Este protocolo permite avaliar o mecanismo de enxerto de ilhotas no tecido adiposo branco. A principal vantagem deste método de transplante de ilhotas cobertas de gordura é que é tecnicamente fácil de replicar. O método pode ser aplicado a outros modelos de doenças.
Por exemplo, ele pode ser usado para criar um modelo de rato de câncer. Demonstrando o procedimento estará Naoaki Sakata, professor associado da Universidade de Fukuoka. Sob um microscópio de dissecação, use uma micropipeta P 200 para remover quaisquer componentes extras das ilhotas das digestão do pâncreas, incluindo tecidos acinares e fibrosos.
Em seguida, use um filtro de células para filtrar células acinares únicas. Transfira as ilhotas filtradas para uma nova placa de cultura contendo o meio de cultura apropriado ou solução tampão suplementada com soro bovino ou albumina, e gire o prato para posicionar as ilhotas no centro. Usando uma micropipeta P 200, escolha as ilhotas individuais em um tubo de coleta apropriado.
Coloque um novo filtro de células de 40 micrômetros em cima de um tubo de plástico de 50 mililitros. Use uma pipeta de 1000 microlitros para adicionar as ilhotas ao filtro para separar as ilhotas e as células acinares únicas. Use fórceps para inverter o filtro em um novo prato de cultura não tratado de 60 ou 100 mililitros contendo meio de cultura ou uma solução tampão apropriada, suplementada com soro bovino ou albumina.
Use meio fresco, ou tampão para lavar as ilhotas em um novo prato de cultura, em seguida, adicione meio ou tampão suficiente ao prato de cultura para atingir um volume total de aproximadamente 20 mililitros. Conte as ilhotas sob um microscópio e divida o número de ilhotas igualmente entre tubos de centrífuga de plástico individuais de 1,5 mililitro de acordo com o número de animais doadores. Centrifugar as ilhotas a 2, 100 G durante um minuto à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante.
Cerca de 20 a 30 microlitros de solução residual normalmente permanecerão no tubo. Depois de remover o cabelo do abdômen para evitar a infecção, coloque o rato em decúbito dorsal. Depois de desinfetar o abdômen e a região inguinal incidem a pele na área mediana inferior, criando uma incisão na pele com aproximadamente dois centímetros de comprimento.
Campe a parede abdominal esquerda com pinça ou afastadores e puxe o tecido para o lado esquerdo do rato para fixar o campo cirúrgico. Use um cotonete para mobilizar o intestino delgado e grosso para o lado direito do rato. O tecido adiposo branco epidérmico esquerdo na cavidade abdominal está localizado na área inguinal esquerda.
Mobilize o tecido adiposo branco epidérmico e o testículo esquerdo para o exterior do abdómen e estique o tecido. Use uma micropipeta P 200 para coletar todo o volume de ilhotas de um tubo de 1,5 mililitro, tomando cuidado para que nenhuma ilhota seja deixada no tubo após a coleta. Permita que as ilhotas coletadas se depositem na ponta da pipeta por gravidade.
Coloque a ponta da micropipeta levemente sobre o tecido adiposo distendido, tomando cuidado para evitar a lavagem excessiva do meio ou tampão na ponta. Semeia cuidadosamente as ilhotas no tecido. Após a semeadura, confirme a colocação correta das ilhotas sob um microscópio de dissecação.
Cubra as ilhotas com o tecido adiposo branco epidérmico, em seguida, coloque o testículo esquerdo sob o tecido adiposo branco episómico e devolva os tecidos à cavidade intraperitoneal. Feche a pele em duas camadas usando uma sutura 4-o. Quando terminar, coloque o mouse sob uma lâmpada de calor e monitore-o até a recuperação completa.
Para comparar a eficácia do transplante de ilhotas cobertas de gordura com a do transplante de ilhotas intraperitoneais, o mesmo número de ilhotas foi implantado no peritônio no espaço paracólico esquerdo dos animais diabéticos receptores de controle. Observou-se que os níveis de glicose no sangue de camundongos com transplante de ilhotas cobertas de gordura diminuem gradualmente e significativamente em comparação com camundongos transplantados de ilhotas intraperitoneais. O teste intraperitoneal de tolerância à glicose foi realizado um mês após o transplante.
A glicemia em camundongos com transplante de ilhotas cobertas de gordura foi mantida em níveis mais baixos do que os observados em camundongos transplantados de ilhotas intraperitoneais. O exame histológico foi utilizado para avaliar o enxerto de ilhotas no tecido adiposo branco epidérmico. Em animais receptores de transplante de ilhotas cobertas de gordura, a coloração de hematoxilina eoceno revelou a presença de ilhotas dentro do tecido adiposo branco epidérmico.
Além disso, a coloração por anticorpos conjugados por fluorescência de ilhotas de insulina positiva facilitou a detecção de microvasos positivos para o fator de von Willebrand dentro do tecido adiposo branco epidérmico de todos os camundongos receptores. Para ter sucesso com este procedimento, certifique-se de permitir que as ilhotas se estabeleçam completamente na ponta da pipeta e semeie-as no tecido adiposo sem derramar.
