous deux la même pawmark et l'oreille-punmotifs ch.
3. Vérifiez tous les aliments et de l'eau tous les jours.
4. Tous les deux jours, retirer les jouets de la cage CE et les remplacer (selon l'étape 4.1.2.).
5. Tous les trois jours, nettoyer la cage CE.
   1. Retirer les animaux de la cage CE et de les mettre dans des cages de détention provisoire de 2 - 3 animaux.
   2. Éliminer toute la litière à partir du fond de la cage.
   3. Retour les mêmes jouets à la cage sauf si ce jour coïncide avec le calendrier de remplacement du jouet (selon l'étape 4.4.).
   4. Remplacer tous les aliments et de l'eau.
   5. Remplacer les rats dans la cage CE.

5. Tissue Collect

REMARQUE: la collecte de tissus (par exemple, la perfusion avec du paraformaldehyde) et de stockage (par exemple, la congélation, l' inclusion en paraffine) peut être réalisée avec une variété de méthodes. Ce qui suit va expliquer le processus de perfusion avec 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M tampon phosphate salin (4% de paraformaldehyde dans du PBS) Solution ^8.

Attention: Le paraformaldéhyde est cancérigène et peut également causer une irritation de la peau, une réaction allergique cutanée, ou des lésions oculaires. Utiliser une protection appropriée des yeux / peau.

1. Exposer un rat à la fois à l'isoflurane pour anesthésier légèrement l'animal.
2. Injecter par voie intrapéritonéale chez le rat avec 2 mL / kg de mélange kétamine / xylazine (1,5 ml de xylazine mélangé avec 10 ml de kétamine).
   REMARQUE: kétamine et de xylazine sont tous deux à des concentrations mères de 100 mg / mL avant de les combiner pour le mélange d'injection.
3. Une fois que le rat est plus sensible, perfuser l'animal avec 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS; pH = 7,2), suivie de 4% de paraformaldehyde dans du PBS (pH = 7,2).
4. Retirer le cerveau et stocker dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS à 4 ° C pendant 48 h.
5. Au bout de 2 jours, le transfert à une solution de 30% de saccharose ajouté à 4% de paraformaldehyde dans du PBS à 4 ° C.

Afin d'évaluer l'effet de l'intervention de super, nous devons examiner les effets de chacun de ses éléments constitutifs - WR et CE - sur nos mesures d'intérêt. Les figures 1 à 3 (ci - dessous) est apparu dans une publication précédente en utilisant ce paradigme ^8. Figure 4 est apparu dans une thèse de doctorat ^36. Ces données illustrent l'impact de WR-CE sur ...

Dans le protocole ci-dessus, nous avons démontré une intervention opportune pour sauver les déficits neuroanatomiques suite à une exposition à l'alcool néonatale. Cette intervention peut être utilisée comme agent thérapeutique dans d'autres modèles animaux, en raison de la robustesse de chacune des composantes de l'intervention. Activité cardiovasculaire volontaire sous forme de WR a été montré pour bénéficier plusieurs résultats comportementaux ^38,

The authors have nothing to disclose.

We would like to dedicate this work to the memory of late Dr. William T. Greenough, a great mentor, a colleague and a friend. This work was supported by NIH/NIAAA grant number AA009838 and NIH/NIGMS COBRE: The Delaware Center for Neuroscience research grant 1P20GM103653 to AYK. We are grateful to the former and current members of Klintsova lab.