Name: analysis of autophagy in penicillium chrysogenum by using starvation pads in combination with fluorescence microscopy
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy at JoVE.com

CQS receives a fellowship from the LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). The author would like to thank Ida J. van der Klei for the P. chrysogenum strains used in this work and Andreas S. Reichert for the gift of rapamycin.

1. Preparação de P. chrysogenum para os experimentos de fome <ol><li> Se o P. chrysogenum estirpe de juros é mantida em arroz (&#39;arroz verde &quot;), coloque 2-3 grãos de arroz cobertos com esporulação micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Preenchê-lo com 500 ul YGG (10 g / l de KCl, 20 g / l de glucose, 10 g / l de base azotada de levedura, 5 g / l de K 2 HPO 4, 20 g / l de extracto de levedura). <ol><li> Vortex o tubo durante 30 segundos de modo a que os esporos podem separar de forma eficiente o arroz. </li><li> Incubar o tubo durante 1 dia a temperatura ambiente (por exemplo, entre 20 e 25 ° C). </li><li> Preparar uma diluição dessa suspensão de esporos na água da torneira estéril 1/50, misture bem. </li></ol></li><li> Se o P. chrysogenum estirpe de interesse é mantida numa placa de agar (por exemplo, YGG placa de agar), transferir pequenos pedaços de micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 400 ul de água de torneira esterilizada e cerca de 100 mg glgrânulos burro usando um palito estéril ou ponteira. <ol><li> Vortex o tubo durante 2 minutos de modo que se torna o micélio fragmentado. Utilizar o conteúdo do tubo imediatamente. </li></ol></li></ol> 2. Passos preparatórios para o cultivo de P. chrysogenum em Pads de fome <ol><li> Ligue a placa de aquecimento e configurá-lo para cerca de 60 ° C. </li><li> Dissolve-se 2 g de agarose em 100 ml de água da torneira por cozimento a solução num forno de microondas. Tome cuidado para que esta solução é completamente claro após o aquecimento. Se não for, cozinhá-lo novamente até que a agarose é dissolvido completamente. Deixar a solução arrefecer de agarose a cerca de 60 ° C antes da utilização. </li><li> Encher tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (2-4, dependendo o número de amostras) com 400 ul de água estéril (sem toque em cada um adicionados compostos adicionais) ou 400 ul-x (x adição de uL de solução do composto no passo 2.5) e colocá-los sobre a placa de aquecimento durante pelo menos 1 minuto, de modo que o water dentro fica quente. </li><li> Colocar as lâminas de microscópio que contêm uma cavidade central sobre a placa de aquecimento durante pelo menos 1 min. </li><li> Adicionar 400 ul de 2% de agarose para a solução nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e vortex brevemente. Após este passo, se desejado, adicionar compostos adicionais (ou seja, 1 uM de rapamicina). Se isso for feito, vortex brevemente depois de cada substância adicional é pipetado para o tubo. Colocar os tubos de volta para a mesa de aquecimento para evitar a solidificação prematura. NOTA: O volume total no tubo de microcentrífuga deverá ser de 800 uL. </li></ol> 3. Preparação de microscópicas Contendo Inanição Pads <ol><li> Pipetar 140 uL da solução de agarose para dentro da cavidade da lâmina de microscópio (ainda que está localizado na placa de aquecimento). Tente evitar fazer bolhas, se possível. </li><li> Imediatamente coloque uma lamela para a solução de agarose. NOTA: Este vai resultar em uma superfície plana. </li><li> Coloque o microâmbito deslizante na bancada do laboratório para aproximadamente 4 min para permitir a almofada de agarose para solidificar. </li><li> Remova cuidadosamente a lamela do pad agarose, deslizando-a com a ajuda de um polegar ou o dedo indicador (usar luvas para evitar a contaminação!). </li><li> Coloque a lâmina de microscópio com a almofada em uma câmara úmida para evitar a dessecação. Recomendação: Use uma caixa de ponta vazia que ainda tem o insert para manter as pontas de pipeta. Adicionar água estéril para a caixa de modo que o fundo é coberta. Coloque as lâminas de microscópio para a inserção e fechar a caixa. </li></ol> 4. inoculação da inanição Pads com P. chrysogenum e incubação <ol><li> Pipetar 5 ul de uma diluição 1/50 de esporos (se as culturas foram cultivadas em arroz) ou 5 ul da solução não diluída contendo fragmentos de micélio (se as culturas foram cultivadas numa placa de agar) para o centro da almofada de inanição. </li><li> Feche a câmara úmida e envolvê-la em um saco plástico (isso serve comoproteção adicional contra a dessecação das almofadas de fome). Tenha cuidado para não mover a caixa muito, porque de outra forma as gotas de inoculação será perturbado. </li><li> Armazenar a caixa embrulhada à temperatura ambiente durante pelo menos 20 h, antes de analisar as amostras. </li></ol> 5. microscópica análise das amostras <ol><li> Após 20 horas de incubação, as amostras estão prontas para análise microscópica; colocar a lâmina de microscópio em papel tecido seco (o fundo tende a ficar molhado). </li><li> Pipetar um pequeno volume de água (cerca de 50 mL) para a almofada de inanição. Coloque uma lamela sobre o bloco e esprema a água excedente. Retire o excesso de água com um lenço de papel. </li><li> Colocar a lâmina do microscópio sobre a mesa de observação de um microscópio de fluorescência. Para obter uma visão geral de crescimento micelial, use um objetivo 20X. Uso objectivos 63x ou 100x para estudar a localização de GFP nas hifas. A fim de evitar a dessecação progressiva da amostra não analisar as amostras durantemais de 15 min antes de colocá-los de volta para a câmara úmida. </li><li> Repita 5,3 em intervalos regulares (por exemplo, depois de 40 horas e 60 horas de crescimento). NOTA: A amostra pode ser colocado de volta na câmara úmida. Não é necessário retirar as lamelas uma vez que não afecta o crescimento do micélio. </li></ol>

<ol>
	<li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control:+an+integrated+network+of+pathways.">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li><li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+filamentous+fungi.">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li><li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina:+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing.">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Iraqui, I., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina+target+of+rapamycin.">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li><li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae.">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Balguerie, A., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants.">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li><li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus.">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li><li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum.">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li><li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum.">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li><li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding,+improving+and+using+green+fluorescent+proteins.">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li><li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+regulation+of+autophagy.">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li><li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro.">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, S110-S119 (2009).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

O método aqui apresentado permite o estudo conveniente e reprodutível de autofagia em P. chrysogenum. Por exemplo, ele pode ser usado para o rastreio de a eficácia de vários compostos se eles são capazes de modular a resposta autofagia deste fungo ou não. Os resultados obtidos com rapamicina demonstram que a inibição da sinalização de TOR conduz a uma indução de autofagia pronunciada em P. chrysogenum que foi também demonstrada para outros organismos 11. É possível utilizar micélios cultivados em almofadas de fome para análise em microscópio mais sofisticados (por exemplo, microscópios confocais laser scanning). Não importa se a amostra é colocada abaixo do objetivo de acima do objetivo (microscópio invertido). Várias proteínas fluorescentes orientados para certos compartimentos pode ser utilizado para monitorizar o destino das diferentes organelas durante autofagia (por exemplo, as mitocôndrias -&gt; mitophagy; r endoplasmáticoeticulum -&gt; ER-phagy, etc).. Em resumo, a técnica aqui descrita estende o espectro de métodos para estudar microscopicamente fungos 12. O protocolo é geralmente simples e fácil de usar. No entanto, é muito importante que as almofadas de fome nunca desidratar como isto irá resultar em artefactos e morte celular. Por conseguinte, é fortemente sugerido que (i) as lâminas de microscópio que contêm a solução de agarose ainda líquido são removidos imediatamente a placa de aquecimento (passo 3.3), (ii) que a lâmina de cobertura para a tomada de uma superfície plana é removida da almofada depois de um jejum máximo de 5 min (os passos 3.3 e 3.4), (iii) que a lâmina do microscópio é sempre mantido na câmara húmida quando não analisado (passos 3.5 e 5.4) e (iv) que a análise microscópica não leva mais do que 15 minutos (etapa 5.3). Outro aspecto importante é que o montante inicial de esporos ou fragmentos de micélio pipetados sobre a almofada de fome não deve ser muito alto oumuito baixo. Isto pode ser facilmente controlada por diluição do stock usando água da torneira esterilizada. A diluição 1/50 descrito em 1.1.3 funciona bem para P. chrysogenum suspensões de esporos. É a diluição recomendada para uso com nossos fungos, mas pode exigir alguns ajustes. Uma limitação deste método é que não é aconselhável para experiências de imagiologia de lapso de tempo para mais de 15 min. Isto é devido à dessecação progressiva da almofada de fome, uma vez que é removido da câmara húmida. Se forem necessários tempos de observação mais longos, é possível adicionar pequenas quantidades de água de torneira esterilizada à margem da almofada fome embora isso não impede que alguns dessecação em regiões centrais da pad. Outra limitação é que o método não é estritamente quantitativo. Em organismos unicelulares é possível marcar eventos por célula (por exemplo, a quantidade de células contendo GFP no vacúolo). Em contraste, P. chrysogenum como fungos filamentosos é characterizados por uma arquitetura multicelular. As células são divididas por septos que contêm uma poro central que permite a passagem de citoplasma e organelas. Portanto amostras podem ser analisadas apenas &#39;semi quantitativamente &quot;(por exemplo, número de hifas contendo GFP localizada vacúolos). Para alcançar significância é muito importante que o número de hifas analisado é suficientemente elevada (pelo menos 80 por ponto de tempo e as condições testadas, mas é definitivamente mais preferível). A utilização de almofadas de fome para estudar autofagia podem ser facilmente adaptados para utilização noutros fungos filamentosos. Portanto, o protocolo apresentado aqui não se limita apenas a P. chrysogenum. Também deve ser possível adaptá-lo para com unicelular fungos, ou seja, leveduras. Transferência do protocolo para organismos superiores (por exemplo, nemátodos) provavelmente requer adaptações mais especializadas. Será interessante verificar se o método descrito no presente trabalho também encontraa sua utilização em outros campos.

Os fungos filamentosos são excelentes sistemas de modelo para o estudo dos processos de desenvolvimento. Eles oferecem vários benefícios experimentais como cultivo barato, um elevado número de descendentes e acessibilidade genética. O último ponto é de particular relevância para a construção de transformantes que permite que se investigue a importância de genes tão longe descaracterizados para vários mecanismos celulares. Os fungos filamentosos têm sido fundamentais para a elucidação de vários elementos e mecanismos de controlo de qualidade das vias celulares, como a actividade de protease para a degradação de proteínas anormais, dinâmica mitocondrial para manter a integridade mitocondrial e autofagia para a remoção de excesso e / ou componentes celulares e para a manutenção disfuncionais viabilidade celular em tempos de fome 1,2,3. Existem várias técnicas experimentais disponíveis para o estudo da autofagia em fungos filamentosos 2: (i) a investigação das vacúolos if eles contêm corpos autophagic densos quando as proteases são inibidas por microscopia electrónica de transmissão 4, (ii) a visualização de autofagossomas por monitorização focos GFP-Atg8 através de microscopia de fluorescência de 5,6 e (iii) detecção de estruturas autophagosomal acidificadas utilizando o corante fluorescente monodansyl cadaverina 7. Aqui, um novo método para o crescimento de Penicillium chrysogenum para estudos autofagia é apresentado. O elemento principal é o &#39;pad fome &quot;, que consiste simplesmente de agarose a 1% dissolvido em água de torneira esterilizada. Compostos adicionais (por exemplo, factores de stress, sequestrantes, moduladores autofagia) pode ser adicionado à almofada, enquanto eles não exibem auto-fluorescência. A almofada está localizada em lâminas de microscópio que contêm uma cavidade central raso. Esta almofada em inoculados com uma suspensão de esporos ou com fragmentos de micélio pequenos. O último é aconselhável se a estirpe de interesse não sporulate eficiente (por exemplo, estirpes atg1 Δ 8). As lâminas estão posicionadas em câmaras húmidas (estes podem ser facilmente construídas usando caixas de ponta de pipeta vazios) para evitar a secagem da amostra e incubou-se à temperatura ambiente. P. chrysogenum é capaz de crescer durante alguns dias sob estas condições. Autophagy pode ser observada microscopicamente por alargamento vacuolar que é um marcador positivo para autofagia fúngica. Nesta contribuição, a P. chrysogenum estirpe (Wisconsin 54-1255) é usado, que forma a proteína verde fluorescente que é direcionado para peroxisomes pela sua sequência C-terminal &#39;SKL «9. Por conseguinte, é possível monitorizar a degradação dos peroxissomas. É possível rotular também outros compartimentos da célula (por exemplo, mitocôndrias) usando os sinais de localização adequados e analisar a sua degradação. Embora os dados de P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) é apresentado aqui, é certamente possívelpara usar o método de &#39;almofada de fome &quot;, também para outros fungos filamentosos (por exemplo, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, espécies de Aspergillus, etc.).

<table><tbody><tr><td>Microscope slides with central cavity</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>H884.1</td><td>These can be used multiple times after cleaning.</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>A553.1</td><td>Diameter: 0.25 - 0.50 mm</td></tr></tbody></table>

analysis of autophagy in penicillium chrysogenum by using starvation pads in combination with fluorescence microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Para demonstrar a utilidade do protocolo detalhado acima degradação de peroxissoma no P. chrysogenum estirpe Ws54-1255 (GFP-SKL) foi analisada. Nesta estirpe GFP-SKL é geralmente importada para peroxisomes 9. Isto resulta no aparecimento de múltiplas formas esféricas quando a amostra é analisada através de microscopia de fluorescência. Se ocorrer a autofagia, vacúolos ampliar. GFP-SKL é incorporado vacúolos por autofagia (pexophagy). Devido ao facto de que a GFP é resistente à degradação por proteases vacúolo rotula estes organelos 10. Por conseguinte, os dois parâmetros de observação autofagia (pexophagy) nesta estirpe, o alargamento vacúolo e localização de GFP-SKL de vacúolos, estão convenientemente monitorizada por microscopia de fluorescência. Ao longo de 20 h de incubação, a GFP nunca é observado em vacúolos (Figura 1). Além disso, o alargamento vacúolo não está ocorrendo. No entanto, a 40 h de crescimento marcado com GFP vacúolostornam-se visíveis em algumas das hifas, indicando autofagia (pexophagy) para se tornar ativo (Figura 1). Em 60 horas de crescimento da quantidade de vacúolos marcado com GFP aumentou ainda mais. Como controle negativo atg1 um mutante do P. Δ chrysogenum foi utilizada (Δ atg1 (GFP-SKL)) (Figura 2). Nem vacúolos alargada nem marcado com GFP pode ser observado na presente estirpe. Como controlo positivo, a rapamicina droga estimulante de autofagia é usado (Figura 3). Após 40 h de crescimento vacúolos marcado com GFP tornar-se visível. Em 60 horas, as hifas estão completamente preenchidos com grandes vacúolos contendo GFP (Figura 3). Este resultado indica que, como esperado, a autofagia maciça ocorre aqui. Coletivamente, estes resultados demonstram a validade do experimental set-up. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig1highres.jpg" /> <strong&gt; Figura 1:. Localização de GFP-SKL no Ws54-1255 (GFP-SKL) durante o cultivo em almofadas de fome Nos tempos indicados, as culturas cultivadas em almofadas de fome foram analisadas utilizando microscopia de fluorescência. Imagens representativas são mostrados para cada ponto de tempo. Correspondentes áreas de campo brilhantes são mostradas cada imagem canal de fluorescência abaixo. Branca &quot;v&quot;: GFP-SKL localizada vacúolos indicando degradação peroxisome. Barras de escala: 10 um. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Localização de GFP-SKL no Δ atg1 (GFP-SKL) durante o cultivo em almofadas de fome Nos tempos indicados, as culturas cultivadas em almofadas de fome foram analisadas utilizando microscopia de fluorescência. Imagens representativas são mostrados para cada ponto de tempo. Correspondente áreas de campo brilhantes são mostrados abaixo de cada fluorescênciaimagem do canal. Barras de escala: 10 um. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Localização de GFP-SKL no Ws54-1255 (GFP-SKL) tratados com rapamicina para a indução de autofagia nos tempos indicados culturas cultivadas em almofadas de fome suplementado com 1 fiM de rapamicina foram analisadas utilizando microscopia de fluorescência. Imagens representativas são mostrados para cada ponto de tempo. Correspondentes áreas de campo brilhantes são mostradas cada imagem canal de fluorescência abaixo. Branca &quot;v&quot;: GFP-SKL localizada vacúolos indicando degradação peroxisome. Barras de escala: 10 um.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Análise de Autophagy em<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por a inanição Pads em combinação com microscopia de fluorescência

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

8.5K visualizações.  Senckenberg Research Institute. A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Vídeo: Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Imunologia e Infecção

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Biologia

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Neurociência

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via the lysosome and are recycled. During autophagy, cytoplasmic LC3 protein is lipidated and recruited to the autophagosomal membranes. The autophagosome then fuses with the lysosome to form the autolysosome, where the breakdown of the autophagosome vesicle and its contents occurs. The ubiquitin-associated protein p62, which binds to LC3, is also used to monitor autophagic flux. Cells undergoing autophagy should demonstrate the co-localization of p62, LC3, and lysosomal markers. Immunofluorescence microscopy has been used to visually identify LC3 puncta, p62, and/or lysosomes on a per-cell basis. However, an objective and statistically rigorous assessment can be difficult to obtain. To overcome these problems, multispectral imaging flow cytometry was used along with an analytical feature that compares the bright detail images from three autophagy markers (LC3, p62 and lysosomal LAMP1) and quantifies their co-localization, in combination with LC3 spot counting to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Here, multispectral imaging flow cytometry with an analytical feature that compares bright detail images of 3 autophagy markers and quantifies their co-localization, along with LC3 spot counting, was used to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. The malfunction of autophagy is associated with aging and multiple human diseases. The autophagy machinery is highly conserved-from yeast to humans.&#160;The larval fat body of Drosophila melanogaster, an analog for vertebrate liver and adipose tissue, provides a unique model for monitoring autophagy in vivo. Autophagy can be easily induced by nutrient starvation in the larval fat body. Most autophagy-related genes are conserved in Drosophila. Many transgenic fly strains expressing tagged autophagy markers have been developed, which facilitates the monitoring of different steps in the autophagy process. The clonal analysis enables a close comparison of autophagy markers in cells with different genotypes in the same piece of tissue. The current protocol details procedures for (1) generating somatic clones in the larval fat body, (2) inducing autophagy via amino acid starvation, and (3) dissecting the larval fat body, aiming to create a model for analyzing differences in autophagy using an autophagosome marker (GFP-Atg8a) and clonal analysis.

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

The present protocol describes the induction of autophagy in the Drosophila melanogaster larval fat body via nutrient depletion and analyzes changes in autophagy using transgenic fly strains.

Análise da Autofagia Induzida pela Inanição no Corpo Gorduroso de Larvas de Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Análise de Autophagy em

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo