Os peroxissomas realizam a beta oxidação e são propensos a danos de ROS. Este método permite investigar como as células lidam com peroxissomas estressados por ROS. Este protocolo não é usado apenas para atingir globalmente todos os peroxissomas dentro de uma população celular, mas também pode permitir a manipulação dos peroxissomas individuais dentro de células únicas.
A geração de ROS assistida por corante também pode ser usada para atingir organelas fora dos peroxissomas para investigar como as células lidam com lesões de organelas. Para começar, semeie duas vezes 10 para a quinta célula SHSY5Y humana ou seis vezes 10 para a quarta célula NIH H3T3 de camundongo em 840 microlitros de meio de cultura em placas de cultura de 35 milímetros com fundo de vidro com um micropoço de vidro de 20 milímetros de diâmetro. Cultivar as células sob 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 24 horas.
Em seguida, transfectar as células com plasmídeos desejados usando um reagente de transfecção ou transfecção de células SHSY5Y. Diluir plasmídeos em 55 microlitros de DMEM/F-12 sem soro e diluir um microlitro de reagente de transfecção em 55 microlitros de DMEM/F-12 sem soro. Combinar o ADN diluído com o reagente diluído.
Misture delicadamente e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Adicione o complexo ao micropoço de 20 milímetros previamente banhado com 100 microlitros de meio de cultura contendo células SHSY5Y sem antibióticos. Agite suavemente o prato para frente e para trás.
Realizar a transfecção de células NIH 3T3 como demonstrado antes, mas substituir o meio de soro reduzido em vez de DMEM/F-12 livre de soro para diluição de plasmídios e reagente de transfecção. Após duas horas da transfecção, remova o meio contendo reagente de transfecção e adicione um mililitro de meio de cultura fresco. Incubar as células NIH 3T3 ou SHSY5Y a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
Para a produção de ROS ativadas por luz, em 24 horas após a transfecção remova o meio de cultura e adicione 10 microlitros de 200 nanomolares HaloTag TMR ligante ou 200 nanomolares Janelia Fluor 646 HaloTag ligante no micropoço de vidro de 20 milímetros. Transfira o prato para uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e deixe por uma hora para manchar as células. Após uma hora, remova bem o meio de coloração e adicione um mililitro de meio de cultura fresco.
Coloque um prato com fundo de vidro contendo as células desejadas em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma incubadora de palco. No software, clique em Janela de ferramentas, escolha Ocular e clique no botão DIA para acender a luz transmitida. Visualize o prato através da ocular do microscópio e coloque as células em foco girando o botão de foco.
Escolha LSM e clique no botão Dye Detector Select. Clique duas vezes nos corantes desejados na janela pop-up para selecionar as configurações apropriadas de laser e filtro para gerar imagens das células. Clique em Live4x no painel Live para iniciar a varredura rápida a laser para iniciar a triagem dos sinais fluorescentes das células.
Mova o palco usando o controlador de joystick e localize as células médias que expressam diKillerRed VKSKL ou SLP-VKSKL para aplicar estresse ROS nos peroxissomos. Adquira uma imagem da célula desejada. Clique em Janela de ferramentas e escolha Estimulação LSM.
Em seguida, clique no botão de elipse e, na janela Live Image, use o mouse para desenhar uma ROI de 15 micrômetros de diâmetro contendo os peroxissomas desejados aos quais a tensão ROS será aplicada. Para aplicar o estresse ROS, use 561 nanômetros para células com o ligante SLP marcado com diKillerRed VKSKL ou TMR e use 640 nanômetros para células coradas com o ligante SLP marcado com Janelia Fluor 646. Selecione o comprimento de onda do laser para aplicar a tensão ROS.
Insira a porcentagem de laser desejada e a duração. Para a produção de ROS nos peroxissomos, clique em Adquirir e, em seguida, no botão Estimulação para iniciar a varredura com 561 ou 640 nanômetros de luz através das ROIs por 30 segundos cada. Essa estimulação corresponde a aproximadamente 5% de potência do laser para 561 e 640 nanômetros.
Após 30 segundos de iluminação a laser, os peroxissomas dentro das ROIs perdem seus sinais diKillerRed VKSKL, TMR ou Janelia Fluor 646. Esta perda de sinal permite distinguir os peroxissomas iluminados e não iluminados dentro da célula. Para monitorar as células vivas de pexófagos, siga a translocação de Stub1, Hsp70, ubiquitina, p62 ou LC3B marcados com EGFP para os peroxissomas iluminados ou estressados por ROS, por meio de imagens de lapso de tempo usando intervalos de 10 minutos entre os quadros.
A iluminação focal leva à produção instantânea e localizada de ROS dentro de peroxissomas individuais, como indicado pelo repórter fluorescente roGFP2-VKSKL. A imagem diKillerRed VKSKL foi obtida após todas as medidas de roGFP2-VKSKL terem sido feitas para indicar a localização dos peroxissomas danificados. Os dados também mostram que os peroxissomas não iluminados não são afetados, indicando a precisão da metodologia.
Esta metodologia foi utilizada para monitorar a pexofagia mediada por Stub1. Durante esse processo, Hsp70, Stub1, proteínas ubiquitinadas, adaptadores de autofagia p62 e LC3B aparecem subsequentemente em peroxissomas estressados por ROS para conduzir a pexofagia. Usando a mesma estratégia, foi possível danificar simultaneamente todos os peroxissomas em uma placa de cultura para a caracterização bioquímica da pexofagia mediada por Stub1.
Antes da iluminação por LED, a fluorescência EGFP-ubiquitina era homogênea no citoplasma e não colocalizava com os peroxissomos. Após nove horas de iluminação LED, os sinais de EGFP-ubiquitina se acumularam em todos os peroxissomas nas células cultivadas em uma placa confocal. Usando este protocolo, descobrimos que os peroxissomas estressados por ROS são removidos através de uma via de degradação dependente de ubiquitina.
Os peroxissomas estressados por ROS recrutam a ubiquitina E3 ligase Stub1 para permitir sua remoção por pexofagia.
