Este protocolo oferece uma lesão precisa e cirurgicamente controlada para induzir uma transeção completa da medula espinhal em camundongos com alta reprodutibilidade e taxas de sobrevivência muito altas. O uso de uma broca fina para a lesão óssea minimiza os danos ao tecido circundante, permitindo que as respostas de lesão e tratamento sejam modeladas com mais precisão. Para realizar uma laminectomia, depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um camundongo c57 preto c57 de 8 a 10 semanas de idade, raspe a pele traseira para expor a área cirúrgica sobre a coluna dorsal e estérilize a área raspada com cotonetes de algodão estéreis embebidos em líquido antiséptico de iodo povidona e espírito cirúrgico.
Usando um bisturi, faça uma incisão vertical midline no nível vertebral T10 e use fórceps retos para levantar a pele da fáscia subjacente para facilitar a colocação do retratedor. Para expor as espinhas das vértebras T9 através das vértebras T11, use a borda cega do bisturi para fazer uma pequena incisão midline no tecido subcutâneo e fáscia subjacente e use fórceps finos não afiados para dissecar e refletir a fáscia. Para expor o laminado, use a ponta cega do bisturi para dividir o tronco dorsal e os músculos paraspinos ao longo das espinhas das vértebras T9 através das vértebras T11 e use as fórceps de ponta fina sem corte para dissecar os músculos em camadas para expor a lâmina das vértebras.
Use os mesmos fórceps para fazer pequenos bolsões ao redor dos processos transversais da vértebra T10 e enganchar os pinos dos fórceps curvos sob os processos transversais dentro dos bolsos criados para estabilizar o corpo vertebral T10. Enxágue completamente a laminae T10 com soro fisiológico quente e use cotonetes de algodão para limpar suavemente a superfície óssea, tomando cuidado para que nenhum acessório muscular ou ligamentar permaneça ao longo da superfície bilateral. Para quebrar o laminado bilateralmente, use uma ponta de broca de 0,55 milímetros de comprimento e sete milímetros para traçar um caminho vertical do espaço intervertebral T9/T10 até o espaço intervertebral T10/T11 ao longo de ambos os laminados T10 com a broca desligada.
Quando o caminho tiver sido traçado, ligue a broca e faça lentamente e cuidadosamente uma trincheira vertical na lâmina direita da vértebra T10, usando os fórceps curvos para manter a vértebra estável. Depois de repetir o processo no lado esquerdo da lâmina, irrigar o tecido com soro fisiológico quente para lavar todos os fragmentos ósseos restantes. Manter um bom aperto na coluna com uma mão é essencial para esta etapa.
Também é importante ficar confortável e confiante com o uso da broca. Em seguida, use os fórceps finos angulares para segurar o processo espinhoso e remova todo o segmento dorsal do laminado separado pela perfuração bilateral. Em seguida, irrigar e cotonete conforme necessário para permitir uma visualização clara da medula espinhal dentro da janela laminectomia.
Para induzir a lesão medular dentro da medula exposta, use uma lâmina estreita e redonda de corte para cortar o cordão no centro da janela de laminectomia, tomando o cuidado de varrer os recessos laterais da coluna vertebral para induzir uma lesão completa de transeção. Para confirmar a completude da lesão transection, use os fórceps de ponta finas para remover quaisquer conexões restantes no local da transeção. Uma vez que a hemostasia tenha sido alcançada no local da transeção, libere o aperto do força curva na vértebra T10 e una as bordas dos músculos dissecados ao longo da linha média para obter uma boa posição.
Utilizando 5/0 poliglactina 910 suturas absorvíveis, sutura os músculos em camadas, certificando-se de que a curvatura natural da coluna vertebral não causa qualquer tensão na linha de sutura ou abra as suturas. Em seguida, use suturas de seda não absorvíveis 5/0 para fechar o tecido subcutâneo e a pele, tomando cuidado para que não haja sangramento, coágulos ou detritos remanescentes sob a pele antes do fechamento. Para avaliar se este método para induzir lesão medular tipo transecção em camundongos é reprodutível e consistente, a medula espinhal ferida pode ser analisada por imunohistoquímica e testes comportamentais podem ser realizados nos camundongos.
A imuno-rotulagem contra o marcador de astrócito, proteína ácida fibrilar gliana, facilita a demarcação do limite da medula espinhal intacta. Nesta seção longitudinal, o local da lesão localizado pode ser visualizado entre os tocos do cabo como esperado. Um defeito de tamanho consistente pode ser induzido no local da transeção com uma distância mínima média de 550,4, mais ou menos 17,3 micrômetros.
Dados comportamentais que implantam a Escala do Rato Basso de um teste de campo aberto mostram que os ratos feridos não apresentam nenhum movimento de membro traseiro após a lesão. Assim, o protocolo produz uma lesão completa e confiável do tipo transeção que resulta em uma perda completa da função abaixo do nível de lesão que não leva à reversão espontânea da paralisia. Tome cuidado para perfurar em linha reta com uma mão estável, porque pode ser muito complicado reparar a janela de laminectomia uma vez que tenha sido perfurada incorretamente.
Após a indução da lesão medular, várias opções de tratamento podem ser aplicadas, incluindo o parto de medicamentos e transplante de células para identificar terapias potenciais que melhoram a recuperação da lesão medular.
