Technik zur Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Kieferknochenmark von Ratten

Diese Studie bietet eine effektive und stabile Methode, um in kurzer Zeit genügend hochwertige mesenchymale Stammzellen aus Kieferknochenmark mit starker Differenzierungsfähigkeit zu gewinnen. Die nischenbasierte Methode kann bei der Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks von Ratten angewendet werden. Unsere Studie isoliert erfolgreich hochreine mesenchymale Stammzellen des Kieferknochenmarks und bietet damit eine wesentliche Zellquelle für das Tissue Engineering des Kieferknochens, insbesondere im Zusammenhang mit der Reparatur von Knochendefekten.

Diese Fortschritte sind vielversprechend für das Feld. Entnehmen Sie zunächst einen Rattenunterkiefer aus einer euthanasierten Ratte. Positionieren Sie den Rongeur-Schnabel an der Verbindungsstelle zwischen den Schneidezähnen eines extrahierten Rattenunterkiefers und dem ersten Backenzahn.

Schneiden Sie die Verbindung zwischen den unteren Schneidezähnen und dem Unterkiefer ab und ziehen Sie dann die unteren Schneidezähne vollständig heraus. Entferne alle Backenzähne, gefolgt vom Ramus unterkiefer. Trennen Sie nun den mittleren Teil des Unterkiefers entlang des distalen Randes des letzten Backenzahns und legen Sie die Markhöhle frei.

Befüllen Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Einmalspritze mit alpha MEM Komplettmedium. Führen Sie die Nadel in die Knochenmarkhöhle ein. Spülen Sie das Knochenmark wiederholt in eine Kulturschale mit alpha MEM Complete Medium, bis der Knochen weiß wird.

Füllen Sie die ausgespülte Lösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Die Lösung wird bei 800 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, pipettieren Sie den Überstand heraus und geben Sie dann 10 Milliliter alpha MEM complete medium in das Röhrchen.

Suspendieren Sie das Pellet wieder im Medium und geben Sie die Suspension in eine neue, 10 Zentimeter breite Kulturschale. Verwende nun ein Knochenrongeur, um den gespülten Unterkiefer in Knochenscheiben zu teilen. Übertragen Sie die Knochenscheiben in ein Röhrchen mit drei Millilitern 0,1%iger Kollagenaselösung vom Typ II.

Geben Sie die Knochenscheibenmischung für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius und 200 U/min in einen Shaker. Nach Beendigung der Inkubation wird der aufgeschlossene Unterkiefer bei 800 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Pipettieren Sie den Überstand heraus, um ihn zu verwerfen, und übertragen Sie dann die entnommenen Zellen und die verdauten Knochenscheiben in Vertiefungsplatten mit 10 Millilitern Alpha-MEM-Komplettmedium.

Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator unter 5 % Kohlendioxidzusatz. Ersetzen Sie nach 72 Stunden die Hälfte des Nährmediums durch frisches Medium. Wenn die adhärenten Zellen zu 80 bis 90 % konfluent sind, passieren Sie sie in einem Verhältnis von eins zu zwei.

Entfernen Sie die Knochenscheiben während der zweiten Subkultur. Nach 72 Stunden Kultivierung waren die meisten Zellen suspendiert und rund, einige wenige klebten an der Wand. Adhärente Kolonien, die spindel- oder fibroblastenartig waren, erschienen nach fünftägiger Kultur.

Die adhärenten Zellen erreichten am siebten Tag eine Konfluenz von 90 % und bildeten eine Fischschwarmform. Die passageierten Zellen zeigten Homogenität, waren überwiegend spindelförmig und nach der Konfluenz in einem wirbelartigen Muster.