Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato

Este estudo fornece um método eficaz e estável para obter medula óssea da mandíbula de alta qualidade suficiente, células-tronco mesenquimais com forte capacidade de diferenciação em um curto espaço de tempo. O método baseado em nicho pode ser aplicado no isolamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea de ratos. Nosso estudo isola com sucesso células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula de alta pureza, oferecendo uma fonte celular substancial para a engenharia do tecido ósseo da mandíbula, particularmente no contexto do reparo de defeitos ósseos.

Esses avanços são uma promessa significativa para o campo. Para começar, extraia uma mandíbula de rato de um rato sacrificado. Posicione o bico dos rongeurs na junção dos incisivos de uma mandíbula de rato extraída e do primeiro molar.

Corte a conexão entre os incisivos inferiores e a mandíbula e, em seguida, extraia os incisivos inferiores completamente. Remova todos os molares, seguidos pelo ramo mandibular. Agora separe a parte central da mandíbula ao longo da borda distal do último molar e exponha a cavidade medular.

Em seguida, encha uma seringa descartável de um mililitro com meio completo alfa MEM. Insira a agulha na cavidade da medula óssea. Lave a medula óssea repetidamente em uma placa de cultura contendo meio completo alfa MEM até que o osso fique branco.

Transfira a solução lavada para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar a solução a 800 g durante três minutos à temperatura ambiente. Quando a centrifugação estiver completa, pipetar o sobrenadante e, em seguida, adicionar 10 mililitros de meio completo alfa MEM ao tubo.

Ressuspenda o pellet no meio e transfira a suspensão para uma nova placa de cultura de 10 centímetros de largura. Agora use um rongeur ósseo para dividir a mandíbula corada em fatias de osso. Transfira as fatias ósseas para um tubo contendo três mililitros de solução de colagenase tipo II a 0,1%.

Coloque a mistura de fatias de osso em uma coqueteleira por 90 minutos a 37 graus Celsius e 200 RPM. Quando a incubação estiver completa, centrifugue a mandíbula digerida a 800 g por três minutos à temperatura ambiente. Pipetar o sobrenadante para o eliminar e, em seguida, transferir as células colhidas e as fatias de osso digeridas para placas de poço contendo 10 mililitros de meio completo alfa MEM.

Incube as culturas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada sob 5% de suplementação de dióxido de carbono. Após 72 horas, substitua metade do meio de cultura por meio fresco. Quando as células aderentes estiverem 80 a 90% confluentes, passe-as na proporção de um para dois.

Remova as fatias de osso durante a segunda subcultura. Após 72 horas de cultura, a maioria das células estava suspensa e redonda, com algumas aderidas à parede. Colônias aderentes que eram fusos ou semelhantes a fibroblastos apareceram após cinco dias de cultivo.

As células aderentes atingiram 90% de confluência no sétimo dia e formaram uma forma de cardume de peixes. As células passadas mostraram homogeneidade, eram predominantemente fusiformes e em um padrão semelhante a um vórtice após a confluência.