تقوم البيروكسيسومات بأكسدة بيتا وهي عرضة لتلف أنواع الأكسجين التفاعلية. تسمح هذه الطريقة بالتحقيق في كيفية تعامل الخلايا مع البيروكسيسومات المجهدة ب ROS. لا يستخدم هذا البروتوكول فقط لاستهداف جميع البيروكسيسومات عالميا داخل مجموعة الخلايا ولكن يمكن أن يسمح أيضا بمعالجة البيروكسيسومات الفردية داخل الخلايا المفردة.
يمكن أيضا استخدام توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة لاستهداف العضيات خارج البيروكسيسومات لاستكشاف كيفية تعامل الخلايا مع إصابات العضيات. للبدء ، قم بزرع مرتين في 10 إلى خلايا SHSY5Y البشرية الخامسة أو ستة في 10 إلى خلايا NIH H3T3 للفأر الرابع في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع على أطباق استزراع ذات قاع زجاجي 35 ملم مع ميكروويل زجاجي قطره 20 ملم. تنمو الخلايا تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا بالبلازميدات المرغوبة باستخدام كاشف النقل أو نقل الخلايا SHSY5Y. تمييع البلازميدات في 55 ميكرولتر من DMEM / F-12 الخالي من المصل وتخفيف ميكرولتر واحد من كاشف النقل في 55 ميكرولتر من DMEM / F-12 الخالي من المصل. الجمع بين الحمض النووي المخفف مع الكاشف المخفف.
تخلط بلطف وتحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف المركب إلى البئر الصغير 20 ملم المطلي مسبقا ب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على خلايا SHSY5Y بدون مضادات حيوية. هز الطبق برفق ذهابا وإيابا.
قم بإجراء نقل خلايا NIH 3T3 كما هو موضح من قبل ولكن استبدل وسط المصل المخفض بدلا من DMEM / F-12 الخالي من المصل لتخفيف البلازميد وكاشف النقل. بعد ساعتين من النقل ، قم بإزالة الوسط المحتوي على كاشف النقل وأضف ملليلتر واحد من وسط الاستزراع الطازج. احتضان خلايا NIH 3T3 أو SHSY5Y عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء ، في غضون 24 ساعة بعد النقل ، قم بإزالة وسط الاستزراع وإضافة 10 ميكرولتر من 200 نانومولار HaloTag TMR ligand أو 200 نانومولار Janelia Fluor 646 HaloTag ligand على البئر الصغير الزجاجي 20 ملم. انقل الطبق إلى حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون واتركه لمدة ساعة واحدة لتلطيخ الخلايا. بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة وسط التلوين جيدا وأضف ملليلتر واحد من وسط الثقافة الطازجة.
ضع طبقا ذو قاع زجاجي يحتوي على الخلايا المطلوبة على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مزود بحاضنة على سطح المسرح. في البرنامج ، انقر فوق نافذة الأداة ، واختر Optical ، وانقر فوق الزر DIA لتشغيل الضوء المرسل. اعرض الطبق من خلال عدسة المجهر واجعل الخلايا في بؤرة التركيز عن طريق تدوير مقبض التركيز.
اختر LSM وانقر على زر تحديد كاشف الصبغة. انقر نقرا مزدوجا فوق الأصباغ المطلوبة في النافذة المنبثقة لتحديد إعدادات الليزر والمرشح المناسبة لتصوير الخلايا. انقر فوق Live4x في اللوحة الحية لبدء المسح السريع بالليزر لبدء فحص إشارات الفلورسنت للخلايا.
حرك المرحلة باستخدام وحدة التحكم في عصا التحكم وحدد موقع الخلايا المتوسطة التي تعبر عن diKillerRed VKSKL أو SLP-VKSKL لتطبيق ضغط ROS على البيروكسيسومات. الحصول على صورة للخلية المطلوبة. انقر فوق نافذة الأداة واختر تحفيز LSM.
ثم انقر فوق الزر الناقص وفي نافذة Live Image ، استخدم الماوس لرسم عائد استثمار يبلغ قطره 15 ميكرومتر يحتوي على البيروكسيسومات المرغوبة التي سيتم تطبيق ضغط ROS عليها. لتطبيق إجهاد ROS ، استخدم 561 نانومتر للخلايا التي تحتوي على ليجند SLP المسمى diKillerRed VKSKL أو TMR واستخدم 640 نانومتر للخلايا الملطخة ب Janelia Fluor 646 المسمى SLP ligand. حدد الطول الموجي لليزر لتطبيق إجهاد ROS.
أدخل نسبة الليزر المطلوبة والمدة. لإنتاج ROS في البيروكسيسومات ، انقر فوق اكتساب ثم زر التحفيز لبدء المسح باستخدام 561 أو 640 نانومتر من الضوء من خلال عائد الاستثمار لمدة 30 ثانية لكل منهما. يتوافق هذا التحفيز مع ما يقرب من 5٪ من إعدادات طاقة الليزر ل 561 و 640 نانومتر.
بعد 30 ثانية من إضاءة الليزر ، تفقد البيروكسيسومات داخل عائد الاستثمار إشارات diKillerRed VKSKL أو TMR أو Janelia Fluor 646. يسمح فقدان الإشارة هذا بتمييز البيروكسيسومات المضيئة وغير المضيئة داخل الخلية. لمراقبة الخلايا الحية للفيح، اتبع نقل Stub1 أو Hsp70 أو يوبيكويتين أو p62 أو LC3B الموسومات الموسومة ب EGFP إلى البيروكسيسومات المضيئة أو المجهدة ب ROS عن طريق التصوير بفاصل زمني باستخدام فواصل زمنية مدتها 10 دقائق بين الإطارات.
تؤدي الإضاءة البؤرية إلى إنتاج ROS فوري وموضعي داخل البيروكسيسومات الفردية كما هو موضح من قبل مراسل الفلورسنت roGFP2-VKSKL. تم التقاط صورة diKillerRed VKSKL بعد إجراء جميع قياسات roGFP2-VKSKL للإشارة إلى موقع البيروكسيسومات التالفة. تظهر البيانات أيضا أن البيروكسيسومات غير المضيئة لا تتأثر ، مما يشير إلى دقة المنهجية.
تم استخدام هذه المنهجية لمراقبة pexophagy بوساطة Stub1. خلال هذه العملية ، يظهر Hsp70 و Stub1 والبروتينات المنتشرة في كل مكان ومحولات الالتهام الذاتي p62 و LC3B لاحقا في البيروكسيسومات المجهدة ب ROS لدفع pexophagy. باستخدام نفس الاستراتيجية ، كان من الممكن إتلاف جميع البيروكسيسومات في وقت واحد على طبق الاستزراع للتوصيف الكيميائي الحيوي ل pexophagy بوساطة Stub1.
قبل إضاءة LED ، كان مضان EGFP-ubiquitin متجانسا في السيتوبلازم ولم يتزامن مع البيروكسيسومات. بعد تسع ساعات من إضاءة LED ، تراكمت إشارات EGFP-ubiquitin على جميع البيروكسيسومات في الخلايا المزروعة في طبق متحد البؤر. باستخدام هذا البروتوكول ، وجدنا أن البيروكسيسومات المجهدة ب ROS تتم إزالتها من خلال مسار تحلل يعتمد على يوبيكوتين.
تقوم البيروكسيسومات المجهدة ب ROS بتجنيد يوبيكويتين E3 ligase Stub1 للسماح بإزالتها عن طريق pexophagy.
