监测存根1介导的吞噬

过氧化物酶体进行β氧化，容易引起ROS损伤。这种方法可以研究细胞如何处理ROS应激的过氧化物酶体。该协议不仅用于全局靶向细胞群中的所有过氧化物酶体，还可以允许操纵单个细胞内的单个过氧化物酶体。

染料辅助ROS生成也可用于靶向过氧化物酶体外的细胞器，以探测细胞如何处理细胞器损伤。首先，在玻璃底35毫米培养皿上接种两次10至第五个人SHSY5Y细胞或六次10至第四只小鼠NIH H3T3细胞，在玻璃底35毫米培养皿上接种2次至50毫米，并带有20毫米直径的玻璃微孔。在 5% 的二氧化碳下在 37 摄氏度下培养细胞 24 小时。

接下来，使用转染试剂或SHSY5Y细胞转染用所需质粒转染细胞。在 55 μL 无血清 DMEM/F-12 中稀释质粒，在 55 μL 无血清 DMEM/F-12 中稀释 1 μL 转染试剂。将稀释的DNA与稀释的试剂相结合。

轻轻混合并在室温下孵育 30 分钟。将复合物添加到先前接种有100微升含有不含抗生素的SHSY5Y细胞的培养基的20毫米微孔中。轻轻地来回摇晃盘子。

如前所述进行NIH 3T3细胞转染，但用还原血清培养基代替无血清DMEM/F-12作为质粒稀释和转染试剂。转染两小时后，取出含转染试剂的培养基，加入一毫升新鲜培养基。将NIH 3T3或SHSY5Y细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。

对于光活化ROS生产，在转染后24小时取出培养基，并将10微升200纳摩尔HaloTag TMR配体或200纳摩尔Janelia Fluor 646 HaloTag配体加入20毫米玻璃微孔中。将培养皿转移到 37 摄氏度和 5% 二氧化碳培养箱中，放置一小时以染色细胞。一小时后，彻底除去染色培养基并加入一毫升新鲜培养基。

将含有所需细胞的玻璃底培养皿放在配备有载物台顶部培养箱的激光扫描共聚焦显微镜上。在软件中，单击工具窗口，选择目镜，然后单击DIA按钮打开透射光。通过显微镜目镜观察培养皿，并通过转动聚焦旋钮使细胞聚焦。

选择 LSM，然后单击染料检测器选择按钮。在弹出窗口中双击所需的染料，选择适当的激光和滤光片设置来对细胞进行成像。单击Live面板中的Live4x以启动快速激光扫描，以开始筛选细胞的荧光信号。

使用操纵杆控制器移动载物台，找到表达培养基的diKillerRed VKSKL或SLP-VKSKL细胞，以在过氧化物酶体上施加ROS应力。获取所需细胞的图像。单击"工具窗口"，然后选择"LSM 刺激"。

然后单击椭圆按钮，在"实时图像"窗口中使用鼠标绘制直径为15微米的ROI，其中包含将施加ROS应力的所需过氧化物酶体。要施加ROS应力，对具有diKillerRed VKSKL或TMR标记的SLP配体的细胞使用561纳米，对用Janelia Fluor 646标记的SLP配体染色的细胞使用640纳米。选择用于施加 ROS 应力的激光波长。

输入所需的激光百分比和持续时间。对于过氧化物酶体中的ROS产生，请单击"获取"，然后单击"刺激"按钮，以启动561或640纳米光通过ROI扫描，每次扫描30秒。这种刺激对应于561和640纳米的大约5%激光功率设置。

激光照射30秒后，ROI内的过氧化物酶体会失去其diKillerRed VKSKL，TMR或Janelia Fluor 646信号。这种信号损失允许区分细胞内的发光和非发光过氧化物酶体。为了监测噬菌活细胞，通过使用帧之间的 10 分钟间隔进行延时成像，跟踪 EGFP 标记的 Stub1、Hsp70、泛素、p62 或 LC3B 易位到发光或 ROS 应激过氧化物酶体上。

聚焦照明导致单个过氧化物酶体内瞬时和局部ROS产生，如荧光报告基因roGFP2-VKSKL所示。diKillerRed VKSKL图像是在进行所有roGFP2-VKSKL测量后拍摄的，以指示受损的过氧化物酶体的位置。数据还表明，未发光的过氧化物酶体不受影响，表明该方法的精确性。

该方法用于监测Stub1介导的噬菌。在此过程中，Hsp70，Stub1，泛素化蛋白，自噬适配器p62和LC3B随后出现在ROS应激的过氧化物酶体中以驱动pexophagy。使用相同的策略，可以同时破坏培养皿上的所有过氧化物酶体，以对Stub1介导的pexophagy进行生化表征。

在LED照明之前，EGFP-泛素荧光在细胞质中是均匀的，并且不与过氧化物酶体共定位。经过九小时的LED照明后，EGFP-泛素信号积累到共聚焦培养皿中生长的细胞中的所有过氧化物酶体上。使用该协议，我们发现ROS应激的过氧化物酶体通过泛素依赖性降解途径被去除。

ROS应激的过氧化物酶体招募泛素E3连接酶Stub1以允许它们通过pexophatic去除。