Данный протокол дает возможность оценить механизм приживления островков в белую жировую ткань. Основным преимуществом этого метода трансплантации островков, покрытых жиром, является то, что его технически легко воспроизвести. Метод может быть применен к другим моделям заболеваний.
Например, его можно использовать для создания мышиной модели рака. Продемонстрировать процедуру будет Наоаки Саката, доцент Университета Фукуоки. Под рассекающим микроскопом используйте микропипетку P 200 для удаления любых дополнительных островковых компонентов из пищеварения поджелудочной железы, включая ацинарные и фиброзные ткани.
Затем используйте клеточное ситечко, чтобы отфильтровать отдельные ацинарные клетки. Переложите отфильтрованные островки в новую культуральную чашку, содержащую соответствующую культуральную среду или буферный раствор, дополненный бычьей сывороткой или альбумином, и закрутите блюдо, чтобы расположить островки в центре. Используя микропипетку P 200, подберите отдельные островки в соответствующую коллекционную трубку.
Поместите новый 40-микрометровый клеточный сетчатый фильтр поверх пластиковой трубки объемом 50 миллилитров. Используйте пипетку на 1000 микролитров, чтобы добавить островки в ситечко, чтобы отделить островки и одиночные ацинарные клетки. Используйте щипцы для инвертирования ситечка на новой необработанной чашке размером 60 или 100 миллилитров, содержащей культуральную среду или соответствующий буферный раствор, дополненный бычьей сывороткой или альбумином.
Используйте свежую среду или буфер для промывки островков в новую чашку для культивирования, затем добавьте достаточно среды или буфера в чашку для культивирования, чтобы достичь общего объема примерно 20 миллилитров. Подсчитайте островки под микроскопом и разделите количество островков поровну между отдельными 1,5-миллилитровыми пластиковыми центрифужными трубками в соответствии с количеством животных-доноров. Центрифугируйте островки при 2, 100 г в течение одной минуты при комнатной температуре и выбросьте супернатант.
Около 20-30 микролитров остаточного раствора обычно остаются в трубке. После удаления волос с живота для предотвращения инфекции поместите мышь в лежачее положение. После дезинфекции живота и паховой области разрезают кожу в нижней средней области, создавая разрез кожи длиной примерно два сантиметра.
Зажмите левую брюшную стенку щипцами или втягивающими устройствами и потяните ткань на левую сторону мыши, чтобы закрепить операционное поле. Используйте ватный тампон для мобилизации тонкой и толстой кишки в правую сторону мыши. Левая белая жировая ткань эпидермиса в брюшной полости расположена в левой паховой области.
Мобилизуйте белую жировую ткань эпидермиса и левое яичко наружу брюшной полости и растяните ткань. Используйте микропипетку P 200, чтобы собрать весь объем островков из одной 1,5-миллилитровой трубки, заботясь о том, чтобы в трубке не осталось островков при сборе. Дайте собранным островкам осесть в кончике пипетки под действием силы тяжести.
Поместите наконечник микропипетки слегка на растянутую жировую ткань, заботясь о том, чтобы предотвратить чрезмерное промывание среды или буфера в наконечнике. Осторожно засейте островки на ткань. После посева подтвердите правильное размещение островков под рассекающим микроскопом.
Накройте островки белой жировой тканью эпидермиса, затем поместите левое яичко под эписомальную белую жировую ткань и верните ткани во внутрибрюшинную полость. Закройте кожу в два слоя с помощью шва 4-o. Когда закончите, поместите мышь под нагревательную лампу и следите за ней до полного восстановления.
Чтобы сравнить эффективность трансплантации покрытых жиром островков с таковой после внутрибрюшинной трансплантации островков, такое же количество островков было имплантировано в брюшину в левом параколическом пространстве контрольных животных-реципиентов с диабетом. Уровень глюкозы в крови мышей с трансплантацией островков, покрытых жиром, постепенно и значительно снижался по сравнению с мышами, трансплантированными внутрибрюшинными островками. Внутрибрюшинное тестирование толерантности к глюкозе проводилось через месяц после трансплантации.
Уровень глюкозы в крови у мышей с трансплантацией островков, покрытых жиром, поддерживался на более низких уровнях, чем у мышей, перенесших внутрибрюшинную трансплантацию островков. Гистологическое исследование использовалось для оценки приживления островков в белую жировую ткань эпидермиса. У животных-реципиентов трансплантата, покрытых жиром, окрашивание эоцена гематоксилином выявило наличие островков в белой жировой ткани эпидермиса.
Кроме того, флуоресцентное конъюгированное окрашивание антител инсулин-положительных островков способствовало обнаружению положительных микрососудов с фактором фон Виллебранда в эпидермальной белой жировой ткани всех мышей-реципиентов. Чтобы преуспеть в этой процедуре, убедитесь, что островки полностью оседают на кончике пипетки и засеивают их на жировую ткань, не проливая.
